青蒿素合成生物学及代谢工程研究进展曾庆平

1、2011 年 第 56 卷 第 27 期：2289 2297中国科学杂志社SCIENCE CHINA PRESS 评 述青曾庆平,生物学及代谢工程研究进展中管理局原虫与, 广州 510405;大学热带医学, 广州 510405 广州中: qpzeng2011-06-03 收稿, 2011-08-08 接受自然科学基金(30870072, 30672614)和留学回国科技活动择优项目(2009 年度)资助摘要青途径重建, 在生物途径仅见于青生物(如酵母)中但其“上游”途径为生物所共有, 可望通过“下游”青. 过去 10 年来, 青青 酸及双氢青 酸等青被国内外研体. 由于酵的唯一青酵母工程菌转青

2、生物学代谢工程究团队陆续克隆并导入酿酒酵母细胞, 已母缺乏适宜的细胞环境, 尚不能将青体转变成青. 因此, 青 依然是青来源, 凸显出继续开展青 种质遗传改良的必要性. 我国科学家采用“开源”或“节流”等策略,已相继培育出多种转青 植株或品系, 为实现青的高产、稳产奠定了坚实的基础. 同时, 青生物的限速步骤尤其是终端反应机制已基本得到阐明, 有助于开展青形成与积累的环境模拟及仿生, 从而为彻底缓解青的供求创造先机. 本文最后讨论了产青体微生物专利的作用及中国避免这些专利壁垒的方法.青(artemisinin)是中国科学家于 20 世纪 70开展了青生物学及代谢工程研究, 一方面途径5,年代从

3、传统中草药青 或称黄花Artemisia annua尝试在微生物体内重建青方面对青 中原有的青改良6.生物生物另一L.)中分离提纯的抗疟有效单体, 其化学本质是含有“过氧桥”结构(1,2,4-三噁烷环)的倍半萜内酯1. 以青途径进行遗传母核经人工半获得的青琥酯)、青甲醚(甲醚)、青琥珀酸酯(青乙醚(乙醚)在 Bill & Melinda Gates 基金赞助下, 由 One World Health 非赢利组织主导, 在 Amyris Biotechno- logies 公司和 Sanofi-Aventis 公司参与下, 美国加州大类, 血中溶解性好, 生物和双氢青等青利用度高, 对氯喹抗性疟

4、疾及致命性脑型疟有特效,学伯克利分校 Keasling 研究小组会同植物生物已成为世界卫生组织(WHO)倡导的“基于青的联技术产青Covello 研究小组, 于 2004 年启动了以高合疗法”(artemisinin-based combination therapies, ACTs)酵母工程菌构建为目标的“青项目” (The首选的抗疟新药, 其中青 琥酯、 甲醚及方已被列入 WHO “基本药品目录”2.甲醚复Artemisinin Project).及双氢青 酸等青该项目实施至今已获得产青 酸体的工程酵母菌7.青分布地域狭窄, 青含量低(0.01%, 迄今仍无法将修饰酵母菌所产青0.5%).

5、 化学全球疟疾 逐年升高3,青产率不理想, 成本高. 随着素前体转变成青, 表明在青 中开展转研(3.8 亿人/年)和率(4600 万人/年)究仍然是一个不可忽略的重要方向, 为此已育成青青 植株或品系8. 同时,青类抗疟药需求量迅猛增长, 导致含量大幅提高的转青原料药供不应求, 市场价格飙升4. 近 10 年来,英国约克大学的 Bowles 小组已绘制出青 的遗传图为了从根本上解决青的供需, 国内外争相谱, 并鉴定出青高产相关, 为指导青高).Sci Bull英文格式: Zeng Q P, Bao F. Research achievements in the synthetic biolo

