水貂阿留申病毒VP2基因的克隆及原核表达

1、本科生毕业论文（设计）题 目:水貂阿留申病毒VP2基因的克隆及原核表达 姓 名: 韩蓉 学 院: 动物医学院 专 业: 动物医学 班 级: 动医54班 学 号: 1715428 指导教师: 雷治海 职称: 教授 姜焱 职称: 高级兽医师 2010 年 5 月 18 日南京农业大学教务处制目 录摘要1关键词1Abstract1Key words1引言（或绪论）11材料与方法11.1材料 11.2方法 21.2.1ADV的VP2基因的PCR扩增21.2.2VP2基因与T载体的连接21.2.3pET-VP2重组表达载体的构建31.2.4BL21 VP2 诱导表达比较42结果与分析52.1vp2基因的

2、PCR结果52.2PT-VP2重组质粒的酶切鉴定52.3pET-VP2重组质粒的构建6 2.4BL21VP2 E.coli重组蛋白表达6 3讨论6 3.1本实验的研究意义6 3.2本实验的优化条件7 3.2.1PCR条件的优化7 3.2.2目的基因片段与表达载体pET-32a(+)连接的优化7 3.2.3诱导表达条件的优化7 致谢7 参考文献7 水貂阿留申病毒VP2基因的克隆及原核表达动物医学专业学生 韩蓉指导教师 雷治海摘要：水貂阿留申病(AD)又称浆细胞增多症，是由水貂阿留申病细小病毒（ADV）持续感染引起的一种水貂自身免疫系统紊乱，同时并发自身免疫慢性病毒血症。根据Genebank上的水

3、貂阿留申病病毒的VP2基因序列，设计了一对引物，通过PCR方法扩增了完整的VP2基因，将PCR产物插入pET-32a(+)载体中，构建成重组原核表达载体pET-VP2。阳性重组质粒转化宿主菌BL21（DE3）中感受态细胞，用IPTG进行诱导表达，对表达产物进行SDS-PAGE检测，结果表明表达产物的分子质量约为21kD。成功表达了VP2蛋白，为VP2蛋白的作用研究以及相关疫苗的制备奠定了基础。关键词：水貂阿留申病病毒；VP2基因；原核表达 Cloning and Prokaryotic Expression Of Main Antigenic Region Of VP2 Gene of Ale

4、utian Mink Disease Parvovirusstudent majoring in veterinary medicine Han Rong tutor Lei ZhihaiAbstract：Aleutian mink disease (AD)，also known as mink plasmacytosisIt is caused by a persistentinfection with Aleutian mink disease virus (ADV)，a nondefective parvovirusAD is kind of mainly enc-roaches the

5、 immunocyte of mink，results in immune system disorders and simultaneous with autoimmune viremia diseaseAccording to the sequence of full genome of VP2 published on Genebank，we designed a pair of primers to amplify full VP2 gene by PCRThis PCR product is inserted into pET-32a（+）to construct pET-VP2Th

6、e positive recombinant vectors were transformed into recipient germs BL21(DE3) for express-ion by IPTG inducingThe expressed proteins were measured by SDS-PAGEThe results showed that the molecular weight of the expressed proteins were separately 21KDVP2 protein Was successful expressedIt laid a foun

7、dation of study on role of VP2 in pathopoiesis of viruses and development of relevant vaccineKey words: Aleutian mink disease virus；VP2 genes；Prokaryotic expression水貂阿留申病(Aleutian Disease of Mink，AD)是由水貂阿留申病毒(Aleutian Mink Disease Virus，ADV)引发的一种水貂慢性进行性疾病。梁士哲等1982年报道了该病在我国的发生1，目前在全国范围内仍广泛流行，是当今阻碍养貂业

8、发展的主要传染病，以繁殖能力下降、貂体消瘦、自身免疫病、高免疫球蛋白血症、细菌感染的易感性增加、肾衰竭死亡为基本特征2。临床上病理综合征表现为母貂流产、新生仔貂急性肺炎、成年水貂慢性免疫复合物介导的肾小球肾炎3，ADV属细小病毒科(Parvovirdae)细小病毒属(Parvovirus)4。ADV的基因组为线性单链DNA，ADV病毒粒子中的蛋白分为结构和非结构蛋白2类。基因组全长为4801 bp，主要编码VP1和VP2两种结构蛋白。VP1和VP2共同构成病毒粒子的衣壳粒，而VP2在病毒衣壳中占有绝大部分的比重，病毒粒子蛋白的结构功能也主要集中在VP2蛋白上5-7。由于VP2基因的可变性和相对

