一株丛枝菌根真菌的形态与分子鉴定

1、第27卷第4期华南农业大学学报.27,No.4Vol2006年10月JournalofSouthChinaAgriculturalUniversityOct.2006一株丛枝菌根真菌的形态与分子鉴定龙良鲲,姚青,羊宋贞,朱红惠2华南农业大学园艺学院,广东广州510642)1211(1广东省微生物研究所,广东省菌种保藏与应用重点实验室,广东广州510070;摘要:从广东酸性土壤分离得到一种编号为221A1的丛枝菌根真菌.其孢子在土壤中单生,未见孢子果,椭圆形,黄色至褐色,孢子较大(170m230m),孢壁一层,厚约11m,Melzers反应为黄色.其形态特征与Glomusflavispo2rum

2、的特征描述相一致.提取其单孢子DNA,NestedPCR扩增其18SrDNA的NS312AM1区,经序列测定,并在Gene2Bank上比对,进行系统进化树分析,结果表明,221A1与Glomussp.98%.分子鉴定的方法只能将其鉴定到球囊霉属Glomus.(DQ371674)的亲缘关系最近,序列同源性为关键词:球囊霉属;形态;18SrDNA;进化树;鉴定中图分类号:Q939.5文献标识码:A文章编号:2411X(2006IdentificationofanArbuscultheMethodsofM2,YANGSong2zhen,ZHUHong2hui211(1GuangdongProvinc

3、ialKeyLaboratoryofMicrobalCultureCollectionandApplication,2CollegeofHorticulture,SouthChinaAgric.Univ.,Guangzhou510642,China)Abstract:Sporesofanarbuscularmycorrhizalfungalwhichmarkedas221A1wereisolatedfromtheacidsoilinGuangdongProvince.Thesporesformedsinglyinsoil,nosporocarp,ellipsoid,yellowtobrowni

4、ncolor.Sporewallconsistedbyonlyonelayerand11mthick.Melzersreactionwasyellow.Strain221A1accordedwithGlomusflavisporuminmorphology.DNAwasextractedfromasinglespore221A1,thentheNS312AM1regionof18SrDNAwasamplifiedspecificallybynestedPCR.PCRproductswassequencedandtheDNAsequencewasblastedonGeneBank.Phyloge

5、netictreerevealedthatstrain221A1wascloselyrelatedtoGlomussp.(DQ371674),withthesimilarityof98%.Strain221A1wasbelongtothegenusGlo2mussp.bypartof18SrDNAsequenceanalysis.Keywords:Glomus;morphology;18SrDNA;phylogenetictree;identification丛枝菌根(arbuscularmycorrhizal,AM)真菌是一类能与植物根系形成互惠共生体的微生物,可侵染90%以上的陆生植物.由

6、于AM真菌能够积极促进宿主植物吸收矿质营养(P,N等),增强宿主植物对各种生物胁迫(病原菌等)和非生物胁迫(贫瘠、干旱、重金属等)的抗性,已成为一类重要的微生物资122源.AM真菌菌种的分类鉴定是一项重要的基础工作,对于认识和保护AM真菌资源具有重要的意义.以往人们多是根据孢子形态、菌丝侵染和产孢方式等特征对AM真菌进行分类鉴定,但由于同一种AM真菌的孢子形态会因环境条件(地理差异、宿主植物)的不同,而有较大的差别,因而易给菌种鉴定1工作带来困难或产生分类混乱.随着分子生物学技术的发展,各种分子技术已被应用到物种的鉴定收稿日期:2006203208作者简介:龙良鲲(1978),男,助理研究员,

7、博士研究生;通讯作者:朱红惠(1970),女,博士,副研究员,E2mail:zhuhon2ghui66基金项目:国家自然科学基金(30370033,30200006);广东省自然科学基金(E05202480) 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 第4期龙良鲲等:一株丛枝菌根真菌的形态与分子鉴定41工作中.如16SrDNA已成功地应用于原核生物的种群鉴定,18SrDNA、ITS等序列应用于一些真菌菌种的鉴定.AM真菌的分子鉴定工作,国外已有研究报325道,国内开展得则

8、很少.本文以形态学特征对1株AM真菌(221A1)进行了鉴定,并尝试用18SrDNA序列分析法对其进行鉴定.树,分析221A1、Gi.margaritaRB的亲缘进化关系.2结果与分析2.1形态鉴定221A1在自然环境下,未发现孢子果,孢子单生,1材料与方法1.1材料编号为221A1的AM真菌孢子从酸性土壤样品221(pH5113,广州市增城郊区采集)筛得,其孢子数量占原样品中孢子总数的60%以上,为优势种.丛枝菌根真菌GigasporamargaritaRB,由日本畜产草地研究所土壤生态研究室赠送.1.2形态鉴定221A1孢子经w=5%氯胺-T消毒45min,无菌水漂洗3次后,置于w=1%水

9、琼脂(pH518)平板上做萌发试验,观察孢子萌发方式.221A1三叶草,于光照培养箱(2026)1个月.湿筛法、生方式.VL(alcohol)、PVLG(polyvinyl2lactgycerol)为浮载剂,观察孢子形态、颜色,测量大小,压片观察孢子壁结构,测厚度,观察连孢菌丝形态,Melzers试剂、棉1兰试剂反应等组织化学试验.根据文献6进行鉴定.1.3单孢DNA的提取参照文献7,用镊子夹取单个221A1或Gi.margaritaRB孢子,无菌水漂洗3次后,放入盛有10LTE(Trise2EDTA)缓冲液的115mL离心管中,经充分捣碎、沸水浴5min等步骤获取孢子DNA,并于-20保存.

