王素梅开题报告

1、  辽宁医学院研究生学位论文开题报告书（科学学位）     坎地沙坦酯对糖尿病大鼠肾脏氧化应激及MCP-1表达的影响     姓 名：王素梅导 师：冯 玉教授 专 业：药理学学位类型：基础医学科学硕士学位研究方向：糖尿病并发症药理    2011年11月30日  一、摘要 糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)系糖尿病严重的并发症，也是造成其死亡率增加及患者生存质量下降的主要原因之一。其机制尚未完全阐明。

2、氧化应激、肾素一血管紧张素一醛固酮系统(RAAS)、炎症因子、细胞内钙离子变化等参与了DN的病理过程，其中活性氧族(reactive oxygen species，ROS)增加及机体炎症反应在糖尿病继发性病变中发挥着重要的生物学作用。近年来的研究认为，肾小球中由于单核细胞趋化蛋白l(MCP-l)合成和分泌增加，从而趋化和激活单核/巨噬细胞和部分T淋巴细胞，吸引其向病变部位的聚集、浸润，经一系列炎症反应，形成免疫复合物，以及补体活化等，导致细胞外基质(ECM)在肾小球和肾小管间质堆积，参与了DN的发生、发展。本实验通过一次性链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)腹腔注射的方法建立糖尿

3、病大鼠模型，并应用坎地沙坦酯（Candesartan）干预治疗。观察坎地沙坦酯对糖尿病大鼠氧化应激及尿MCP-1的水平、肾组织MCP-1蛋白表达及肾脏结构、功能的影响，探讨坎地沙坦酯肾脏保护作用及可能机制。二、立题依据1、课题研究背景糖尿病肾病是糖尿病最常见、最严重的慢性并发症，随着糖尿病发病率的逐年提高，DN已成为导致终末期肾病的主要病因之一。DN发病机制尚不十分明确，氧化应激损伤在糖尿病肾病中的作用已得到证实。此外，近年研究表明糖尿病（DM）患者机体存在低度慢性炎症，糖尿病慢性并发症与炎症因子的增加密切相关。坎地沙坦酯作为一种血管紧张素受体拮抗剂，可在受体水平完全阻断Ang的作用，对肾脏有

4、保护作用，但其作用机制目前仍不完全明确。因此，本实验通过建立糖尿病大鼠模型，并应用坎地沙坦酯（Candesartan）干预治疗。观察坎地沙坦酯对糖尿病大鼠氧化应激及尿MCP-1的水平、肾组织中MCP-1的蛋白表达及肾脏结构、功能的影响，探讨坎地沙坦酯肾脏保护作用及可能机制。2、目前国内外研究现状及分析DN早期病理特征是肾小球肥大、基底膜增厚和肾小球系膜区细胞外基质(extracelluar matrix，ECM)堆积，晚期则表现为肾小球硬化和间质纤维化。 DN的病因和发病机制至今尚未完全阐明，近年来研究认为DN是在高血糖状态下肾内糖代谢紊乱与血流动力学因素共同参与、相互作用的结果，近年研究揭示

5、DN的发病在代谢紊乱与血流动力学机制基础上，炎症机制是其持续发展的关键因素。DN早期对肾内血液动力学改变方面起着非常重要作用的肾局部肾素-血管紧张素系统（RAS）在其后期的病程发展中的推动作用与其触发炎症反应相关。已有研究证实，糖尿病处于一种慢性低水平的炎症状态。众多的临床研究显示,糖尿病常伴有多种炎症因子浓度的升高, 炎性标志物能够预测糖尿病的发生。Leinonnen等通过试验证明糖尿病患者的CRP、白介素-6等炎症因子水平较正常对照组明显升高。Freeman等提出, 在中年男性中CRP是独立于糖尿病其它危险因素的预测糖尿病发生的物质。此后, 大量临床流行病学调查进一步证实了多种炎症因子可以

6、预测糖尿病的发生。亦有试验证明抗炎治疗可明显改善糖尿病患者炎症反应及并发症。研究表明单核/巨噬细胞的趋化积聚对最后的肾脏损伤有着重要影响，MCP-1被认为是引起其作用的重要调节因子，影响着巨噬细胞浸润和肾小球硬化，与其有相关联的通路成为近年来研究的方向。坎地沙坦酯作为一种血管紧张素1型受体拮抗剂，可在受体水平完全阻断Ang的作用，对肾脏有保护作用，但其作用机制目前仍不完全明确。本研究通过观察探讨坎地沙坦对糖尿病肾脏氧化应激及MCP-1表达的影响，进一步探讨坎地沙坦（Candesartan）对糖尿病肾病的保护作用机制。3、课题研究的目的、意义已有研究表明，炎症反应在糖尿病肾病发生发展中起重要作用

7、。其中重要的致炎因子血管内皮生长因子（VEGF）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和结缔组织生长因子（CTGF）等参与介导DN的发生和炎症损伤。因此，抑制这些致炎因子或其相关信号通路，可做为预防或延缓糖尿病肾病的重要策略之一。本课题观察坎地沙坦酯对糖尿病肾脏氧化应激以及MCP-1表达的影响，旨在探讨坎地沙坦酯对糖尿病肾病的保护作用及机制，从而为糖尿病肾病的发生机制和临床治疗提供实验性理论依据。三、 研究内容及创新点研究内容：1.       研究坎地沙坦酯对糖尿病肾脏氧化应激的作用。2.    