9、保守性及其与致病性的相关性，该基因成为研究ADV毒力和致病机理等的首选基因8。本研究就ADV国内分离株的VP2基因主要抗原区进行了克隆与表达，为VP2蛋白功能与作用的深入研究积累资料，同时为进一步揭示ADV抗原表位的分子特征奠定基础。1 材料和方法 11 材料 1.1.1 水貂阿留申病毒 由江苏出入境检验检疫局动植物检测中心实验室姜焱博士保存。1.1.2 质粒及菌株 T载体，pET-32a表达载体及其宿主菌BL21(DE3)，都由江苏出入境检验检疫局动植物检测中心实验室姜焱博士保存。1.1.3 各种试剂质粒抽提试剂盒、rTaq和各种限制性核酸内切酶均购自于Takara公司；pGem T-Eas

10、y 试剂盒，购自Promega公司；LB培养基、酵母浸出物、水解酪蛋白为Oxoid产品。每1000 mL LB液体培养基含有10 g胰化蛋白胨、5 g酵母浸出物和10 g Nacl抗性培养基的氨苄青霉素终浓度为100 g/L。固体培养平板为LB液体培养基加入1.6%琼脂，分装平皿后灭菌。TAE电泳缓冲液参照分子克隆实验指南（第二版）配制9。1.1.4 引物参考已发表的ADV VP2基因核苷酸序列，利用Primer 5.0软件分别设计合成两对引物，用于扩增VP2上主要抗原表位区的两个核酸片段；P1: (5-TACggATCCTgCAAACCAAAgACAgAT-3)P2: (5- gCggAAT

11、TCggTTTTTATTCTgTCTgg-3)1.1.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂丙烯酰胺、N N-亚甲基双丙烯酰胺，按照如下比例配制：总体积100 mL中含有29 g丙烯酰胺和1 g N N-亚甲基双丙烯酰胺。用纯水配制，并置于棕色瓶中，4保存。TEMED（四甲基乙烯二胺），购自Promega公司。10% SDS（十二烷基苯磺酸钠）、10%过硫酸铵溶液、2×上样缓冲液、考马斯亮蓝R-250染色液和脱色液等，均参照分子克隆实验指南（第二版）9自行配制。1.1.6 主要仪器PCR仪：AmpGene公司生产，DNAThermol Cycler4800 型；V-16夹心垂

12、直电泳槽：上海精益有机玻璃制品仪器厂生产；THZ-C空气恒温震荡器：江苏太仓光明实验分析仪器厂产品；TY-80S型脱色摇床：南京大学南达生物技术开发公司；SCR-6型稳定电泳仪，江苏丹阳无线电一厂；ZDX-35BI型座式自动电热压力蒸汽高压锅：上海申安医疗器械厂。12 方法1.2.1 ADV的VP2基因的PCR扩增ADV的VP2基因的PCR扩增,优化体系为：超纯水 33 L、10×PCR Buffer 5 L、dNTPs Mix 4 L、1.5 mM MgCl2 4 L、上游引物 1 L、下游引物 1 L、Taq酶 1 L、反应程序为：95 3 min，94 1 min，55 1 m

13、in，72 1 min，30个循环，然后72延伸10 min，最后置于4。反应结束后，取8 L PCR产物在10 g/L琼脂糖凝胶上进行电泳。1.2.2 VP2基因与T载体的连接1.2.2.1 coli DH5 感受态细胞的制备用接种环蘸取冻存于-20的DH5甘油菌少许，并划线接种于琼脂LB平板上，倒置于温箱中，37培养24 h；待平板上长出单个菌落，挑取形态均一的单个菌落，接种于含3 mL LB的试管中，37振荡培养，待其细菌浓度达到约0.50.6时，参照分子克隆实验指南（第二版），制备感受态细胞，其具体过程如下：取约1.5 mL细菌于1.5 mL Eppendorf管中，3800 rmp离

