脱镁叶绿酸的制备及其光敏抗菌活性

1、脱镁叶绿酸的制备及其光敏抗菌活性         作者：唐蕾 徐磊 韩跃 毛洪 【摘要】 以初步纯化的叶绿素为原料，利用叶绿素酶水解、选择性酸降解两种方法制备脱镁叶绿酸。高效液相色谱分析显示两种方法得到的产物图谱相似，酸降解产物中脱镁叶绿酸A的含量较高。抗菌实验表明脱镁叶绿酸对革兰阳性菌具有光敏抑菌效果                  

2、               作者：唐蕾 徐磊 韩跃 毛洪 【摘要】  以初步纯化的叶绿素为原料，利用叶绿素酶水解、选择性酸降解两种方法制备脱镁叶绿酸。高效液相色谱分析显示两种方法得到的产物图谱相似，酸降解产物中脱镁叶绿酸A的含量较高。抗菌实验表明脱镁叶绿酸对革兰阳性菌具有光敏抑菌效果，对革兰阴性菌和酵母无明显作用。 【关键词】  脱镁叶绿酸； 叶绿素酶； 高效液相色谱； 光敏抗菌活性    AB

3、STRACT  Partially purified chlorophyll was used to prepare pheophorbide (Pheide) by chlorophyllase hydrolysis and selective acidic hydrolysis methods. High performance liquid chromatography analysis showed that the Pheide A was obtained with higher purity by acidic hydrolysis method. The antimi

4、crobial test showed that Pheide had obvious photosensitive activity against Gram positive bacteria.    KEY WORDS  Pheophorbide;  Chlorophyllase;  High performance liquid chromatography;  Photosensitive antimicrobial activity   光敏剂是一些具有光活性的化合物，可以选择性地富集在特定的

5、组织，在紫外或可见光的激发下，产生光动力杀伤作用，起到杀菌和治疗肿瘤的功效。近年来，由于抗生素的滥用所引起的毒副作用、耐药菌的出现和自然微生物群落的破坏，使得天然、环境友好、能够有效地杀灭有害菌而不伤及邻近组织的光敏剂颇受关注1。脱镁叶绿酸(Pheide)作为卟啉类光敏活性剂具有结构明确、稳定，在红外区有较强的吸收，光敏活性更有效等特点，在癌症的光敏动力学治疗中已有报道24，但其光敏杀菌作用尚待探讨。此外，脱镁叶绿酸作为叶绿素(Chl)的中间降解产物在植物中很少积累，分离困难，但可以通过叶绿素的酶促水解和酸降解法获得5，6。基于上述分析，本文对酶法和酸法叶绿素降解产物进行了比较，并研究了其对细

6、菌和酵母的光敏活性。    1  材料与方法    1.1  菌种    酵母  八孢裂殖酵母(Schizosaccaromyces octosporus)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、卡尔斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、黏红酵母(Rhodotorula glutins)、隐球酵母(Cryptococcus sp.)。    细菌

7、  产气肠杆菌(Aerobacter aerogenes)、金葡菌(Staphylococcus aureus)、四联球菌(Micrococcus tetraglnus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinese)、白葡萄球菌(Staphylococcus albus)、大肠埃希菌(Escherichia coli)。均为实验室保藏菌种。    1.2  培养基及培养条件    酵母培养基  酵母膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，

8、定容至1000ml，pH6.0。    细菌培养基  NaCl 5g，蛋白胨10g，牛肉膏3g，定容至1000ml，pH7.0。121灭菌20min。    培养温度  酵母28，细菌37，光照为培养箱内置光源。    1.3  抗菌实验    (1)在固体平板上均匀涂布200l菌液，取10l待测样品溶液于直径6mm的滤纸片上，稍干后贴于已接菌的琼脂培养基表面，光照条件下恒温培养24h，观察、记录抑菌圈大小，并与阳性对照药物(细菌为氨苄西林，酵母

9、为放线菌酮)相比较，每个处理设3个重复。    (2)将待测菌在含有50g/ml的Pheide培养基上十字划线，比较光、暗条件对微生物生长的影响，每个处理设3个重复。    1.4  叶绿素的提取    参照Iriyama法7，从菠菜中提取和纯化叶绿素，丙酮溶解，测定溶液在645和663nm处的吸光值，按照Arnon公式计算叶绿素含量：    Chl A(mg/ml)=0.0127A663-0.00269A645    Chl B(mg

10、/ml)=0.0229A645-0.00468A663    1.5  脱镁叶绿酸的制备    (1)酶解法  采集新鲜的豌豆叶，洗净晾干，在冷丙酮中匀浆后过滤，滤物用冷丙酮漂洗并干燥。1g过滤物用25mL磷酸缓冲液(20mmol/L，pH7.0，内含0.24% TritonX100)搅拌抽提4.5h，在8000r/min，4条件下离心10min，上清液即为所需叶绿素酶酶液。叶绿素酶酶液中蛋白含量的测定采用双缩脲法。叶绿素酶溶液、20mmol/L磷酸缓冲液和0.15mg/ml叶绿素充分混匀(该反应体系中蛋白质终浓度为3.2g/l、丙酮40%、TritonX100 0.60%，pH7.0)，在37恒温水浴中12h反应完全后，加入正己烷丙酮10mmol/L KOH(321)涡漩混匀，在8000r/min，4的条件下离心10min。取下层并加入几滴盐酸酸化即得到脱镁叶绿酸溶液，4冰箱避光保存。    (2)酸解法  采用Hynninen选择性酸法水解6，盐酸乙醚分级分离，将醚层