寨卡提取物体外对人结肠癌细胞凋亡的诱导作用及其作用机制研究

1、寨卡提取物体外对人结肠癌细胞凋亡的诱导作用及其作用机制研究         作者：江南，曾瑾，清源，罗霞，杨志荣 【摘要】 目的研究寨卡提取物诱导人结肠癌LoVo细胞凋亡的作用，并对其可能的作用机制进行探讨。方法以寨卡提取物作用于人结肠癌LoVo细胞，采用MTT法分析寨卡提取物对LoVo肿瘤细胞的抑制生长作用；采用Annexin V-FITC荧光染色实验             

2、0;           作者：江南，曾瑾，清源，罗霞，杨志荣【摘要】  目的研究寨卡提取物诱导人结肠癌LoVo细胞凋亡的作用，并对其可能的作用机制进行探讨。方法以寨卡提取物作用于人结肠癌LoVo细胞，采用MTT法分析寨卡提取物对LoVo肿瘤细胞的抑制生长作用；采用Annexin V-FITC荧光染色实验，考察细胞在药物作用下的质膜变化，对提取物诱导LoVo细胞凋亡进行检测；采用比色法测定寨卡提取物对人大肠癌LoVo肿瘤细胞内还原型谷胱甘肽（GSH）的耗竭作用和对谷胱甘肽-S转移酶（G

3、ST）的诱导作用；同时利用DCFH-DA探针，检测LoVo肿瘤细胞给药后的活性氧水平；应用Western蛋白印迹法检测Caspase-3和Caspase-9蛋白的表达。结果寨卡提取物具有明显的体外抗肿瘤活性，并呈剂量依赖关系，IC50为550g·ml-1。该药物可通过改变细胞质膜，耗竭细胞内谷胱甘肽含量，增加谷胱甘肽S转移酶含量，上调肿瘤细胞内活性氧水平等途径，提高Caspase-3和Caspase-9蛋白的表达，诱导LoVo细胞发生凋亡。结论寨卡提取物可诱导LoVo细胞凋亡，其作用机制可能通过耗竭细胞内GSH 的含量，以ROS为介导直接作用于细胞线粒体，诱导凋亡的产生。寨卡提取物对

4、LoVo细胞凋亡的诱导作用还可能与其增加Caspase-3和Caspase-9蛋白表达有关。 【关键词】  寨卡 细胞凋亡 结肠癌 LoVo细胞Abstract：ObjectiveTo study the induction of the extract from Thlaspi arvense Linn.(ZAF) on apoptosis in human colorectal carcinoma LoVo cells and its mechanisms in vitro.MethodsMTT assay was employed to evaluate the surviva

5、l of LoVo cells. The induction of apoptosis was detected by Annexin V-FITC staining. The depletion of glutathione (GSH) and the induction of glutathione-S-transferase (GST) effects of ZAF in LoVo cells were dectected. The level of reactive oxygen species (ROS) in LoVo cells was analyzed with DCFH-DA

6、 as probe. The protein expressions of Caspase-3 and Caspase-9 in LoVo cells were assayed by Western blot. ResultsZAF effectively inhibited LoVo cell viability in vitro and induced LoVo cells apoptosis in a dose-dependent manner, and IC50 was 550g·ml-1. ZAF could obviously deplet the level of GS

7、H level, increase activity of GST, and accumulate ROS in LoVo cells. Over-expression of Caspase-3 and Caspase-9 mediated by ZAF in a concentration-dependent manner were observed. ConclusionZAF can induce apoptosis of LoVo cells, which is relative to the changes of the cells redox states and upregula

8、ting Caspase-3 and Caspase-9 expression.Key words：Thlaspi arvense Linn.  apoptosis；  Human colorectal carcinoma；  LoVo cells    寨卡是一味常用藏药，为十字花科植物Thlaspi arvense Linn.的干燥成熟种子。在传统藏医药应用中，寨卡性辛、微温，具有散风明目，活络通痹，温补五脏，清肺热、肾热，健胃之功效，主要用于治疗目赤肿痛流泪，肺热，咳嗽，肾热，淋病，消化不良，呕吐等病症。目前针对寨卡化学成分缺乏

9、系统细致的报道，仅通过初步的植物化学研究所知，寨卡含黑芥子苷（Sinigrin），又含脂肪油34，挥发油0.836，蔗糖1.8，卵磷脂1.6等1。本课题组的前期研究工作发现，寨卡中含有活性强烈的抗肿瘤成分，其有效部位为十字花科植物中富含的硫代葡萄糖苷（glucosinolate）类物质2，该有效部位提取物ZAF体外抗肿瘤作用与其抑制细胞增值和诱导细胞凋亡有关3，本研究对寨卡提取物诱导LoVo 肿瘤细胞凋亡的作用靶点和影响途径进行研究，以探讨寨卡提取物诱导细胞凋亡的作用机制，为开辟寨卡新的药用途径奠定理论基础。1  材料与仪器1.1  药品与试剂寨卡有效部位提取物（activ