14、心4 min，收集细菌，用400 L 0.1M CaCL2 轻轻吹打开细菌，并置于冰水混合物中水浴5 min，取出，将离心管于3800 rmp离心4 min收集细菌，小心吹打开细菌并用200 L 0.1M CaCL2小心吹打开细菌，再置于冰水混合物中水浴1 h，即得感受态细胞。该细胞可以立即使用，也可以加入甘油于-20冻存备用。1.2.2.2 PCR产物的小量胶回收试剂盒法回收反应产物于1.2 %琼脂电泳，切下目的条带，按小量胶回收试剂盒说明书进行回收目的片段，其过程为：称量所切下胶块的重量，按照100 mg胶块：300 L溶胶液的比例加入溶胶液。如胶块重量不足100 mg，可以加入纯水补足；

15、将混合物在75水浴10 min，中间每隔2 min取出EP管颠倒一次以使胶块充分溶解。将溶解后的混合物吸入收集管，12000 rmp离心1 min，用洗涤液先后洗涤两次，每次用500 L，并于12000 rmp离心1 min，最后在收集管膜中央部位加入25 L洗脱液，放置2 min，12000 rmp离心1 min，收集离心所得液体。该洗脱液中即含有所有的DNA片段。1.2.2.3 外源片段和T载体的连接、转化在RNA/DNA Calculator 上测定该溶液中DNA含量，与T载体连接（操作步骤见pGem T-Easy试剂盒）。外源片段和T载体连接的优化体系为：外源DNA 8.5 L、T载体

16、 0.5 L、2×连接Buffer 10 L、T4DNA连接酶 1 L、使外源DNA和T载体的摩尔比例大约为3：1，将上述连接体系于掌式离心机上稍作混合，置于16连接过夜。取出，转化方法参考文献9。其过程如下：将连接产物吸入至感受态细胞中，轻摇混匀，置于冰水混合物中水浴30 min，42热冲击90 sec，再冰水浴2 min。加入LB液体培养基800 L，37振摇45 min。12000 rmp离心1 min收集细菌，均匀涂布于氨苄平板上。37温箱中培养24 h。1.2.2.4 小量试剂盒提取质粒用购自Takara公司的质粒小量抽提试剂盒提取50 L的质粒。1.2.2.5 酶切鉴定重

17、组质粒将所提的质粒，取出10 L用EcoR和BamH作酶切鉴定。酶切体系为：超纯水 6 L、质粒 10 L、10×K Buffer 2 L、EcoR 1 L、BamH 1 L、 混匀上述反应体系，并置于37水浴3 h。将酶切产物于1.2 %琼脂凝胶上电泳，在紫外投影仪上检测电泳结果。将阳性质粒命名为pT-VP2。1.2.3 pET-VP2重组表达载体的构建1.2.3.1 含pET-32a(+)质粒DH5 E.coli的增殖和pET-32a(+)的提取用接种环蘸取冻存于-20的含pET-32a(+)质粒DH5 E.coli甘油菌少许，并划线接种于含氨苄的琼脂LB平板上，倒置于温箱中，3

18、7培养24 h；待平板上长出单个菌落，挑取形态均一的单个菌落，接种于含20 mL LB的试管中，37振荡过夜培养。用试剂盒小量提取质粒；并于1.2 %琼脂凝胶上电泳以鉴定质粒大小和浓度。1.2.3.2 回收表达载体pET-32a(+)的双酶切产物将表达载体pET-32a(+)进行EcoR、BamH双酶切，其酶切反应体系为：超纯水 6 L、质粒 10 L、10×K Buffer 2 L、EcoR 1 L、BamH 1 L混匀上述反应体系，并置于37 反应23 h，酶切产物行1.2 %琼脂糖凝胶电泳将目的片段切下，按DNA小量凝胶回收试剂盒回收说明书回收目的片段。1.2.3.3 克隆载体