6、gy and metabolic engineering of artemisinin (in(Ver), 2011, 56: 22892297, doi: 10.1360/972011-11192011 年 9 月第 56 卷第 27 期产育种提供了科学依据9.含量通常比双氢青 酸的含量低 510 倍, 最大相差倍21.15因此, 双氢青 酸向青如果说青瞻性, 在未来可能取得生物学研究具有 性成果, 那么青性和前转的转变很可能是青的“瓶颈”, 此过程涉及双氢青 酸氢研究则更有现实意义, 因为其成果是优良的青质. 值得强调的是, 中国科学家不仅在青种生过氧化物生成的限速反应. 若以双氢青 酸为

7、青的直接前体, 则青物学及代谢工程领域取得若干成果,素生物可以人为地划分成 3 个阶段: 第一阶段是而且正在引领着世界高产青转青 植株培育的新潮科学研究上的生物学及代谢工程研从乙酰辅酶 A 经烯基焦磷酸(IPP)、二甲基烯丙流,势.充分发扬了中国在青本文拟对当前青基焦磷酸(DMAPP)、法呢基焦磷酸到紫穗槐-4,11-二烯的途径, 其中 DMAPP 与 IPP 受 IPP 异构酶究的最新进展进行初步评述.(IPPI)催化发生互变, 二者再被法呢基焦磷酸酶(FDS)作用生成法呢基焦磷酸, 并在紫穗槐二烯合酶(ADS)催化下闭环产生紫穗槐-4,11-二烯; 第二阶段是从紫穗槐-4,11-二烯到双氢

8、青 酸的 途径, 紫穗槐 -4,11- 二 烯在细胞 色素 P450 单 加氧酶 1青生物研究历史与现状早在 20 世纪 80 年代, 中国上海有机化学的研究小组就利用放射性同位素标记的 2-14C-青 酸与青 匀浆(无细胞系统)保温法证明, 青 酸和青 B 是青 的共同前体10. 该结论相继得到放射性标记青 酸饲喂实验11、青(CYP71AV1)催化下, 经连续氧化依次生成青、青 醛和青 酸, 其中青 醛受青 醛双键还原酶2(DBR2)催化而还原成双氢青 醛, 后者再在青 醛脱氢酶 1(ALDH1)催化下氧化成双氢青 酸. 双氢青转变成双氢青 醛由 ALDH1/CYP71AV1 催化,其逆反

9、应则由双氢青 酸还原酶 1(RED1)催化; 第三B 离体转化实验12和青酸、青B、双氢也有不支持青B 离体转化实验13的支持. 当然,体结论的实验结果14.青 酸是青大学植株后发小组用 15-2H313C-青 酸饲喂青阶段是从双氢青 酸到青的途径, 双氢青酸经过未知的多个非酶促反应最终生成青. 此外,现, 青 酸的代谢产物中仅能检测到 11,13-脱氢倍半B 后再转变成青途径22.青素.酸可能反应青生物萜类(如青 酸、青B/脱氧青B、青 内酯/图 1 为最新提出的青烷等), 而未检测到 11,13-二氢倍半异青 内酯萜类(如双氢青 酸、双氢青 酸氢过氧化物、青2青从萜类体工程菌的构建素等)1

10、5.因此, 有人认为, 目前还不能完全排除其他中间产物作为青直接或间接前体的可能性.的角度, 可以将青生物分这些化合物包括: 青 酸、青B 和青B、seco-烯、表- 烷和青为从乙酰辅酶 A 到法呢基焦磷酸的“上游”途径、从法呢基焦磷酸到双氢青 酸的“中游”途径和从双氢青B 和二氢-表-青脱氧青烯16.然而,的“下游”途径. 青 及其他高等植物酸到青与酵母等荷兰瓦格林根大学的 Quax 小组从青 中生物法呢基焦磷酸的酶促反应分离出双氢青 酸及双氢青 酸氢过氧化物, 并提出双氢青 酸经双氢青 酸氢过氧化物生成青完全相同(循甲羟戊酸途径), 因而只需在酵母中额外代谢支路, 就能让酵母增加一个青的新