10、e fractions of pennycress，ZAF），由四川省中医药研究院中药细胞与分子生物学实验室提供。RPMI-1640培养基（GIBCO公司）；小牛血清（HyClone公司）；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（购自碧云天生物技术研究所）；谷胱甘肽-S转移酶测定试剂盒、还原型谷胱甘肽（GSH）测定试剂盒（购自南京凯基生物科技发展有限公司）；活性氧检测试剂盒（购自北京普利莱基因技术有限公司）；兔抗肌动蛋白（-actin）、鼠抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-3），兔抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-9）抗体、抗小鼠IgG、及抗兔IgG均为Santa

11、Cruz产品；ECL检测底物I和II（Pierce公司）；台盼蓝，MTT，SDS，胰蛋白酶，EDTA·4Na均购自Sigma公司；青霉素，庆大霉素及其它试剂均为国产分析纯；硝酸纤维素膜(博士德)。1.2  仪器与设备倒置显微镜（Nikon，TS10）；二氧化碳细胞培养箱（Heraeus，BB5060UV）；酶标仪（Themo Electron，Multiskan）；垂直电泳槽(Bio-rad Mini-PROTEAN 3)；转印槽(Bio-rad Trans-blot)；凝胶成相系统（Bio-Rad，ChemiDoc XRS）；电泳电源(Bio-rad Powerpac B

12、asic)。2  方法2.1  细胞培养人结肠癌细胞LoVo（ATC编号：CCL-229），购于南京凯基生物科技发展有限公司。在本实验室常规培养于含10小牛血清的RPMI-1640培养液培养中（青霉素100 KU·L-1，链霉素100 mg·L-1），放置于37，5CO2的培养箱下，取对数生长期细胞进行实验。2.2  细胞增殖抑制作用的检测LoVo细胞（5.0×104个细胞/孔）接种于96孔板，用不同浓度的ZAF作用48 h后，采用MTT法4，酶标仪于570 nm波长处测定各孔吸光度（A570），每个浓度组设3个复孔，细胞抑制率（%）

13、= （对照组A-实验组A）/（对照组A-空白组A）×100%。并计算IC50。实验重复3次。2.3  Annexin V-FITC/PI荧光双染色取对数生长期 LoVo 细胞，按5×105个/孔接种于24孔平底细胞培养板，预培养24 h。设置3个药物作用浓度，分别为300，550，1 000 g·ml-1，每种浓度设3个平行孔，同时做阴性对照孔（加细胞和培养液，不加药物；即药物浓度为0 g·ml-1）。加药后继续培养36 h。利用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒对LoVo细胞死亡时质膜变化进行荧光染色检测。2.4  We

14、stern蛋白印迹法分析Caspase-3、Caspase-9蛋白的表达LoVo细胞与不同浓度的ZAF作用36 h（200，400，800，1 000g·ml-1）后，离心收集，按照试剂盒说明书提取细胞总蛋白，用Bradford法测定蛋白浓度，采用Western蛋白印迹法检测Caspase-3、Caspase-9蛋白的表达5，以肌动蛋白（-actin）作为内标。2.5  LoVo肿瘤细胞内谷胱甘肽含量的检测取对数生长期 LoVo 细胞按1×106个/瓶接种于50 ml平底细胞培养瓶，预培养24 h。设置3个药物作用浓度，分别为300，550，1 000 g

15、3;ml-1，同时做细胞阴性对照瓶（细胞和培养液）和阳性药物对照瓶（顺铂，药物浓度为10 g·ml-1）。加药后继续培养24 h。利用还原型谷胱甘肽（GSH）测定试剂盒对LoVo肿瘤细胞内谷胱甘肽含量进行测定。2.6  LoVo肿瘤细胞谷胱甘肽-S转移酶的测定取对数生长期LoVo细胞，按1×106个/瓶接种于50ml平底细胞培养瓶，预培养24 h。设置3个药物作用浓度，分别为300，550，1 000 g·ml-1，同时做细胞阴性对照瓶（细胞和培养液）。加药后继续培养36 h。利用谷胱甘肽-S转移酶测定试剂盒对LoVo肿瘤细胞谷胱甘肽-S转移酶进行测定。2.7  LoVo肿瘤细胞活性氧