19、pT-VP2的双酶切及目的片段的回收将克隆载体pT-VP2经EcoR、BamH双酶切，其酶切反应体系为：超纯水 6 L、pT-VP2 10 L、10×K Buffer 2 L、EcoR 1 L、BamH 1 L混匀上述反应体系，37 反应23 h，酶切产物行1.2 %琼脂糖凝胶电泳，将目的片段切下，按DNA小量凝胶回收试剂盒回收说明书回收目的片段。1.2.3.4 目的基因片段与表达载体pET-32a(+)的连接将阳性的克隆pT-VP2 经双酶切及目的片段回收，与经相应双酶切及回收的pET32a表达载体进行连接反应，将阳性克隆命名为pET-VP2见图1。VP2 +Vp2vp2vp2vp

20、2 VP2目的基因pET-VP2载体图1 VP2基因插入pET-32a(+)载体中，构建成重组原核表达载体pET-VP2Fig.1 VP2 genes is inserted into pET-32ato construct pET-VP2 pET-VP2连接反应优化体系为：pET-32a(+) 5 L、10×Ligase buffer 2 L、T4 DNA N Ligase 1 L、目的基因片段12 L、混匀上述反应体系，在冰水混合物环境下连接过夜。1.2.3.5 BL21（DE3）感受态细胞的制备用接种环蘸取冻存于-20的BL21（DE3）甘油菌少许，并划线接种于琼脂LB平板上，

21、倒置于温箱中，37培养24 h；待平板上长出单个菌落，挑取平板上单个菌落，扩大培养至OD值为0.50.6，用0.1M CaCL2制备感受态细胞。1.2.3.6 转化吸出过夜连接产物8 L，转移至 BL21（DE3）感受态细胞中，轻摇混匀，置于冰水混合物中水浴30 min，42热冲击90 set，再冰水浴2 min。加入LB液体培养基800 L，37振摇45 min，12000 rmp离心1 min收集细菌，均匀涂布于氨苄平板上，37温箱中培养24 h。1.2.3.7 鉴定阳性菌落挑取多个单菌落，接种到3 mL氨苄LB液体培养基的试管中，振摇培养过夜。小量提取质粒，先于1.2 %琼脂糖上电泳鉴定

22、质粒的大小和浓度。然后每个样品取出5 L用EcoR、BamH双酶切消化鉴定，双酶切体系为：超纯水 6 L、pET-VP2 10 L、10×K Buffer 2 L、EcoR 1 L、BamH 1 L混匀上述反应体系，37反应23 h，酶切产物行1.2 %琼脂糖凝胶电泳，观察结果。阳性克隆命名为pET-VP2。1.2.4 BL21VP2 诱导表达比较1.2.4.1 含阳性质粒的E.coli的诱导表达和样品处理挑取含pET-VP2的BL21VP2平板上的单个菌落，过夜培养于37培养至OD600 0.50.6之间，加入1 mM终浓度的IPTG 37诱导6 h。取样品菌液1 mL，室温离心1

23、2000 rmp 1 min，收集菌体。加入2 ×上样缓冲液50 L和纯水50 L，吹打使混合均匀。于沸水中水浴5 min，每个样品均取20 L上样，于12 %分离胶上进行SDS-PAGE。1.2.4.2 SDS-PAGE参照分子克隆实验指南（第二版）9，在垂直板式聚丙烯酰胺凝胶电泳槽中进行SDS-PAGE。配制12 %分离胶：在一洗净的50 mL小烧杯中，依次加入纯水3.4 mL、30 %丙烯酰胺贮存液4.0 mL、Ph 8.8 1.5 M Tris-HCL缓冲液2.5 mL、10 %SDS 0.1 mL、10 %过硫酸铵0.55 mL和TEMED 0.01 mL，混匀。加入TEM

24、ED后迅速将混合物沿玻璃板倒入槽内，使槽内液体的上液面距离短玻璃上缘约23 cm，胶液表面小心加入纯水，用纯水慢慢冲洗23次，洗去未聚合的分离胶，然后用吸水纸吸去残余水，开始配制浓缩胶。配制5 %浓缩胶：在另一洗净的50 mL小烧杯中，依次加入纯水2.85 mL、30 %丙烯酰胺贮存液0.85 mL，Ph 6.8 0.5 M Tris-HCL缓冲液1.25 mL、10 % SDS 0.05 mL，10 %过硫酸铵0.025 mL和TEMED 0.01 mL。轻旋烧杯以充分混匀，但勿摇起泡沫。加入TEMED后迅速将混合物沿玻璃板倒入槽内，加满，插入预先洗净、烘干的梳子。室温下放置一段时间，使凝胶

