川芎嗪对再生障碍性贫血小鼠骨髓细胞粘附分子作用研究

1、    川芎嗪对再生障碍性贫血小鼠骨髓细胞粘附分子作用研究        【摘要】目的探讨免疫介导再生障碍性贫血(再障)小鼠骨髓细胞粘附分子表达及川芎嗪对其影响。方法建立免疫介导的再障小鼠模型,腹腔注射磷酸川芎嗪注射液,每次5 mg,每日2次,第14天用流式细胞仪检测小鼠骨髓单个核细胞CD49d、CD49e的表达水平,用免疫组织化学SABC方法检测骨髓基质细胞VCAM-1的表达。结果27只BALB/c小鼠，平均分为3组。再障组CD49d、 CD49e49e和VCAM-1已近正

2、常。结论川芎嗪能增强免疫介导再障小鼠骨髓造血细胞和基质细胞粘附分子的表达,有利于造血细胞的增生。【关键词】贫血, 再生障碍性胞间粘附分子造血系统川芎嗪 Study on the effect of ligustrazine on adherent molecule expression of bone marrow cells in immune-mediated aplastic anemia miceDONG Lingli,LIU Wenli,SUN Hanying,et al.Department of Internal Medicine, Tongji Hospital,Tongji

3、Medical University,Wuhan430030【Abstract】ObjectiveTo explore the effect of ligustrazine on the expression of adherent molecule of bone marrow cells in immune-mediated aplastic anemia(AA) mice.MethodsEach immune-mediated AA mouse was intraperitoneally injected with 5 mg ligustrazine twice a day.On the

4、 14th day,expressions of CD49d and CD49e in bone marrow mononuclear cells(MNC) were detected by flow cytometry,and VCAM-1 on stromal cells by immunohistochemistry SABC. ResultsExpressions of CD49d,CD49e and VCAM-1 were significantly lower in AA group than in normal group(t=11.96,17.18 and 7.09 respe

5、ctively,P<0.001),and were much higher in ligustrazine treated group than in non-treated group(t=9.05,14.61 and 6.91 respctively,P<0.001).Expressions of CD49d and VCAM-1 were in the normal range in ligustrazine group.ConclusionsLigustrazine can increase the expression of adherent molecule of bo

6、ne marrow cells in immune-mediated AA mice,thus promote the growth of hematopoietic cells.【Key words】Anemia,aplasticIntercellular adhesion moleculeHematopoietic systemLigustrazine造血干细胞的增殖和分化高度依赖骨髓微环境产生的调节分子的相互作用,其中,造血干细胞的粘附受体与基质细胞和细胞外基质上的粘附配体起关键作用1。为此,我们研究了免疫介导再生障碍性贫血(再障)小鼠骨髓造血细胞粘附分子CD49d和CD49e及其基质细

7、胞上血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)的表达及川芎嗪对其表达的影响,进一步探讨促进再障骨髓恢复造血的机制和治疗方法。材料和方法1实验动物近交系BALB/c小鼠(H-2d,MLSb),雌性,810周龄,体重1720 g,由武汉生物制品研究所提供。DBA/2小鼠(H-2d,MLSa),8周龄,雌雄兼用,由中山医科大学实验动物中心提供。2药物磷酸川芎嗪注射液每毫升含川芎嗪25 mg,由丽珠集团利民制药厂生产(批号971002)。3试剂和仪器大鼠抗小鼠CD49d(VLA4),CD49e(VLA5),CD106(VCAM-1)单克隆抗体和羊抗大鼠免疫球蛋白FITC结合抗体购自PharMigen公司,流

8、式细胞仪为Becton Dickinson公司产品, SABC(Strept Avidin-Biotin-enzyme Complex)购自Boster公司,氢化可的松购自Sigma公司。4分组及处理BALB/c小鼠27只,随机平均分为3组。川芎嗪组:按姚军等方法2制备再障小鼠模型后即腹腔注射川芎嗪注射液,每只5 mg,每天2次,连续13天; 再障组:按以上方法制模后即腹腔注射生理盐水,每只0.2 ml,用法如上;正常组:未作任何处理。第14天称体重后观察下述指标。5骨髓有核细胞(BMNC)计数参照文献3方法。6骨髓单个核细胞(MNC)粘附分子CD49d、CD49e表达的检测调骨髓MNC浓度为