11、观点17,18.巧合的是, 韩国科学家发现,青. 目前, 中游途径的酶促反应已通过导入青双氢青中可能途径,酸与青 酸之间不能互变19, 意味着青ADS, CYP71AV1, CPR, DBR2 和 ALDH1 等至酵同时C11,13青酸途径和双氢青酸母而得以完全重建, 但下游途径的反应条件在酵母中则尚未建立.位的氧化还原状态是生成青酸还是双氢青 酸的“分水岭”. 换句话说, 若产生青 酸, 则不回溯到 2003 年, 美国 Keasling 小组将青ADS能继续转变成青; 若产生双氢青 酸, 则能最终经子优化后导入大肠杆菌中表达, 同时用获得青青 中一致20. 这个结论正好与Bouwmeest

12、er 小组发现酵母萜类途径代替大肠杆菌萜类途径, 首体着青化学型和青酸化学型的结果次在细菌体内出青的第一个他们的研究结果还显示,紫穗槐-4,11-二烯, 在 6 L 发酵罐中培养 60 h 的产率青 中青的2290 评 述达到 450 mg/L23. 2006 年, 他们将 ADS连同CYP71AV1 和 CPR同时导入酿酒酵母中表达, 培育出世界上第一株生产青 酸的酵母工程菌,谢途径修饰与优化, 其产率已达 153 mg/L24. 加拿大 Covello 小组于 2008 年将新克隆的青DBR2连同 ADS, CYP71AV1 和 CPR一同导入酿酒酵母,双氢青 酸的酵母工程菌, 其中双氢率

13、先培育出青 酸产率为 15.7 mg/L, 青 酸产率为 11.8 mg/L25.中国医学小组将青及北京协和医科大学的 子优化ADS按酵母偏爱并导入酿酒酵母后, 也培育出产紫穗槐-4,11-二烯的酵母工程菌26. 瑞典卡尔马大学的 Brius 小组将ADS导入酵母中, 分别获得质粒表达及整合表达的产紫穗槐-4,11-二烯酵母工程菌, 其中质粒表达酵母工程菌培养产量为 0.6 mg/L27.然而, 到目前为止, 将酵母工程菌中的青因可能是酵母不具备青16 d 后的紫穗槐-4,11-二烯国内外还没有一个研究小组体转变成青, 其原所需要的细胞环境. 在青 叶片表面具有特殊Covello 小组的研究显

14、示,腺体结构并充满挥发性芳香油的腺毛(glandular tri-chome)细胞中, 青酶高表达, 暗示青素生物可能就发生在腺毛细胞中28.大学小组给青 饲喂标记双氢青 酸后并未测得标记青, 推测腺毛油相环境缺乏可能影响了分子中羟基的稳定性29. 在无腺毛的环境中, 青中特有的过氧化基团可能烷化蛋白质而检测不到青. 作为佐证, 我们发现青可与肿瘤细胞或细菌的一氧化氮合酶及过氧化氢酶的血红素辅基结合而使酶失活, 导致一氧化氮水平降低, 过氧化氢水平升高30,31.这里着一个策略选择, 即在微生物中青体后是改用化学方法半青, 还是的方继续探索让微生物将青体转变成青法? 现在看来, 国外选择的是前

15、者, 并且已先期启动进程. 不过, 从工艺、成本、等方面考虑, 实现青应用价值.的微生物无疑有着更大的33.1高产青寻找高产青转青植株的培育青培育的有效途径图 1 青生物途径实线箭头表示已被证实的反应步骤, 虚线箭头表示推测或未被证实的反应步骤; 粗线箭头表示主要反应步骤, 细线箭头表示次要反应步骤; 单箭头表示一个反应步骤, 多箭头表示多个反应步骤转青是一种次生代谢产物, 它在青 中的积22912011 年 9 月 第 56 卷 第 27 期青高产的先决条件40,41.累量很小, 而且不同地区类型的差异很大. 中国植物春研究小组最早开展转3.3利用异种植物创建青生物新支路ADS体信号序紫穗槐

