第一章 细胞形态研究技术

1、第一章 细胞形态研究技术 显微镜扩大了人们的视野，自从18世纪人们通过显微镜观察到细胞之后，生物学家利用各种各样的显微镜研究细胞的形态和功能。回顾细胞生物学的发展历程，我们可以看出显微镜的不断改良促进了细胞生物学的发展，而细胞生物学的发展对显微镜的性能又不断提出更高的要求。一、光学显微镜技术在细胞学研究中，光学显微镜技术（light microscopy）发挥了重要作用。目前人们将多种现代生物学技术、计算机技术融入光镜技术，使光学显微镜能显示出更细微、更清晰的细胞结构。（一）普通光学显微镜技术光学显微镜一般由光学部分、机械部分和照明部分组成，其中光学部分最为关键，它由目镜（eyepiece）、

2、物镜（objective lens）组成。照明部分主要包括反光镜、聚光镜、光阑三个部分，通过它们可以调节视野的明暗度，有时另附有各种滤光片以控制光的波长范围。机械和支架部分主要由镜座、镜柱、镜筒、调节器和载物台等部分组成，主要起支架和灵活调控的作用。对任何显微镜来说，衡量其性能的主要参数有分辨率（resolution）和放大倍数（magnification）。其中，分辨率是最重要的性能参数，它是指区分开两个质点间的最小距离，这两个质点之间的距离取决于光源的波长、物镜的镜口角（标本在光轴的一点对物镜镜口的张角）和介质折射率N，它们之间的关系是： 通常最大值可达140。，空气中N=1，最短的可见光

3、波长=450nm，此时分辨率D=292nm，约0.3m，若在油镜下，N可提高到1.5，D则可达0.2m，所以普通光镜的最大分辩率是0.2m。 在光学显微镜中，物镜靠近物体，进行第一次放大。目镜靠近眼睛，将物镜放大后的像再进行放大，物体经两次放大后，总的放大倍数为两个放大倍数的乘积。这里要注意的是，是否放大倍数越大，就能看清越小的物体呢？不是。光学显微镜的放大倍数有一个极限，即 超过上值的放大倍数，就是无效放大（empty magnification），因为放大倍数的提高，人眼不能获得新的细微信息。虽然普通光镜有足够大的放大倍数，分辨率可达0.2m，但是动物细胞一般是无色与半透明的，所以样品在观

4、察前要经过染色。不同的染料对某种细胞组分有特异的吸附，这样便能形成足够的反差以区分该种细胞组分。如最常用的染色液苏木精对带负电荷的分子有较强亲和力，因此可揭示出DNA、RNA和酸性蛋白质在细胞中的分布；而伊红和美蓝能特异性地与不同蛋白结合，从而显示出这些蛋白在细胞内的分布情况。（二）相差和微分干涉显微镜技术 光线在通过染色的标本时，其波长和振幅发生变化，因此普通光学显微镜能观察经过染色的生物标本的结构，而活细胞和未经染色的生物标本，当光线通过它时，光的波长和振幅变化不大，所以用普通光学显微镜无法观察到，只有用相差显微镜才能直接观察。1932年，德国物理学家Fritz Zernicke研究发现光

5、线在通过生物标本时，除了波长和振幅的变化外，还有相位的差异，只有将这种相位差转变成振幅差时，才能被人眼分辨出来，即相差理论。将这一理论应用于显微镜，从而发明了相差显微镜（phase congtrast microscope）。相差显微镜最主要的特点就是在其物镜后装有一块“相差板”（phase plate），偏转的光线分别通过相差板的不同区域，由于相差板上不同区域有吸光物质，所以又使两组光线之间增添了新的光程差，从而对样品不同密度造成的相位差起“夸大”作用，最后这两组光线经过透镜又会聚成一束，发生互相叠加或抵消的干涉现象，使活细胞的各种结构出现清晰的反差而被观察到。因为进入物镜的大部分光线被吸收

