三株乳酸菌的分离筛选_图文

1、编号：学号：吉林农业大学发展学院毕业论文三株乳酸菌的分离筛选学专班姓2011年06月10日乳酸菌的分离筛选本文重点阐述了乳酸菌分离筛选的具体过程：摘要摘要利用改良MC 培养基溶钙圈等方法从自然发酵的酸菜汁以及市售酸奶中分离筛选出3株高产酸菌株，经形态学鉴定和生理生化反应试验，结果表明，3株高产酸菌株理化性状良好，酸奶中分离出的菌株为保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus 。关键词关键词乳酸菌分离筛选益生菌Isolation And Screening Of The Lactic Acid BacteriaAbstractFocuses on the specific

2、process of lactic acid bacteria isolated and screened:Threestrains of Lactic Acid Bacteria from natural fermentation sauerkraut and yogurt were isolation and screening by Ca -improved MC medium plates. Through morphological, physiological and biochemical reaction test. The results indicated that the

3、 three strains of physical and chemical properties is good.Isolated from yogurt is Lactobacillus bulgaricus .KeywordsLactic acid bacteria，Isolationand screening，Probiotics2+目录第一章前言. 11乳酸菌. 11.1乳酸菌概述. 11.2乳酸菌在人体中的重要作用. 11.3乳酸菌的生理生化功能. 11.3.1具有营养作用. 11.3.2降低胆固醇. 11.3.3增强免疫功能. 11.3.4抗变异原性. 21.3.5抗肿瘤作用.

4、 21.3.6抑制病原菌作用. 21.3.7抗高血压作用. 21.4乳酸菌在食品工业上的应用. 21.5乳酸菌菌落、菌体形态. 2第二章乳酸菌的分离筛选. 42材料与方法. 42.1原材料. 42.2培养基. 42.3仪器设备及药品材料. 52.4实验方法. 62.4.1酸菜汁中LAB 的分离试验设计. 62.4.2酸奶中保加利亚乳杆菌分离实验设计. 72.4.3酸菜中LAB 分离筛选实验方法. 72.4.4酸奶中LAB 分离筛选实验方法. 9第三章乳酸菌生理生化试验结果. 10第四章乳酸菌分离筛选试验结果. 11第五章生理生化试验详述与问题讨论. 125生理生化试验. 125.1运动性试验.

5、 125.2需氧性试验. 125.3过氧化氢酶试验. 125.4问题讨论. 125.4.1改良MC 培养基具有传统MC 培养基不具备的优点. 125.4.2两种培养基使用的先后顺序对试验的影响. 13第六章结论. 14本文创新点. 15致谢. 16参考文献. 17第一章前言1乳酸菌1.1乳酸菌概述乳酸菌(Lacticacid bacteria是对一类能利用可发酵糖类产生大量乳酸的细菌的通称。在分类学上属于非正式、非规范的惯用名称，但因为它很容易被人们所理解和接受而广泛引用。乳酸菌菌体细胞呈杆状或球状，革兰氏染色为阳性。乳酸菌为兼性厌氧菌，部分也属于严格厌氧菌，能利用葡萄糖产生50%以上的乳酸，

6、多数菌不能分解蛋白质。乳酸菌的乳酸发酵类型有两种：一种是分解葡萄糖后，只产生唯一产物乳酸的同型乳酸发酵；另一种是分解葡萄糖后，在产生乳酸的同时，还可以产生乙酸、乙醇、CO 2等其它代谢产物的异型乳酸发酵1。乳酸菌与人类的关系十分密切。不仅是人体消化道中的重要有益微生物群，而且还被广泛应用于食品工业、医疗保健、饲料发酵及畜禽疾病防治等方面2。1.2乳酸菌在人体中的重要作用乳酸菌能够帮助消化，有助人体肠脏的健康。长期科学研究结果表明，乳酸菌是人体必不可少的且具有重要生理功能的有益菌，科学家长期研究的结果证明，乳酸菌对人的健康与长寿非常重要。目前国际上公认乳酸菌是最安全的菌种，也是最具代表性的肠内益