10、1.4NestedPCR参照文献7,分别以221A1、Gi.margaritaRB单孢子DNA为模板,进行NestedPCR扩增18SrD2NA的NS312AM1区域.首次PCR所用引物为真菌18SrDNA通用引物Geo11和GeoA2.再次PCR则以首次PCR的产物作模板进行,所用引物为NS31和AM1.取5LPCR产物,以w=110%琼脂糖凝胶电泳检测.1.5DNA测序及系统进化分析以AM1为测序引物对2种孢子的NS312AM1区扩增产物进行全序列测定(上海博亚生物工程有限公司完成).并将获得的DNA序列分别在NCBI网站的GenBank上比对.收集相关菌种的NS312AM1区DNA序列,

11、以软件DNAMAN5.2.2构建系统发育椭圆形,黄色至褐色,老孢子显红褐色,平均大小170m230m,n=50.孢壁1层(L1),厚11m(浮载剂为水),参见图1.孢子在PVL、PVLG中橙黄色,Melzers反应为橙黄色,棉兰试剂中呈蓝色.连孢菌丝无色透明,圆柱形,宽7m,直或向孢子一侧弯曲,易与成熟孢子脱离.发芽方式是由连孢菌丝重新生长形成新菌丝.该特征符合球囊霉属Glomus的分6类特征,且与Glomusflavisporum特征描述相一致.形态学上将221A1鉴定为Glomus图1221A1的孢子(a)和孢子壁(b,在PVLG中)Fig.1Sporeshape(a)andsporewa

12、ll(b,inPVLG)of221A12.2单孢DNA提取与NestedPCR以221A1及Gi.margaritaRB的单孢DNA为模板,Geo11和GeoA2为引物进行扩增,由于模板量太少,凝胶电泳检测扩增产物未出现目标带.以NS31和AM1为引物的再次PCR,则能很好的扩增出目标带,目标带大小为550bp,见图2.M:marker;1:221A1;2:Gi.magaritaRB图2单孢子NS312AM1区域PCRFig.2AmplifiedregionofNS312AM1forasinglesporebyPCR2.3测序与系统进化分析以221A1、Gi.margaritaRB孢子的NS3

13、12AM1区域DNA序列在GenBank上进行Blast比对,并与相关菌种构建了系统进化树(图3).图3中显示Gi.margaritaRB与Gi.margarita(AJ567844)聚成一支,序列同源性为9919%,表明两者亲缘关系很近.221A1与未确定种名的Glomussp.(DQ371674)聚成 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 42华南农业大学学报第27卷一支,在所有的比对结果中,221A1与该菌株的同源序列相似率最高,为98%.由于Glomusfla

14、visporum的核酸序列信息未能在GenBank中搜寻到,通过现有序列信息的分析,只能将菌株221A1初步鉴定到Glomussp.221A1和Gi.margaritaRB的NS312AM1区域DNA序列在Genbank中的登陆号分别为DQ139330和DQ187335.于其基因信息数据库还不完善,许多菌种,尤其是标准菌株的基因信息未能进入数据库.AM真菌基因数据库发展缓慢与该类真菌不能纯培养有极大的关系.目前,只能通过从土壤中获取AM菌孢子,并通过繁琐的单孢接种、宿主培养、收集孢子,最终获得纯净的株系后,才能得到其DNA信息.此外,有报道显示,在AM真菌孢子、菌丝的表面及内部存活着大9量的细

15、菌及其他种类的真菌等,这些微生物也给其核酸信息的准确收集带来干扰.为了使AM真菌分子鉴定途径更加可行,一方面要加快AM真菌的营养生理研究,争取早日实现其纯培养,另一方面要通过现有的途径全面收集AM菌种资源的DNA信息,比较分析种群间基因差异,为分子鉴定提供理论基础.致谢:!:,李晓林.丛枝菌根及其应用M.北京:科学图3221A1、Gi.margaritaRB及相关菌株的系统进化树Fig.3Phylogenetictreeof221A1,Gi.margaritaRBandtherel2ativestrains出版社,2000:12198.2KOIDERT,MOSSEB.Ahistoryofres

16、earchonarbuscu2larmycorrhizaJ.Mycorrhiza,2004,14:1452163.3OBAH,TAWARAYAK,SAITOM,etal.Semi2quanti2tativeanalysisofarbuscularmycorrhizalcolonizationofon2ionrootsinoculatedwithsingleormixedspeciesbasedup2onPCR2RFLPJ.SoilSciPlantNutr,2002,48:51256.4REDECKERD.SpecificPCRprimerstoidentifyarbuscu2larmycorr

17、hizalfungiwithincolonizedrootsJ.Mycorrhi2za,2000,10:73280.5YOKOYAMAK,TATEISHIT,MARUMOTOT,etal.Amolecularmarkerdiagnosticofaspecificisolateofanar2buscularmycorrhizalfungus,GigasporamargaritaJ.FEMSmicrobiologyletters,2002,212:1712175.6SCHENCKNC,PEREZY.ManualfortheIdentificationofVesicular2ArbuscularMy

18、corrhizalFungiM.2nded.Gainesville:INVAMUniversityofFlorida,1988:12139.7龙良鲲,羊宋贞,姚青,等.AM真菌DNA的提取与PCR2DGGE分析J.菌物学报,2005,24(4):5642569.8MAWK,SICILIANOSD,GERMIDAJJ.APCR2DGGEmethodfordetectingarbuscularmycorrhizalfungiincultivatedsoilsJ.SoilBiologyandBiochemistry,2005,37:129.9MOHAMEDH,DIRKR,JEANA,etal.Identificationandisolationoftwoascomycetefungifromsporesofthear2buscularmycorrhizalfungusScutellosporacastaneaJ.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2002,68(9):456724573.3AM,对于收集、保护及利用这类微生物资源具有重要的意义.AM真菌与宿主植物严格共生,不能独立完成生活周