16、-青研究, 他们将重组法呢基焦磷酸酶美国肯塔基大学的 Chapel 小组将青(FPS)导入青以增加 FPS的拷贝数目, 期望及鸟类 FPS导入烟草中表达, 经生物途径的碳流(“开源法”), 由此获增大青得青列引导, ADS 和 FPS 被转运至体, 并含量比对照高 34 倍的转青青发根植株4,11-二烯, 产量达到 25 g/g 鲜重42. 如果将来能将(0.2%0.3%)32及比对照高 23 倍的转青“途径“搬到”体内, 那么这种独特的(0.8%1%)33,34. 类似地,戊二酰辅酶A 还原酶科学家用重组羟甲基体催化”方法可能比常规的“细胞质催化”方法(HMGR)培育转青 植更能获得高产青.

17、荷兰 Bouwmeester 小组利用烟草表达青株, 其青含量提高 22.5%35.本课题组将反义鲨烯合酶ADS,(asSS)导入青FPS 和 HMGR, 获得产紫穗槐-4,11-二烯的转基以阻断竞争青生物的类固醇分支途径(“节因烟草. 但是, 当继续导入 CYP71AV1 后, 却未检测到预期产物青 酸, 而只检测到青 酸-12-双葡萄糖苷, 产量达到 39.5 mg/kg 鲜重, 推测其为烟草流法”), 获得类固醇含量比对照(0.08%鲜重)下降近一半(0.04%0.05%鲜重)及青含量比对照(0.45%植株36.干重)提高近 3 倍(1.23%干重)的转青葡萄糖基转移酶的催化产物43.将

18、青ADS 和 CYP71AV1Covello 小组导入烟草后, 只检出上海交通大学唐克轩小组利用发夹RNA 介导的RNA干扰技术阻断类固醇途径, 使转青 中的紫穗槐-4,11-二烯和青入 DBR2 和 ALDH1, 未检出青 酸. 若再导也只检出双氢青, 未检比对照提高 3.14 倍37.的研究小组利用 -石含量达到 3.14%干重,青 最近,中国植物酸44.出双氢青物中重建青由此可见, 尽管在青 以外的植途径是可行的, 但在产物(如青竹烯合酶 cDNA 反义片段抑制青 的倍半萜支路, 通过减少 -石竹烯对紫穗槐-4,11-二烯的竞争, 使青含量提高 50%以上38.在今后的研究中, 可以考虑

19、将“开源”与“节流”两种方法结合起来, 也许能收到更好的效果. 一种更有酸糖苷)的后处理上可能会较多的技术.3.4通过细胞培养探索青的工厂化生产长期以来,以美国堪萨斯大学 Weathers 研究团前景的创意是将青 中的非青途径剔队为代表, 系统地开展了青 茎尖及根系体外培养, 并通过添加植物激素45、营养成分46、光照47,48、非生物胁迫刺激剂49,50等试图提高青 培养细胞的除或者仅保留青径, 从而通过型代谢.途径及其他必要的代谢途生物学创造出自然界不的新含量, 但结果均不理想. 例如, 在青 发根培青3.2通过调节激素及发育表达促进青养基中添加壳多糖能使其青含量提高 6 倍, 但青干重5

20、1,的净产出仅为 1.8 mg/g这说明开展青素可刺激叶片生长, 而青. 因此, 提高青 中的细胞细胞青 叶片主要由素水平戊烯 素水平细胞培养并非获取高产青的最佳选择.有可能促进青的.春小组结果使细胞44.1关于青青生物的几个关键问题基转移酶(ipt)导入青表达具有时空特异性含量增加 30%70%39. 有关的相关性及其作用机理详见提高 23 倍, 青植物激素与青 后述.为了阐明青高产的关系,我们利用实时荧光定量 PCR 技术追踪分析了青的发育及组织表达模式, 结果显示, 各生长发育(尤其是生殖发育)与青的表达水平在 8 月份开花前达到, 其中青素特异ADS mRNA 和 CYP71AV1 m