6、，所以需要一个强光源，也正因此要尽量避免长时间照射，以免伤害活细胞。在实验中，通常应用的是倒置相差显微镜（inverted phase-contrast microscope），它的光源和聚光镜装在载物台上方，相差物镜在载物台下方，这样更便于观察培养瓶中的活细胞。微分干涉显微镜(differential-interference microscope)采用平面偏振光，这些光经棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样品的相邻部位，然后再经过另一棱镜将这两束光汇合，从而将样品厚度上的微小区别转化为名暗区别，并且具有很强的立体感。将微分干涉显微镜接上录象机，可以观察活细胞中的颗粒及细胞器的运动。录像增差

7、显微镜技术(video-enhanced contrast microscop，VEC)是将计算机辅助系统应用于微分干涉显微镜的产物，利用此显微镜可以得到很高的反差，其分辨率比普通光镜提高了一个数量级，这不仅填充了普通光镜与电镜之间分辨率范围的的间隙，而且使在高分辨率下研究活细胞成为可能，例如我们可以利用这种技术来观察微管上颗粒的运动。（三）荧光显微镜技术荧光显微镜（fluorescence microscope）是以紫外线为光源来激发生物标本中的荧光物质，产生能观察到的各种颜色荧光的一种光学显微镜，它是研究特异蛋白质等生物大分子定性定位的最有力的工具之一。在某些自然生物体如叶绿体等中，存在某

8、些天然的特异性蛋白质，它们受到紫外线照射后即可发出可见光，即荧光。我们将细胞本身存在的物质经紫外线照射后发出的荧光称自发荧光。另一些细胞内成分经紫外线照射后不发荧光，但若用荧光染料进行染色后，就能在荧光显微镜下观察到荧光，这种荧光称为诱发荧光。目前可供选择的荧光染料很多，如DAPI（联脒基苯吲哚）可以染DNA；亚啶橙（acridine orange）可以染DNA、RAN；碘化丙啶（propidium iodide）可以染DNA；Hoechest33258、Hoechest33342可以染染色体；四环素可以染骨骼、牙齿等。将荧光染料和抗体共价结合，被标记的抗体和相应的抗原结合形成抗原抗体复合物，

9、经激光激发后发射荧光，从而可以观察了解抗原在细胞内的分布。荧光显微镜常以高压汞灯或弧光灯作为紫外线发生的光源，在光源和反光镜之间置有滤光装置，用来吸收可见光，只让紫外线通过；在目镜前装有另一个滤光片，只容许荧光及可见光通过，将紫外线挡住。（图1）有的荧光显微镜的荧光照明附件能选四种荧光滤色镜，并与分光镜、吸收滤色镜、激发滤色镜组合，使四个荧光波长之间可快速转换，荧光显微镜便可达到高亮度、高清晰度和高对比度。 图1 荧光显微镜原理（四）激光共焦点扫描显微镜技术 激光共焦点扫描显微镜(laser scanning confocal microscope)是20世纪80年代出现的一种新型的显微镜，它

10、是在荧光显微镜成像的基础上装有激光扫描装置，以单色激光作为光源，使样品被激发出荧光，利用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。对于一般的荧光显微镜，来自焦平面以外的荧光使观察到的图像分辨率和反差降低，而激光共焦点扫描显微镜利用激光扫描束经照明针孔形成点光源，经双色镜反射后，通过物镜汇聚到样品某一焦点，该焦点发射的荧光（样品一般经免疫荧光标记）经透镜，在检测器的检测针孔处成像，由检测器收集，其他来自焦平面以外的光则被小孔挡住（图2）。这样形成的图像异常清晰，其分辨率比普通荧光显微镜提高1.41.7倍。 图2 激光共焦点扫描显微镜的原理图A：激光束（光源）经双色镜反射后，通

11、过物镜汇聚到样品某一焦点；B：从焦点发射的荧光（样品一般经免疫荧光标记）经透镜汇聚成像，被检出；C：通过样品其他部位的激光即激光发出的荧光不会聚焦成像，因而检测器不能检出所谓共焦点是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一个小点，即它们互相共焦点。由于可自动改变观察的焦平面，而且纵向分辨率（axial resolution）得到改善，因此可以通过“光学切片”观察较厚样品的内部结构。将改变焦点获得一系列细胞不同切面上的图像，经叠加后便可重构出样品的三维结构。激光共焦点扫描显微镜在研究亚细胞结构与组分等方面的应用十分广泛。二、电子显微镜技术（一）透射电子显微镜 1.基本原理与结构利用光学显微镜无法看清小于0.