25、充分形成。加入Tris-甘氨酸缓冲液（1000 mL中含Tris 3.03 g，甘氨酸14.1 g，10 %电泳级SDS 10 mL）约1000 mL，倒入电泳槽中。拔出梳子。用加样器长针头整理各加样孔边缘。每孔上样1520 L，将电源负极接至矮板一侧电极，电源正极接至高板一侧电极，电压调至100 V开始电泳，直到电泳结束。当电泳进行至样品中恶溴酚蓝指示剂距凝胶下缘约1 cm时，停止电泳，卸下玻璃板，取出凝胶，在考马斯亮蓝R-250染色液中染色5 h，在脱色液中充分脱色。2 结果与分析2.1 VP2基因的PCR结果取出PCR产物10 L于1.2 %琼脂糖凝胶上进行电泳，并与Marker DL2

26、000对照，可见在约860 bp处见到一特异、明显条带，即为VP2基因见图2。2 1 1 图2 水貂阿留申病毒VP2 基因PCR产物电泳分析1VP2基因PCR的产物；2DL2000 DNA分子量标准；Fig.2 the agarose gel analysis of vp2 gene1vp2 gene PCR Product；2DL2000 DNA Marker； 2, DL2000 DNA Marker;860bp 1000bp750bp2.2 PT-VP2重组质粒的酶切鉴定pGem-T Easy载体的大小为3 Kb，插入的完整VP2基因为860 bp。在插入的外源基因的两侧有EcoR和Ba

27、mH酶切位点，因此，用EcoR和BamH可切出外源片段。酶切鉴定结果见图3。1 1 2T载体860bp1000bp750bp图3 重组质粒PT-VP2酶切鉴定结果1阳性质粒;EcoR和BamH双酶切鉴定；2DL2000 DNA分子量标准；Fig.3 Identification of recombinant plasmid PT-VP2 by restriction endonuclease digestion1positive plasmid digested by EcoRI and BamHI；2DL2000 DNA Marker； 2.3 pET-VP2重组质粒的构建pET-32a(+

28、)空载体的大小为5900 bp，插入的编码阿留申病毒VP2基因蛋白的基因为860 bp。按照设计，用EcoR和BamH双酶切即可切出外源片段见图4。 2 1图4 重组质粒pET-VP2酶切鉴定结果1阳性质粒;EcoR和BamH双酶切鉴定；2DL2000 DNA分子量标准；Fig.4 Identification of recombinant plasmid pET-VP2 by restriction endonuclease digestion1positive plasmid digested by EcoRI and BamHI；2DL2000 DNA Marker；pET-32a860

29、bp 1000bp750bp 2.4 BL21VP2 E.coli重组蛋白表达经IPTG诱导表达，确定IPTG浓度为l mmol/L、诱导温度为37，从0 h开始诱导，诱导5 h，每1 h取一次菌液，一次1 mL。SDS-PAGE分析表明，pET-VP2经诱导表达后，在2l kD处有明显的蛋白带，与预期的目的产物蛋白带大小一致，而未诱导菌没有出现相同的条带。其大小与推测的一致见图5。 97.2KD 66.4KD 44.3KD 29.0KD 20.1KD 14.3KD M 1 2 3 4 5 6VP2表达的蛋白图5 重组蛋白的SDSPAGE分析M低分子量蛋白Marker；1未经诱导的菌体蛋白；2

30、6诱导05h的菌体蛋白；Fig.5 SDS-PAGE analysis of the recombinant proteinM.LMW Protein Marker； 1PET-vp2/BL21 Not induced；26PET-VP2/BL21 induced at concentration for 05h；3 讨论3.1 本实验的研究意义本研究选用ADV分离株对其VP2基因主要保守区进行了克隆及原核表达。VP2是主要免疫原性抗原，是抗原决定簇的载体，通过研究发现VP2蛋白具有稳定的免疫原性，也有可能是抗体作用的部位，可被不同毒株的阳性血清所识别。VP2基因组全长1755bp，因为大肠杆

