Sanger测序流程

1、Sanger测序一、原理Sanger法测序是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。    ABI 3730XL测序仪是高质量的长片

2、段读取和序列分析的测序平台，应用灵活而广泛，可同时分析96个样品。该仪器采用4色荧光同时检测，可不间断24小时运行，自动灌胶，上样，电泳分离，检测及数据分析。二、技术路线三、操作流程1、DNA的提取一般采用试剂盒提取（参考试剂盒提供的protocol）。2、PCR扩增与电泳 配置PCR体系（25ul体系）DNA浓度大于30ng/ul（DNA浓度需要测定）: 试剂名称用量H2O15.2l10*PCR buffer2.5l2.5Mm dNTPs3lprimer（前后引物各1ul）2lLA Taq酶0.3lDNA模板2l注意: 对于CEBPA和NOTCH1此类GC含量高的将10*PCR buffer

3、 2.5ul换为2*GC buffer 12.5ul, H2O 为5.2ul。每次96孔板加样后都必须贴封口膜，离心混匀（2000g 1min）, 防止挂壁。EP管与96孔板等都为商品型一次性产品, 注意标记板号, 样本号和引物号。 设置PCR反应程序一般程序：96预变性2min, 96 30s, 57 30s, 72 2min, 35cycles; 72延伸5min; 4/15。CEBPA和NOTCH1程序：96预变性5min, 95 40s, 64/66 40s, 72 1min, 35cycles; 72延伸5min; 4/15。 琼脂糖凝胶电泳配置1.5%（60ml 0.9g, 大胶板

4、150ml 2.25g）的琼脂糖凝胶, 再分别取2ul loading buffer与4ul DNA扩增产物混合后进行电泳, 160V 35min。3、PCR产物纯化 配制消化液TaKaRa Alkaline Phosphatase 虾碱酶0.5lTaKaRa Exonuclease I 外切酶0.5l配置消化液, 分别取虾碱酶与外切酶1:1混合。PCR产物离心后，每个孔中加入1l以上消化液到PCR反应液中。 纯化反应：上PCR仪进行程序反应。程序为SAP: 37 60min, 80 15min, 4/15。4、测序反应 SEQ MIX配置试剂：ABI PRISM® BigDye&#

5、174; Terminator v3.1 cycle Sequencing Kit根据PCR反应的数量按照下表配制MIX：试剂名称用量BigDye0.4lSequencing Buffer0.8lH2O1.8lPrimer（3.2pmol/l）（引物可单加）1l模板（即3-中的产物）1ul按照测序反应表在96孔板中加入3l以上MIX，1l对应引物，1l对应PCR产物（注意封膜后要求压膜）,离心。（测序反应只有一个引物，为避免加样过程中的液体消耗，体系需要超量配置）。 SEQ程序: 96预变性2min, 96 10s, 55 5s, 60 90s, 25cycles; 4/15。5、纯化此步骤是

6、将测序反应体系中除目标单链核酸片段之外的杂质尽可能去除, 以减少ABI 3730毛细管电泳时杂质对峰图质量的影响。 试剂准备：0.125 mol/L EDTA-Na2溶液：称取2.325g EDTA-Na2·2H2O于50ml离心管中，加入40ml去离子水， 65水浴加热，间歇振荡几次至完全溶解，用去离子水定容至50ml ，振荡10秒混匀。无水乙醇（优级纯）去离子甲酰胺HIDI 将无水乙醇与蒸馏水混合配制成85%乙醇，70%乙醇，当天使用。 测序反应板离心后，每个反应孔加入EDTA-Na2溶液2.5l，85%乙醇40l，充分震荡3min，离心3000g，4，30min（EDTA作为金

7、属离子螯合剂, 能与测序PCR反应体系中的离子结合从而去除离子）。 离心结束后将测序反应板倒置于吸水纸上，倒离心至离心力达到185g（或900rpm）时立即停止。 每孔加入70%乙醇50l，充分震荡1min，离心3000g，4，15min（DNA片段在70%的乙醇中溶解度低, 能通过离心沉淀下来）。 重复4步骤。 避光风干1530min，每孔加入10l HIDI（变性处理，生物安全柜中进行），离心后在PCR仪中96反应2min，降温至4后取出。6、上机测序变性结束后，上测序仪（ABI 3730）进行测序。1.创建样品板程序 选择GA Instruments > ga3730 > P

8、late Manager； 点击New按钮，弹出的New Plate Dialog窗口中填写相应的内容（在ID和Name空白栏中输入样品板的名字; 在Application中选择相应的测序程序; 在Plate Type中选择96或者384孔板; 在Scheduling中定义取样顺序; 在Plate Sealing中选择Septa; 在Owner Name、Operator Name中输入操作者。 点击“OK”按钮; 在弹出的Sequencing Analysis Plate Editor窗口中, 填入相关的内容（在Sample Name中填入样品名, 96孔板在A01行填写“1”，384孔板依

9、次在A01、B01、A02、B02行写1、2、3、4；在Results Group 1栏中选择数据上传路径; 在Instrument Protocol 1栏中选择测序程序; 在Analysis Protocol 1栏中选择数据分析程序）。 然后全选A01行，点击Edit > Fill Down Special, 选中Fill Down Special (96 Cap), 将自动生成96行; 如果是384孔板, 依次全选A01、A02、B01、B02行，重复4次操作, 点击“OK” 。2.载入样品板拉出样品栈, 打开进样栈门;放入样品板（顺序自下到上排列待上机）,注意缺角方向;关上进样栈门, 将载样栈推回原处。3.调用上机程序选择 GA Instruments > GA 3730 > Instrument Name > Run Scheduler。点击Search按钮, 在弹出的Add Plate to In Stack窗口中输入样品板名, 点击Search按钮，选中相应的样品板名, 点击Add按钮