21、RNA 升幅最大, 为最低水平的 12 和 15 倍. 处于盛花期的青 在春小组拟南芥开花促进因子 1(fpf1)及(CO)分别转化青结果发现, 虽然青 开花时间大大提前(分别提前 20 和根、茎、叶、花各个组织中都能检测到青基14 d), 但青含量并无明显提高, 表明开花并非因的表达, 叶片中 ADS mRNA 水平较其他组织高 22292 评 述倍左右52.mol/L 咪康唑则在 24 h 内使青倍64.含量提高 2.5我们采用组织化学染色法和分光光度法对 CYP71AV1 启动子-GUS 融合转化烟草在正常和胁迫条件下的表达进行定性及定量检测,明, 在脱水、4和紫外辐射条件下, 转结果表

22、烟草的4.3青产量与单线态氧水平高度相关GUS 活性提高 1.42.7 倍53. 瑞典及荷兰科学家的研究结果表明, ADS, CYP71AV1, DBR2 和 ALDH1 等青在花芽及嫩叶中的表达水平比其他组织(老叶、茎、根、发根培养细胞)高 40500 倍, 而对收获后干燥65 及重金属均有利于青的积累, 推以往研究表明, 青(铅)、盐胁迫66处理青测环境胁迫尤其是氧化能与青有着十分密切的关系, 但始终缺乏活性氧参与青素生物的证据.青有负调节作用的双氢青 醛还原酶(RED1)则只在发根培养细胞中高表达54,55.我们研究发现, 转青 植株经过冷处理后,单线态氧的比对照植株明显增强, 同时青4

23、.2内外环境因素促进青的与积累含量从 1.23%增加到 1.66%, 转青 植株干粉经含量升至 2.35%67. 我们采用早在 2000 年,春小组就证明, 植物病原真15贮存后青mRNA 定量扩增技术系统地研究了低温68、衰老69、菌可以不同程度地促进体外培养青 发根中青水杨酸及酸甲酯70等内外环境因素对青生的积累, 其中大丽花孢处理发根后的青含45%56.物的影响, 结果发现青mRNA 水平升小组也证实,含量从 7 mg/g量比对照提高南京大学高、酶类增加、青含量提高均与单线态氧大来自真菌的寡聚糖激发子可使青量同步发生, 从而为单线态氧参与调节青生物提供了直接证据.干重提高到 13 mg/

24、g 干重, 而寡聚糖激发子与一氧化氮供体硝普钠共用, mg/g 干重57.春小组还发现,含量升高至 1222则青4.4单线态氧来自青体并可诱导青合外源性赤霉酸可以通过反成表达馈抑制赤霉酸, 将碳源分流到青途径,拟南芥的条件性 flu 突变体在由转光照的交替中可激发体产生单线态氧71, 并且由核导致青含量增高, 同时青 酸含量降低, 表明从的限速步骤之一58.青酸到青是青体蛋白 Executer 1 和 Executer 2 负责单组编码的美国 Weathers 小组的研究发现, 在青 发根培养基线态氧信号从体向细胞核的逆向转导72. 最近,中添加 2-异丙基腺嘌呤(一种细胞素), 也能显著我们