7、生菌，人体肠道内以乳酸菌为代表的益生菌数量越多越好。乳酸菌不仅是用来发酵乳品的细菌，而且是有益于肠道菌群平衡、对人类健康有帮助的菌种，这种对人类健康有益的细菌被称为益生菌，乳酸菌位列益生菌之首4。1.3乳酸菌的生理生化功能1.3.1具有营养作用乳酸菌能分解食物中的蛋白质、糖类、维生素，能显著提高食物的消化率和生物价，促进消化吸收。能将-酪蛋白分解成微细的奶酪脂肪肽和氨基酸等，从而提高蛋白质的消化吸收率。在代谢过程中消耗部分维生素，同时也合成叶酸等B 族维生素。乳酸菌发酵后产生的有机酸可提高Ca、P、Fe 等元素的利用率，促进铁和V D 的吸收5。1.3.2降低胆固醇乳酸菌的代谢能显著降低肠道对

8、胆固醇的吸收，并将其转变为胆酸盐而从体内排出。乳酸菌菌体对胆固醇不仅有同化作用，还能抑制体内胆固醇生物合成酶的活性，减少体内胆固醇的合成。1.3.3增强免疫功能乳酸菌能够影响非特异性免疫应答，增强单核吞噬细胞的活力，刺激活性氧和单核因子的分泌。促进T、B淋巴细胞的增殖，加强机体的免疫力。它们还能刺激腹膜巨噬细胞、产生干扰素、促进细胞分裂、产生抗体及细胞免疫等，所以能增强机体的非特异性和特异性免疫反应，提高机体的抗病能力。1.3.4抗变异原性乳酸菌的抗变异原性，是由菌体直接作用于变异原，使变异原不能活化，从而减弱或消除其毒害作用。许多细菌的细胞壁具有与变异原性物质和致癌物结合的性质，而乳酸菌细胞

9、壁的这种性质更为显著，其结合能力比其他细菌更强；1.3.5抗肿瘤作用乳酸菌在肠道中生长，会使产生致癌物的不良细菌大量减少，进而减少致癌概率。乳酸菌能抑制一些结肠中的细菌酶，特别是那些能催化致癌物前体向致癌物转化的酶。致癌作用是通过致癌物诱导动物细胞突变开始的，一些乳酸菌可抑制动物细胞的突变，并产生免疫球蛋白抗体，从而活化巨噬细胞的功能，增强人体的免疫力，提高对癌症的抵抗力10。1.3.6抑制病原菌作用乳酸菌对一些腐败菌和低温细菌有较好的抑制作用。乳酸菌在体内发酵乳糖，产生大量的有机酸，使肠内处于酸性环境，能够抑制病原菌和对人体健康有害的细菌繁殖，从而起到预防感染，维持肠内菌群平衡的作用。不少乳

10、酸菌产生类似细菌素的细小蛋白质或肽类，对金黄色葡萄球菌、梭状芽孢杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌有抑制作用11。1.3.7抗高血压作用研究表明，乳酸菌通过其胞外蛋白酶、肽酶（羧肽酶、氨肽酶）的水解作用，将食物蛋白中具有降压活性的肽片段释放出来，从而起到降压作用。乳酸菌的菌体成分，如来自Lactobacillus.caseii 的细胞壁的一种多糖肽聚糖成分在高血压患者体内表现出降血压作用。部分乳酸菌，尤其是能以活菌形式达到肠道的乳杆菌，在肠道内能促进机体吸收部分可调节血压的矿物质。此外，部分乳酸菌产生的胞外多糖可能也具有一定的降压作用13。81.4乳酸菌在食品工业上的应用在食品工业中，乳酸菌可参与发酵或