8、;   观察坎地沙坦酯对糖尿病尿MCP-1的水平、肾组织MCP-1蛋白表达的影响3.       观察坎地沙坦酯对糖尿病肾脏结构、功能的影响。创新点：1.       研究坎地沙坦酯对糖尿病肾脏氧化应激的作用。2.       观察坎地沙坦酯对糖尿病肾组织MCP-1蛋白表达、尿MCP-1的水平的影响，探讨坎地沙坦酯肾脏保护作用及可能机制。四、技术路线   SD大鼠40只DM坎地

9、沙坦酯低剂量组5mg/kg/d坎地沙坦酯高剂量组10mg/kg/d NC1% STZ溶液50mg/kg枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液测血糖、尿白蛋白、肌酐24h尿蛋白排泄率(UAER) 病理变化尿MCP-1测定MCP-1的蛋白表达及半定量分析ELISA法免疫组化法Western印迹法PAS染色肾重/体重、氧化应激指标检测尿MCP-1测定                     

10、0;       五、研究方案1糖尿病大鼠模型的制备及分组 健康SD大鼠40只，雄性200250g左右（由辽宁医学院实验动物中心提供），适应性饲养1周后，随机分为3组，正常对照组（NC）10只，糖尿病模型组（DM）10只， 坎地沙坦酯用药组（Cand）20只（低、高剂量组各10只）。DM组和Cand组均一次性给予链脲佐菌素（Sigma 公司）50mg .kg-1（体重）左下腹腔注射，72h后尾静脉取血，用血糖仪测血糖，血糖16.7mmol.L-1，尿糖阳性者定为糖尿病大鼠模型。NC组给予等量柠檬酸缓冲液尾静脉注射。DM大鼠成

11、模后1周，Cand组按低、高剂量分别给予坎地沙坦酯5 、10mg.kg-1.d-1,溶于0.9%氯化钠溶液1.5 mL，灌胃1次，连续12周。DM组及NC组以等量生理盐水灌胃。各组大鼠均给标准饲料喂养，自由饮水，每两周测一次血糖。表 1 实验动物分组组 别动物数（只）灌胃正常对照组（NC）10生理盐水糖尿病组(DM)10生理盐水坎地沙坦酯低剂量组（Cand1）105 mg.kg-1.d-1坎地沙坦酯高剂量组（Cand2）1010mg.kg-1.d-12、标本收集饲养12周后，用代谢笼准确收集24h尿标本，记录尿量，禁食12h后称重。用20乌拉坦(5 mL.kg-1)麻醉大鼠，颈总动脉取血2ml

12、，离心10min( 3000r.min-1)，分离血清，-80保存备用。肾脏称重后，以冰生理盐水冲洗干净，分离皮、髓质，左肾皮质冻存于-80 冰箱中备用，右肾皮质以10%中性甲醛溶液固定，PBS冲洗 ,石蜡包埋 ,制成4m切片备用。3.具体检测方法3.1 血糖、血肌酐、24小时尿白蛋白排泄率(UAER)测定采用日立7180全自动生化分析仪测定血肌酐。采用尿微量白蛋白检测试剂盒（胶体金法）测定24小时尿白蛋白，UAER=尿白蛋白水平（g.mL-1）×24h尿量（mL）。3.3肾组织MDA 含量、SOD 、GAT 、GSH-Px活性测定丙二醛（MDA）用硫代巴比妥酸（TBA）法，超氧化物

13、歧化酶（SOD）活性用黄嘌呤氧化酶法，过氧化氢酶（GAT）活性用化学比色法，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性用二硫代二硝基苯甲酸法，均严格按照试剂盒说明书进行操作。3.4肾组织形态学观察取肾组织，用10%甲醛溶液固定，特殊脱水处理，浸蜡包埋，按下列步骤行PAS染色：常规切片厚2 m3 m，脱蜡至水；0.5高碘酸氧化6 min8 min，蒸馏水洗; 无色品红加盖避光染7 min10 min，不经水洗，擦净组织旁多余染液; 0.5偏重亚硫酸钠作用1 min，水洗2 min5 min; Harris苏木素复染1 min左右，水洗; 1盐酸酒精分化片刻，自来水反复洗; 温水返兰，梯度酒精脱水，二