25、还发现, Executer 1与抗氧化酶(谷胱甘肽过含量59.提高青氧化物酶、谷胱甘肽-S-转移酶)均受萜类抑Covello 小组的最新合比利时根特大学及制剂处理后激发的单线态氧的共调控(未关于内源性与外源性单线态氧在青结果).中作研究结果表明,调倍半萜酸既能腺毛发育, 也能上并大幅提高倍半萜含量60.表达,的作用, 我们利用类胡萝卜素抑制剂证明,发现,中文大学的研究的影响取决于青酸甲酯对青体的单线态氧可作为“逆向信号转导”诱导素的化学型, 其中型积累, 而型中青 酸和青表达73.核内编码的青相关相反, 我较多的双氢青 酸和青显著减少61.们在培养基中添加单线态氧光敏发生剂孟加拉玫红(rose

26、 Bengal)并照光或通入次氯酸钠与过氧化氢反应中国杨酸可使青植物的研究团队也发现, 水产生单线态氧后, 不仅显著降低青含量, 而且导、青 酸和双氢青 酸含量分别提高70.致大量未知产物54%, 127%和 72%62. 意大利科学家证实, 50 mmol/L以上结果表明, 单线态氧催化的非酶促反应可-环糊精或 50 mmol/L -环糊杨酸可使青 悬生物的限速步骤, 而单线态氧来源能是青浮培养细胞中的青含量达到 27 mol/g 干重, 比对照高 300 倍左右63. 他们还发现, 22 mol/L 水杨酸于细胞内而不是细胞外, 内源性单线态氧不仅能上调青变成青表达, 而且可催化双氢青 酸

27、转可在 30 min 内诱导青含量升高 3 倍, 而 200.22932011 年 9 月第 56 卷第 27 期5结论及展望近 10 年来, 青青基本上都由国外研究机构首先发现并鉴定, 而且几乎所有相关均已申请国际微生物工程菌生物学进展速度惊人,体已接近工业化规模,专利保护, 我国培育青体通过微生物发酵生产青但目前还不能实现青诸多的专利壁垒. 因此, 我国不宜步国外研究将在微生物体内的.体工程菌构建的跟风研究, 而后尘开展产青国外拟采取“两步法”策略半青: 第一用化学方应该一方面着力推动具有知识产权的高产青体, 第二在微生物中获得青青 的田间试验和评价, 另一方面加强青终端反应的机理研究,

28、并在此基础上素转体转变成青., 必将带来青法将青功并实现该方法一旦实施成生产方式的彻底短缺局面的根本建立青及转青 中由双氢青 酸高效转变为, 也是缓解日益严重的青出路.青的外部条件, 争取早日实现高产、优质、多抗等优良农艺性状的转青 品系的推广应用.参考文献 12Hsu E. The history of qing hao in themateria medica. Trans R Soc Trop Med Hyg, 2006, 100: 505508Bhattarai A, Ali A S, Kachur S P,. Impact of artemisinin-based combinati

29、on therapy and insecticide-treated nets on malaria burden in Zanzibar. PLoS Med, 2007, 4: e309Mathers C D, Ezzati M, Lopez A D. Measuring the burden of neglected tropical diseases: The global burden of disease framework. PLoS Negl Trop Dis, 2007, 1: e114Zeng Q P, Qiu F, Yuan L. Production of artemis

30、inin by genetically modified microbes. Biotechnol Lett, 2008, 30: 581592345Hale V, Keasling J D, Renninger N,. Microbially derived artemisinin: A biotechnology solution to the global problem of access toaffordable antimalarial drugs. Am J Trop Med Hyg, 2007, 77: 198202678Liu B, Wang H, Du Z,. Metabo

31、lic engineering of artemisinin biosynthesis in Artemisia annua L. Plant Cell Rep, 2010, 30: 689694Keasling J D. Manufacturing molecules through metabolic engineering. Science, 2010, 330: 13551358Arsenault P R, Wobbe K K, Weathers P J. Recent advances in artemisinin production through heterologous ex

32、pression. Curr Med Chem, 2008, 15: 288628969Graham I A, Besser K, Blumer S,. Tetic map of Artemisia annua L. identifies loci affecting yield of the antimalarial drug ar-temisinin. Science, 2010, 327: 32833110,11521153, 周凤仪, 等. 青生物的研究: 青和青B 生物中的关键性青 酸. 化学学报, 1988, 46:11Sangwan R S, Agarwal K, Luthra