11、不参与发酵直接添加，乳酸菌70%应用于乳制品中。乳酸菌可以赋予产品芳香、提高产品风味，减少香精、香料在产品中的添加，从而使产品更趋于天然20，如丁二酮乳链球菌及乳酪链球菌等，可产生乙二酰、乳酸、乙酸及丁二酮等风味物质。此外，乳酸菌还能够增加乳制品的粘稠度。吉林农业大学发展学院学士学位论文1.5 乳酸菌菌落、菌体形态图1-1乳酸菌菌落形态图1-3短乳杆菌图1-5嗜酸乳杆菌三株乳酸菌的分离筛选图1-2 植物乳杆菌图1-4 保加利亚乳杆菌图1-6乳球菌第二章乳酸菌的分离筛选2材料与方法2.1原材料道发牌酸菜一袋辉山牌酸奶一杯2.2培养基MRS 培养基23（乳酸菌分离培养基）：牛肉膏10g，蛋白胨10

12、g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温-801.0ml，K 2HPO 42g，NaAc·3H2O 5g，柠檬酸二铵2g，MgSO 4·7H2O 0.58g，MnSO 4·H2O 0.25g，补蒸馏水至1000ml（固体培养基中加琼脂1.5%-2%），调pH 至6.4±0.2，121高压灭菌15min。改良MC 培养基24（乳酸菌选择培养基）：牛肉膏5g，蛋白胨5g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乳糖20g，CaCO310g，琼脂20g，中性红0.05g，最终pH6.5±0.2，补蒸馏水至1000ml，121高压灭菌15min。2.3仪器设备及药品材料2

13、.3.1主要仪器设备厌氧培养箱立式压力蒸汽灭菌器生物显微镜超净工作台电热恒温鼓风干燥箱DH6-907385-III BC-J160S YXQ-LS-50Sll S92100上海博讯实业有限公司上海博讯实业有限公司Leica Microscope Ltd. 天津市医药净化设备厂上海新苗医疗器械有限公司电热恒温水浴锅电热恒温培养箱离心机电子调节万用电炉冰箱电子天平2.3.2药品与试剂牛肉膏蛋白胨酵母膏葡萄糖乳糖吐温-80柠檬酸二铵CaCO 3K 2HPO 4NaAc·3H2O MgSO 4·7H2O MnSO 4·H2O 琼脂DK-S28DH5000A TGL-16B

14、 BR BR BR AR AR CP AR AR AR AR AR AR上海新苗医疗器械有限公司天津市泰斯特仪器有限公司上海安亭科学仪器厂北京科伟永鑫实验仪器设备厂伊莱克斯北京奥博生物技术有限责任公司北京奥博生物技术有限责任公司北京奥博生物技术有限责任公司天津市大茂化学试剂厂上海新兴化工试剂研究所天津市天大化学试剂厂国药集团化学试剂有限公司北京化工厂天津市福晨化学试剂厂北京化工厂北京化工厂开原市化学试剂一厂上海惠世生化试剂有限公司2.4实验方法2.4.1酸菜汁中LAB 的分离试验设计酸菜汁中LAB 的分离、筛选及纯化流程：吸取酸菜汁1ml10倍梯度稀释混菌法平板涂布（MRSMedium）厌氧培

15、养（28培养48h）形成菌落观察、记录菌落形态与特征挑取单个疑似菌落MRS 固体平板多次划线分离纯化厌氧培养（28培养48h）选择单个菌落观察、记录菌落形态与特征Improved MC Medium 分离鉴定LAB挑取有溶钙圈菌落进行G +染色排除革兰氏阴性菌（G-菌）革兰氏阳性菌（G+菌）记录菌株细胞形态MRS 液体培养（28培养48h）各项生理生化试验显微镜拍照记录（两个月转接一次）甘油管冷冻保藏（80%甘油&MRS，置于冰箱-20冷冻）2.4.2酸奶中保加利亚乳杆菌分离实验设计酸奶中保加利亚乳杆菌的分离、筛选流程：吸取酸奶1ml10倍梯度稀释平板涂布（改良MC Medium）厌氧