12、2m的细微结构，我们把这些细微结构称为亚显微结构(submicroscopic structures)或超微结构(ultramicroscopic structures；ultrastructures)。要看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。1932年Ruska发明了以电子束为光源的透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM），电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短，目前TEM的分辩力可达0.2nm，放大倍数最高可达近百万倍。电子显微镜主要由四部分组成

13、（图3）：电子束照明系统：包括电子枪、聚光镜。由高频电流加热钨丝发出电子，经高压使电子加速，经过聚光镜汇聚成电子束；成像系统：包括物镜、中间镜与投影镜等。它们是若干精密加工的中空圆柱体，里面装置线圈，通过改变线圈的电流大小，调节圆柱体空间的磁场强度。电子束经过磁场时发生螺旋式运动，最终的结果如同光线通过玻璃透镜时一样，聚焦成像；真空系统：用两级真空泵不断抽气，保持电子枪、镜筒及纪录系统内的高真空；记录系统：电子成像须通过荧光屏显示用于观察，或用感光胶片记录下来。 图3 透射电子显微镜的结构组成示意图另外，由于电子在空气里穿透力很弱，所以电镜的镜筒必须抽成真空，否则高速运动的电子核气体分子相互碰

14、撞，会使高速电子散射而偏离轨道，使电镜不能正常工作。电镜镜筒的真空度越高，其使用性能也就越好。2.主要电镜制样技术（1）超薄切片的制备由于电子束的穿透能力有限，为了获得较高分辨率，需要使用超薄切片机制成厚度一般仅为4050nm的超薄切片。这就需要样品有一定的刚性和韧性，为此，样品需要包埋在特殊的介质中。但包埋的过程会破坏样品的结构，因此超薄切片样品制备的第一步就是固定，以便更好地保存细胞地精细结构。固定：固定是电镜样品制备过程中最重要的一个环节，若固定方法选得适当，样品的超微结构尽能十分接近活体状态。目前常用的固定剂为四氧化锇（OsO4）和戊二醛等。由于单一的固定剂并不能固定细胞内所有的组分，

15、因此通常需联合使用不同的固定剂，这样可取得较好的固定效果。戊二醛是一种化学交联剂，其渗透速率较四氧化锇快，它不但能固定蛋白，而且还能固定一些糖类，特别是糖原，因此一般用戊二醛进行前固定。但是戊二醛对大多数脂类的固定作用并不强，而且样品仅用戊二醛固定后，其反差不好，最好再用四氧化锇进行后固定。四氧化锇是一种重金属化合物，能与不饱和脂肪酸反应，是膜结构的最佳固定剂，在随后的脱水过程中四氧化锇被还原形成锇黑，可以使样品的反差增强，但它的缺点是渗透缓慢，对酶活性和抗原活性的破坏较大。固定方法一般采用组织快沉浸固定法，但对于血管丰富、质地较软的组织，如中枢神经系统、视网膜等，一般采用灌注固定法，该方法可

16、使固定液迅速均匀地渗透到组织的各个部分。包埋：包埋的目的是要使样品中各种细微结构在切片中得到均匀良好的支撑，使切成的超薄切片仍能保持连续完整并且有足够的强度，并可耐受干燥以及电子轰击、高温和真空挥发。理想的包埋剂应符合以下几点：第一，在镜下不显示其本身结构；第二，在聚合时不发生明显的收缩，以防止样品中细微结构的损坏和移位；第三，应具有良好的刚性和韧性以利于切片；第四，包埋剂还应易被电子穿透。目前常用的包埋剂是环氧树脂和丙烯酸树脂等。生物样品固定后通常仍含有大量水分，而包埋剂又多于水不相溶，所以在包埋前通常要经过浓度递增的乙醇或丙酮进行脱水。切片：包埋好的组织需用超薄切片机切成超薄切片，其厚度一