9、1×107/ml,按左连富介绍的方法4,用流式细胞仪检测CD49d、CD49e结果表1显示,再障组小鼠白细胞计数,骨髓有核细胞计数均显著低于正常。 再障组骨髓MNC上CD49d、CD49e49d、CD49e49e的表达已达正常。川芎嗪组基质细胞表达VCAM-1的阳性率已近正常,且显著高于再障组(t=6.91,P<0.001)。川芎嗪组与正常组一样,基质细胞生长浓密,以梭形成纤维细胞为主;再障组基质细胞凋零稀疏,多为圆形细胞,成纤维细胞的伪足不明显。表1川芎嗪对免疫再障小鼠骨髓单个核细胞CD49d、CD49e组别鼠数WBC(×109/L)骨髓MNC(×106/

10、根股骨)CD49d(荧光强度)CD49e(荧光强度)VCAM-1(%)正常组96.4±0.812.8±1.756.55±5.1454.42±0.9561.4±12.1再障组91.5±0.72.7±0.634.50±2.0435.27±2.4828.1±7.2川芎嗪组92.9±0.7*6.2±0.4*47.38±3.75*56.19±2.99* 56.7±10.1*      注: 与正常组比较P<0.

11、001；*与再障组比较P<0.001 讨论基质细胞与造血细胞的直接连接有传递转换信息分子的作用,此种连接是通过基质细胞与造血细胞表面的粘附分子实现的6,细胞粘附分子VLA5(Very Late antigen)是红系祖细胞的纤维连接蛋白(Fn)的受体, VLA4是髓系造血祖细胞的Fn及VCAM-1的受体。 90%以上的CD34+细胞，包括红系爆式集落(BFU-E)和粒-巨噬系集落(CFU-GM)都表达VLA4和VLA51。VCAM-1表达于骨髓微环境网状纤维细胞和骨髓微血管内皮细胞上。 VCAM-1在调节造血中有重要作用,参与造血细胞与基质细胞形成聚集体7,有利于造血细胞增殖、分化。本研

12、究结果显示再障小鼠骨髓造血细胞粘附分子受体VLA4、VLA5显著低于正常小鼠,再障小鼠骨髓基质细胞上VLA4的配体VCAM-1也显著低于正常小鼠。因此, 如能增强VLA4、VLA5及VCAM-1的表达,将有助于骨髓造血细胞与基质细胞及细胞外基质的粘附,促进造血干细胞的增生。我们曾观察到川芎嗪通过促进骨髓微血管的修复,增加骨髓供氧,促进基质细胞生长及其粘附功能,改善骨髓微环境,增加免疫介导再障小鼠骨髓细胞CD34抗原表达5,8。本研究结果进一步表明川芎嗪显著增强再障小鼠骨髓造血细胞VLA4、VLA5的表达,同时增加基质细胞VCAM-1的表达,说明川芎嗪不仅作用于基质细胞,提高粘附分子配体表达,同

13、时作用于造血细胞,提高其粘附分子受体的表达,从而加强基质细胞与造血细胞相互作用,促进骨髓造血细胞的增生。本课题受国家自然科学基金 (39670911)和湖北省自然科学基金(96J080)资助作者单位：董凌莉刘文励孙汉英徐慧珍430030武汉, 同济医科大学附属同济医院内科；陶德定同济医科大学附属同济医院分子生物学研究室参考文献1Clulombel L, Auffray I, Gaugler MH, et al. Expression and function of integrins on hematopoietic progenitor cells. Acta Haematol,1997,9

14、7:13-21.2姚军,李树浓.淋巴细胞与再生障碍性贫血的实验研究. 中华血液学杂志， 1991,12:229-231.3唐佩弦,杨天楹,主编. 造血细胞培养技术.西安：陕西科学技术出版社, 1985.59-62,147-160.4左连富.流式细胞术样品制备技术. 第1版. 北京: 华夏出版社,1991.83,94-95.5孙汉英,舒砚君,刘文励,等. 川芎嗪改善免疫诱导再生障碍性贫血小鼠骨髓微环境作用的研究. 中华血液学杂志, 1998,19:178-180.6Weber MC, Tykocinski ML. Bone marrow stromal cell blockade of human leukemic cell differentiation. Blood, 1994,83:2221-2229.7Oostendorp RA, Reisbach G, Spitzer E, et al. VLA-4 and VCAM-1 are the pr