16、培养（28培养48h）形成菌落挑取溶钙圈较大的单菌落观察、记录菌落形态与特征Improved MC Medium 划线分离纯化选取溶钙圈较大的单菌落进行G +染色革兰氏阳性菌（G+菌）记录菌株细胞形态MRS 液体培养（28培养48h）各项生理生化试验2.4.3酸菜中LAB 分离筛选实验方法酸菜袋外消毒后以5ml 一次性无菌针管穿刺吸取1ml 酸菜液，10倍梯度稀释至10-9浓度。取0.1ml 涂布于MRS 培养基（28培养48h）。对平板涂布培养结果作拍照记录(图2-1，挑取单菌落进行一次划线纯化（MRSMedium 28培养 48h）。图2-1酸菜液10-9浓度平板涂布培养结果对一次划线纯化

17、出的单菌落进行G +染色并拍照记录(图2-2，镜检发现阴阳菌混杂严重，遂进行二次划线纯化（MRSMedium 28培养 48h）。图2-2一次纯化所得菌G +染色结果图2-3二次纯化所得菌G +染色结果对二次划线纯化出的单菌落进行G +染色并拍照记录(图2-3，镜检发现阳性菌中仍混有一定量阴性菌，但纯度已有所提升，为提高试验结果的准确度，进行三次划线纯化，挑取两个单菌落分为A、B两板同条件培养（MRSMedium 28培养48h）。对三次划线纯化出的单菌落(图2-4进行G +染色并拍照记录(图2-5，镜检发现B 板阳性菌含量最高，纯度提升相对较满意，为了后续实验的准确性与结果的正确性，以B 板

18、菌继续试验，严格进行四次划线纯化（MRSMedium 28培养 48h）。图2-4三次划线纯化结果（B板）图2-5B 板菌G+染色结果四次划线纯化后分离出有所区别的5种单菌落，并相应挑取该5种疑似LAB 菌株菌苔，以改良MC Medium 进行LAB 分离鉴定培养（28培养48h）。Improved MC Medium 鉴定培养后发现，其中2株菌能够形成溶钙圈(图2-6、图2-7，选取该两株菌，切割溶钙圈较大的单菌落进行显微拍照记录(图2-8、图2-9、菌种形态学分析鉴定以及菌体显微镜拍照(图4-1、图4-2、G +染色(图2-10、图2-11，并分别编号为BF1和 CF1。图2-6改良MC

19、培养基鉴定出的乳酸菌1图2-7改良MC 培养基鉴定出的乳酸菌2 图2-8菌种BF1菌落形态图2-9菌种CF1 菌落形态图2-10菌种BF1G+染色结果图2-11菌种CF1G+染色结果2.4.4酸奶中LAB 分离筛选实验方法揭去酸奶封口纸，以1000l移液器吸取1000l酸奶，10倍梯度稀释至10-9浓度，涂布于改良MC 培养基，28培养48h 后，选取表面湿润、形态饱满、溶钙圈较明显的单菌落(图 2-12进行划线纯化。图2-12保加利亚乳杆菌涂布培养结果图2-13单菌落及溶钙圈标示图像划线纯化后挑取溶钙圈较大、形态饱满、表面湿润的单菌落中的少量菌苔涂片，以光学显微镜观察、油镜镜检(图4-3、4

20、-4，菌种编号为SN-1。图2-14 保加利亚乳杆菌纯化结果第三章乳酸菌生理生化试验结果表3-1菌落镜检项A2B1L-B L-C BF1CF1SN-1菌落颜色微白黄白微黄乳白微黄乳白灰白各菌种单菌落镜检结果1菌落形状圆形圆形圆形圆形圆形圆形圆形菌落边缘整齐整齐不整齐整齐不整齐整齐不整齐菌落表面状态湿润湿润湿润湿润湿润湿润湿润注：文中不对过程菌株A2、B1、L-B和L-C 做详细阐述；BF1、CF1和SN-1为最终试验菌株。表3-2各菌种单菌落镜检结果2菌落镜检项A2B1L-B L-C BF1CF1SN-1菌落光泽有光泽有光泽有光泽有光泽有光泽有光泽有光泽菌落大小(mm1.512.444.10各