17、般是4050nm，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片。切片刀以玻璃或钻石为材料，最常用的是玻璃刀。切片通常收集在覆有支持膜（如透明塑胶膜）的载网（铜网或镍网）上才能在电镜下观察。染色：由于生物样品多是由C、H、O、N等元素组成，这些元素原子序数低，散射电子能力弱，在电镜下的反差很弱，因此通常需用高分子量的金属盐对超薄切片进行染色，以形成明暗反差。用此种方法染色的标本通过电子束振幅的改变观察到黑白图像，而不能像光镜切片染色那样通过改变波长而获得彩色图像。常用的染色液是醋酸双氧铀（易染核酸）和铅盐（易染蛋白质）。（2）负染色技术 一些细小的颗粒标本如线粒体基粒、核糖体、纤维蛋白、病毒等可以通过负

18、染色（negative staining）电镜技术观察其精细结构，其分辨率可达1.5nm左右，它的制备过程如下：首先将样品制成悬液，滴于载网上；其次再用重金属物质将样品包绕起来。由于重金属物质散射电子的能力较样品本身强，所以在电镜下这两者就显示出明显的明暗对比，样品将呈亮色，而周围的背景将呈暗色，这样样品表面的微细结构就被衬托出来。最常用的染色剂是2磷钨酸水溶液。（3）冷冻蚀刻技术冷冻蚀刻（freeze etching）的基本操作过程是将样品用液氮固定后，然后装入专门的冷冻蚀刻仪中，在低温真空状态下进行断裂。这时样品往往从其结构相对“脆弱”的部位（如膜脂双分子层的疏水端）断裂。然后稍稍升温，使

19、断裂面上的冰少量升华，这样埋在冰中的蛋白质颗粒的立体结构就会进一步增强，这一过程称为蚀刻。随后从45。方向用铂、金等金属进行喷镀，这样整个断裂面的微细结构就复印在这层金属薄膜上（又称复型膜），再从垂直方向喷一层碳，加固复型膜，最后用消化液把样品本身消化掉，将剩下的复型膜捞在载网上，干燥后用投射电镜直接进行观察。冷冻蚀刻主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构，其图形富有立体感，并能更好地保持样品地真实结构。在此基础上发展的快速冷冻深度蚀刻技术（quick freeze deep etching）可用于观察胞质中地细胞骨架纤维及其结合蛋白。（三）扫描电子显微镜技术 1.基本原理：20世纪60

20、年扫描电子显微镜（scanning electron microscope,SEM）逐渐引起人们的重视，其电子枪发射出的电子束被电磁透镜汇聚成极细的电子“探针”，在样品表面进行“扫描”，电子束可激发样品表面放出二次电子，二次电子产生的多少与样品的形状有关。二次电子由探测器收集，并被转化成光信号，再经光电倍增管和放大器转变成电压信号来控制荧光屏上电子束的强度。这样，样品不同部位上产生二次电子多或少的差异，直接反映在荧光屏相应部位亮或暗的差别，从而得到一幅放大的立体感很强的图像。（图4） 图4 扫描电镜下的血细胞2.制样技术 扫描电子显微镜用来观察样品表面的形貌，如何保持样品表面不皱缩、不塌陷是制

21、样的关键。而生物样品在干燥过程中由于表面张力的作用极易发生变形，解决这一问题最常用的是CO2临界点干燥法。众所周知，每一物质存在着一个“临界状态”，如若将水置于密闭容器内，当温度不断上升，容器内蒸汽压力不断升高时，气态水分子不断增多，其密度越来越大，当气态与液态密度达到一致，两相界面消失，我们把这一状态称为临界状态，此时的温度称为临界温度，此时的压力称为临界压力。在临界状态时，气-液相界面消失，物质的表面张力系数为零，这时的气体无论在多大压强下，都不会变成液体。含水样品处在这样高密度蒸汽下，缓慢放气和减压，最后使样品内的水分子全部气化而达到干燥。由于水的临界温度和临界压力太高，所以要用一种临界温度和压力都较低的有机溶剂作媒介，先将样品中的水置换出来，再用与有机溶剂互溶性较好的CO2置换此有机溶剂来进行临界点干燥。这就是C