33、R,Phytochemistry, 1993, 34: 13011302. Biotransformation of arteannuic acid into arteannuin B and artemisinin in Artemisia annua.1213Nair M S R, Basile D V. Bioconversion of arteannuin B to artemisinin. J Nat Prod, 1993, 56: 15591566Bharel S, Gulati A, Abdin M Z,633636. Enzymatic synthesis of artemis

34、inin from natural and synthetic precursors. J Nat Prod, 1998, 61:14Dhingra V, Rajoli C, Narasu M L. Partial purification of proteins involved in the bioconversion of arteannuin B to artemisinin. Biore- source Technol, 2000, 73: 279282Brown G D, Sy L K. In vivo transformations of artemisinic acid in

35、Artemisia annua plants. Tetrahedron, 2007, 63: 95489566Brown G D. The biosynthesis of artemisinin (Qinghaosu) and the phytochemistry of Artemisia annua L. (Qinghao). Molecules, 2010, 15: 76037698151617Wallaart T E, van Uden W, Lubberink H G,. Isolation and identification of dihydroartemisinic acid f

36、rom Artemisia annua and itspossible role in the biosynthesis of artemisinin. J Nat Prod, 1999, 62: 430433Wallaart T E, Pras N, Quax W J. Isolation and identification of dihydroartemisinic acid hydroperoxide from Artemisia annua: A novel biosynthetic precursor of artemisinin. J Nat Prod, 1999, 62: 11

37、601162Kim N C, Kim S U. Biosynthesis of artemisinin from 11,12-dihydroarteannuic acid. J Kor Agric Chem Soc, 1992, 35: 106109181920Wallaart T E, Pras N, Beekman A C,. Seasonal variation of artemisinin and its biosynthetic precursors in plants of Artemisia annua ofdifferent geographical origin: Proof

38、 for the existence of chemotypes. Planta Med, 2000, 66: 576221Lommen W J M, Schenk E, Bouwmeester H J,. Trichome dynamics and artemisinin accumulation during development and senes-cence of Artemisia annua leaves. Planta Med, 2006, 72: 3363452294 评 述22Teoh K H, Polichuk D R, Reed D W,. Molecular clon

39、ing of an aldehyde dehydrogenase implicated in artemisinin biosynthesis in Ar-temisia annua. Botany, 2009, 87: 635642Martin V J J, Pitera D J, Withers S T, technol, 2003, 21: 79680223. Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids. Nat Bio-24Ro D K, Paradise E M,

40、Ouellet M, 440: 940943Zhang Y, Teoh K H, Reed D W,. Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast. Nature, 2006,25. The molecular cloning of artemisinic aldehyde 11(13) redue and its role in glandular tri-chome-dependent biosynthesis of artemisinin in Artemisia a

41、nnua. J Biol Chem, 2008, 283: 215012150826Kong J Q, Wang W, Wang L N,2009, 106: 941951. The improvement of amorpha-4,11-diene production by a yeast-conform variant. J App Microbiol,27Lindahl A L, Olsson M E, Mercke P,. Production of the artemisinin precursor amorpha-4,11-diene by engineered Saccharo

42、mycescerevisiae. Biotechnol Lett, 2006, 28: 571580 Covello P S, Teoh K H, Polichuk D R,1864187128. Functional genomics and the biosynthesis of artemisinin. Phytochemistry, 2007, 68:2930Brown G D, Sy L K. In vivo transformations of dihydroartemisinic acid in Artemisia annua plants. Tetrahedron, 2004,