21、菌种菌体生理生化反应特征1菌体形状短杆似球状短杆似球状长杆菌体G +染色阳性50%阳性50%阳性95%阳性90%阳性99%阳性99%阳性99%溶钙圈大小(mm2.102.854.52注：“”表示该项未测定。表3-3菌体镜检项A2B1L-B L-C BF1CF1SN-1菌体排列单个或短链成对或链状成对或链状注：“”表示该项未测定。表3-4菌体镜检项A2B1L-B L-C BF1CF1SN-1菌体芽孢无芽孢无芽孢无芽孢各菌种菌体生理生化反应特征2运动性试验不运动不运动不运动需氧性试验严格厌氧兼性厌氧兼性厌氧过氧化氢酶试验阴性阴性阴性注：“”表示该项未测定。第四章乳酸菌分离筛选试验结果 乳酸菌经多次

22、分离纯化，最终得到纯种三株，镜检结果如下：图4-1乳酸菌(BF1菌体形态图4-3保加利亚乳杆菌(SN-1菌体形态图4-2 乳酸菌(CF1菌体形态图4-4保加利亚乳杆菌(SN-1菌体形态第五章生理生化试验详述与问题讨论5生理生化试验5.1运动性试验乳酸菌的属种鉴别特征中，运动性检查是必需的项目。通常对于乳酸菌的鉴定不需要做鞭毛染色就能知道其是否具有运动性。试验所选用的是半固体培养基穿刺法18：有鞭毛的细菌可以在半固体培养基中游动却又不能任意游走，利用此现象可在半固体MRS 培养基中观乳酸菌的生长情况，判断试验菌是否具有运动性(图5-1。试验证明所选菌株不具备运动性。图5-1细菌运动性试验结果5.

23、2需氧性试验乳酸菌经28液体静止培养48h 后，取出观察并对照下图(图5-2：试验证明BF1严格厌氧、CF1兼性厌氧、SN-1兼性厌氧。图5-2液体培养鉴定菌种需氧性试验模拟结果A.好氧B.兼性厌氧C.严格厌氧5.3过氧化氢酶试验过氧化氢酶又称接触酶，能催化过氧化氢分解为水和氧。这项测定对于乳酸菌的鉴定是一项重要特征。绝大多数乳酸菌和一些厌氧菌的过氧化氢酶试验是阴性1。载玻片上滴一滴过氧化氢溶液，用接种环取一点菌苔均匀涂抹于过氧化氢溶液中，混合均匀后立即放在显微镜下观察是否有气泡产生，没有说明试验阴性，反之阳性。试验结果证明所选乳酸菌过氧化氢酶试验均为阴性。5.4问题讨论5.4.1改良MC 培

24、养基具有传统MC 培养基不具备的优点传统MC Medium 最终pH 值一般都调至5.8±0.2左右，而本文中所用的改良MC Medium 最终pH6.5±0.2，原因在于三点：(1培养基pH 调至过低则酸性物质会与培养基成分之一的碳酸钙反应，造成碳 酸钙的终量不足。(2(3乳酸菌在低pH 的培养基中生长产酸量会因周围环境酸量过高而降低，使培乳酸菌随菌龄和培养基酸度的增加，由革兰氏阳性变为阴性的可能性增大，养后显现出的溶钙圈变小或不清晰，直接导致培养后对乳酸菌菌落分辨的难度增大。对筛选分离纯化乳酸菌有一定影响。所以，改良后的培养基其pH 调至6.5±0.2，可使碳

25、酸钙在乳酸菌培养前的损失量减少、对乳酸菌产酸的抑制能力相应降低、降低菌体出现假阳性或阴性的几率。乳酸菌大量分泌酸性物质积累于菌落四周，使其四周的pH 与培养基的平均pH 差值增大，培养后所得乳酸菌菌落的溶钙圈更加明显，易于肉眼分辨。5.4.2两种培养基使用的先后顺序对试验的影响本文所使用的原材料是人们生活中接触最广泛的发酵类食品酸菜和酸奶。乳酸菌分离筛选的传统步骤是先用改良MC Medium 进行鉴别分离，再以MRS Medium 培养，对两种原材料，根据其特殊性分别设计最适试验方案：(1对于酸菜汁中乳酸菌的分离方法先以MRS Medium 培养混合菌株，再以改良MC Medium 进行筛选。