14、甲苯透明，中性树胶封片。光镜观察（×100）随机采集100个肾小球，根据系膜基质增宽的程度行半定量评分：0=正常肾小球；1=系膜增宽面积25%(轻度)；2=系膜增宽面积在25%50%之间（中度）；3=系膜增宽面积在50%75%之间（中度至重度）；4=系膜增宽面积在75%100%之间（重度）。3.5免疫组化方法检测MCP-1蛋白表达石蜡切片标记编号后置于60烤片机中 90min二甲苯二甲苯每次均 10-15min100%酒精 2-5min100%酒精 2-5min95%、95%、90%、80%酒精每次 2-5min蒸馏水 2-5minPBS 2-5min高压热修复 2min自然冷却 3

15、0min滴加正常小羊血清封闭液，室温20分钟甩去多余液体，不洗滴加适当稀释的抗室温静置1小时或4过夜或371小时PBS洗3次各2分钟滴加生物素化抗，37 20min，PBS洗3次各2min滴加试剂SABC 37 30minPBS洗3次各2minDAB显色：试剂盒或自配显色剂显色脱水、透明、树胶封片、镜检贴标签镜检及保存。阴性对照用PBS代替抗。采用CM-2000B生物医学图像分析系统测量切片MCP-1的平均灰度值。3.6western印迹检测MCP-1蛋白表达及半定量分析取大鼠肾组织，立即放入预冷的裂解缓冲液中 1 % Triton，0.1 % SDS，0.5 %去氧胆酸，EDTA 1 mmo

16、l·L-1，Tris ( pH 7.4) 20 mmol·L-1，NaCl 150 mmol·L-1，NaF 10 mmol·L-1，苯甲基磺酰氟化物（PMSF）0.1 mmol·L-1 ，4 超声粉碎后，12000× g 离心30 min，取上清，用Lowry 法测定蛋白质含量，以牛血清白蛋白（BSA）为标准品，将各组蛋白浓度调成一致。用10 %12 %的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质，每个泳道蛋白上样量为20 g。为了准确判断目的蛋白带的位置，一个泳道加SeeBlue Plus 2 预染蛋白标记物，电泳后

17、将PAGE凝胶中的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上，取出后将膜放入3 % BSA阻断缓冲液中，封闭60 min，再用TBS Tris (pH 8.0) 10 mmol·L-1，NaCl 150 mmol·L-1 洗膜3次，每次10 min。将膜放入一抗中（抗体1:500稀释），4 过夜。TTBS冲洗后，将膜放入二抗(二抗均1:500稀释)中，室温孵育1-2 h，然后用TTBS洗膜3次，每次10 min。将膜在SuperSignal West Pico底物工作液中孵育5 min，吸干多余试剂，放置化学发光凝胶系统分析仪中进行Ecl 化学发光。测定MCP-1。每个抗体测定时都进行-

18、肌动蛋白测定，以保证蛋白上样量的一致性。利用Visionworks 6.3.3.图像采集及分析软件对蛋白带进行分析。实验重复3次。4、数据处理方法实验数据用 表示，用SPSS11.0软件进行统计学分析。采用one-way ANOVA和LSD-t 检验进行两两比较。5、质量控制方法严格遵循实验操作方法及实验仪器操作规则。（1）实验设置正常对照组，不添加任何干预因素，以减少非处理因素对实验结果的影响。 （2）实验组和对照组的选取完全采取随机原则，使非处理因素对实验组和对照组的影响是相当的。 （3）在相同的条件下，进行多次实验，提高实验结果的可靠性。六、主要仪器设备和试剂链脲佐菌素（STZ）美国Si

19、gma公司坎地沙坦酯美国Sigma公司血糖仪及试纸美国强生系列CM-2000B生物医学图像分析系统北京大恒图有限公司酶标分析仪中国LEICA-RM2135石蜡切片机德国莱卡公司全自动免疫组化染色仪美国DAKOCYTOMSTION低温离心机德国Eppendorf公司日立7180全自动生化分析仪日立公司BIO-RAD电泳槽美国伯乐 七、课题前期研究基础及可行性分析1、课题前期研究基础：（1）糖尿病大鼠的成功造模。（2）已熟练掌握课题中实验。2、可行性：（1）辽宁医学院药理研究室拥有先进的设备。为本课题的研究奠定了良好的基础。本人广泛查阅了相关文献报道，对本实验的目的、原理及实验方法有了一

20、定程度的了解，对实验中可能出现的一些困难有了一定的解决能力。药理研究室的老师在该领域有着很丰富的经验，能够给予本人指导。（2）通过查阅国内外相关文献，已基本了解了实验相关技术。（3）实验所需的仪器及设备基本具备，辽宁医学院动物中心可提供实验动物，各种药品、试剂可从相关厂家购到。（4）已掌握SPSS统计软件的使用方法。八、课题中关键问题及解决的措施1、动物模型制备以及喂养过程中死亡。需要老师指导动物模型制备，优化饲养条件，以达到实验要求。2、光镜、免疫组化结果不理想。实验前熟练技术流程，实验过程中严格操作，并请教有关老师及同学帮助。3、western检测结果不理想。实验前熟练技术流程，严格掌握实验条件以及所需试剂的质量。九、年度研究计划         2011.11-2012.01 查阅文献，写综述         2012.02-2012.4 开题报告，预实验