43、 60: 11391159 Zeng Q P, Zhang P Z. Artesunate mitigates proliferation of tumor cells by alkylating heme-harboring nitric oxide synthase. Nitric OxideBiol Chem, 2011, 24: 11011231Zeng Q P, Xiao N, Wu P,. Artesunate potentiates antibiotics by inactivating bacterial heme-harbouring nitric oxide synthas

44、e and cat-alase. BMC Res Notes, 2011, 4: 22332Chen D H, Liu C J, Ye H C,. Ri-mediated transformation of Artemisia annua with a recombinant farnesyl diphosphate synthase genefor artemisinin production. Plant Cell Tissue Organ Cult, 1999, 57: 157162Chen D H, Ye H C, Li G F. Expression of a chimeric fa

45、rnesyl diphosphate synthase gene in Artemisia annua: Transgenic plants via Ag- robacterium tumefaciens-mediated transformation. Plant Sci, 2000, 155: 179185Han J L, Liu B Y, Ye H C. Effects of overexpression of the endogenous farnesyl diphosphate synthase on the artemisinin content in Ar-temisia ann

46、ua. J Integr Plant Biol, 2006, 48: 482487333435Aquil S, Husaini A M, Abdin M Z,. Overexpression of the HMG-CoA redue gene leads to enhanced artemisinin biosynthesis intransgenic Artemisia annua plants. Planta Med, 2009, 75: 1453145836Yang R Y, Feng L L, Yang X Q,. Quantitative transcript profiling r

47、eveals down-regulation of a sterol pathway relevant gene andoverexpression of artemisinin biogenetic genes in transgenic Artemisia annua plants. Planta Med, 2008, 74: 1510151637Zhang L, Jing F, Li F,. Development of transgenic Artemisia annua (wormwood) plants with an enhanced content of arte-misini

48、n, an effective anti-malarial drug, by hairpin-RNA-mediated gene silencing. Biotechnol Appl Biochem, 2009, 52: 19920738Chen J L, Fang H M, Ji Y P,. Artemisinin biosynthesis enhancement in transgenic Artemisia annua plants by downregulation of the-caryophyllene synthase gene. Planta Med, 2011, doi: 1

49、0.1055/s-39Geng S, Ma M, Ye H C, Sci, 2001, 160: 691698Wang H, Ge L, Ye H C,. Effects of ipt gene expression on the physiological and chemical characteristics of Artemisia annua L. Plant40. Studies on the effects of fpf1 gene on Artemisia annua flowering time and on the linkage between floweringand

50、artemisinin biosynthesis. Planta Med, 2004, 70: 34735241Wang H, Liu Y, Chung K,. Earlier flowering induced by over-expression of CO gene does not accompany increase of artemisininbiosynthesis in Artemisia annua. Plant Biol (Stuttgart), 2007, 9: 44244642Wu S Q, Schalk M, Clark A,Biotech, 2006, 24: 14

51、411447. Redirection of cytosolic or plastidic isoprenoid precursors elevates terpene production in plants. Nat43Van Herpen T W, Cankar K, Nogueira M,2010, 5: e14222. Nicotiana benthamiana as a production platform for artemisinin precursors. PLoS ONE,4445Zhang Y, Nowak G, Reed D W,. The production of

52、 artemisinin precursors in tobacco. Plant Biotechnol J, 2011, 9: 445454Woerdenbag H J, Luers J, van Uden W,. Production of the new antimalarial drug artemisinin in shoot cultures of Artemisia annua L.Plant Cell Tissue Organ Cult, 1993, 32: 247257Wang J W, Tan R X. Artemisinin production in Artemisia

53、 annua hairy root cultures with improved growth by altering the nitrogen source in the medium. Biotechnol Lett, 2002, 124: 115311564647Wang Y, Zhang H, Zhao B,. Improved growth of Artemisia annua L. hairy root and artemisinin production under red ligh conditions.Biotechnol Lett, 2001, 23: 1971197322952011 年 9 月 第 56 卷 第 27 期48Souret F F, Kim Y, Wyslou