26、原因在于酸菜汁中菌类含量和酸奶中相比较复杂。乳酸菌和其他菌种（例如嗜热链球菌或双歧杆菌等）具有互利共生关系，是一种缺此失彼都难以生存的一类种间关系，共生的生物在生理上相互分工、互换生命活动的产物，在组织上形成了新的结构。先分离后的乳酸菌因缺失了共生菌会导致其生存环境适宜性下降，致使菌体的某些生理生化能力下降，包括分泌乳酸的能力。考虑到其来源的特殊性，以及种间彼此的依赖性，先用MRS Medium 进行培养，后以改良MC Medium 进行鉴别。(2由于所选酸奶属于成品酸奶，菌类含量较单一，故可以使用传统筛选方法进行筛选。第六章结论在对相关文献进行了系统的综述、对试验流程和方法做出了完整的构想和

27、设计、认真实施了具体的试验研究以后，本研究得到了以下主要结果和结论：1. 从酸菜汁中分离优选出两株乳酸菌菌株，经生理生化试验和形态学鉴定，确定其为乳酸菌。2. 参阅伯杰氏系统细菌学手册，从酸菜汁中分离得到的菌株BF1的菌体形态、菌落特征和生理生化特性与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum 相符；菌株CF1则与短乳杆菌(Lactobacillus brevis 相符，因此，菌株BF1应归属于植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum ，而菌株CF1应归属于短乳杆菌(Lactobacillus brevis 3。酸奶中分离出的乳酸菌镜检和生理生化试验鉴定后确定其

28、为保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus 。本文创新点1. 对传统MC 培养基成分进行了改良，优化了乳酸菌的生长环境，促进了乳酸菌的生长和产酸能力，使乳酸菌的鉴定工作由繁化简。2. 对乳酸菌的分离筛选试验流程进行了改进，使乳酸菌在MRS 培养基和改良MC 培养基上更易于生长，更好的使菌种各项生理生化性质在试验中的退化程度达到最小。吉林农业大学发展学院学士学位论文 三株乳酸菌的分离筛选 致 谢 本论文是在王莘老师的悉心指导下完成的， 王莘老师为我提出了众多宝贵的意见 和建议，在此，衷心感谢王莘老师为我提供试验所需的资源和良好的环境以及在本试 验上给予学生的悉心指导和帮助

29、！ 其次感谢学校，感谢四年来我的每一位任课老师，你们的热心指导和严谨的教学 态度，让我在四年的学习生涯中收获多多！ 最后我还要感谢各位老师能在百忙之中抽出时间来评审我的毕业设计！ 16 吉林农业大学发展学院学士学位论文 三株乳酸菌的分离筛选 参 考 文 献 1 2 凌代文,东秀珠.乳酸细菌分类鉴定及实验方法M.北京:中国轻工业出版社,1999. 王琦,周雨霞,李少英.内蒙古地区乳制品中乳酸菌的分离、鉴定J.内蒙古农牧学 院,1997,2:1-5. 3 BUCHANAN R E,GIBBONS R E.伯杰氏系统细菌学手册(第八版M.中国科学院微生物研究所 伯杰氏系统细菌学手册翻译组,译.北京:

30、科学出版社,1984：797-798. 4 5 6 7 8 郭本恒.益生菌M.北京:化学工业出版社,2004. 郭松年,田淑梅,白洪涛.乳酸菌及乳酸菌发酵食品J.食品科技,2005,12(1:39-40. 刘奕琼,张濒,田丰伟.微生物降胆固醇作用研究进展J.食品与机械,2003(1:6-9. 张旻,降胆固醇功能乳杆菌的筛选及降解机理研究,上海交通大学硕士学位论文,2006. 张英春,张兰威,马微.乳酸菌对免疫系统功能的调节作用J.食品研究与开 发,2003,24(5:80-82. 9 王玉文,刘英华.乳酸菌的生物拮抗作用J.中国乳品工业,2008,36(2:55-57. 10 胡东良.乳酸菌的抗肿瘤、抗变异原及免疫增强作用J.中国乳品工业,1997,25(6:11-15. 11 余焕玲