31、菌表达外源基因的长度是受到限制的，在大肠杆菌中表达全基因，会影响表达效果，所以本实验只克隆了VP2抗原决定簇和抗体的位点集中部分的基因，用PCR法扩增出VP2部分基因。Clemens以及Christensen等分别利用痘苗病毒和棒状病毒做载体，克隆了VP2基因并成功表达了具有免疫原性的蛋白10-12，本实验将目的基因克隆到原核表达载体pET32a（+）中，转化宿主菌BL21，用IPTG诱导，得到了高效表达。利用表达蛋白作为建立免疫诊断与监测技术的抗原是血清学发展的一个趋势。所以获得的表达蛋白为以后建立ELISA方法及血清学诊断技术提供了良好的物质基础，其抗原性方面具有相应的代表性，同时也为以后

32、应用该表达蛋白进行诊断研究的可行性提供了依据，为研制该病毒的基因工程疫苗提供了技术保障，为该病的预防带来了很大的希望。3.2 本实验的优化条件3.2.1 PCR条件的优化PCR扩增反应中，影响其扩增的因素较多，即使是熟练的优化程序，PCR反应一般不能同时具备很好的特异度和敏感度13。反应中模板的质量和浓度、Mg2+浓度、Taq酶质量和浓度、反应温度和时间及反应体积等因素均会影响克隆结果。在本实验中，PCR的结果出现许多非特异性条带的干扰,为消除非特异性条带，使结果的可靠性增强，重新制作模板并重复试验，升高DNA变性温度到95,同时提高退火温度到72 ，结果发现处理中非特异性带消失仅有860 b

33、p条带出现。3.2.2 目的基因片段与表达载体pET-32a(+)连接的优化目的基因片段与表达载体pET-32a(+)连接过程中反应体系的优化很重要，在本实验中，出现多次目的基因片段与表达载体连接不上的情况，理论上使外源DNA和表达载体的摩尔比例大约为3：1时连接效率最高，但由于质粒的片段大小，浓度等因素，需要多次重复实验摸索优化。3.2.3 诱导表达条件的优化图2-4显示了BL21 VP2从诱导0 h直到诱导5 h重组蛋白质的表达量。在诱导0 h几乎不能见到重组蛋白的表达；在诱导后1 h，即可见到有明显的重组蛋白质的表达；诱导后2 h，重组蛋白质的量明显高于诱导后1 h，而诱导后3 h到4

34、h，重组蛋白质的表达量虽有所增加，但变化不明显；从4 h到5 h，表达量几乎没有增加。因此，综合考虑诱导表达量的大小和花费的时间，选取诱导后4 h作为最优时间。致谢时光飞逝，眨眼间五年的大学时光就走到尽头，五年的大学时光使我从一个无知的少年，长成了对社会有用的人。改变是在潜移默化中一点点形成，而这些改变与这所学校、这个家、这个知识的摇篮是分不开的。感谢南京农业大学的培养，感谢辛勤教育我的老师们，也要感谢所有帮助过我的人。本实验是在导师雷治海教授和姜焱博士的悉心指导下完成的。实习期间，两位导师在科研上、生活上给予了我莫大的关心与帮助。他们宽广的胸襟、广博的学识、严谨的科研态度和一丝不苟的敬业精神

35、，使我受益终身，在此致以我最衷心的感谢！本实验是在江苏出入境检验检疫局动检实验室完成的。实验中倾注了老师们大量心血并给予了耐心细致的指导，使我按时完成了论文，在此表示衷心的感谢。此外，感谢王凯民、朱鲁敏、尹会红等各位老师和同事在试验过程中给予的极大帮助和支持。感谢至亲至爱的家人给予的关心和鼓励，这份浓浓的亲情一直伴随着我的成长和进步。参考文献：1 梁士哲，渠川攻，魏喜仁，等犬传染性肠炎的研究一腹泻犬粪便中检出的细小病毒颗粒J上海畜牧兽医通迅，1982，2(4)：1722 Porter D D，Larsen A E，Porter H G，et a1Aleutian Disease of Mink

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