实时荧光定量PCR

1、微生物微生物131 沈涛沈涛 基本原理：基本原理： 在RT-qPCR中,对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号,随着反应时间的进行,监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。 在PCR反应早期,产生荧光的水平不能与背景明显地区别,而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期。RT-qPCR可行性定量是在PCR扩增的指数期进行的。首先需设定一定荧光信号的域值,一般这个域值是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。域值域值Ct常规PCR vs vs RT-qPCR 常规常规PCR：借助电泳

2、对扩增反应的终产物进行半定：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析量及定性分析 RT-qPCR：利用荧光信号的变化实时检测：利用荧光信号的变化实时检测PCRPCR扩增扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板的定量分析对起始模板的定量分析定量PCR三个基本概念 扩增曲线扩增曲线指数增长期 平台期线性增长期背景期 阈值：是循环开始阈值：是循环开始315个循环的荧光信号的标准偏差的个循环的荧光信号的标准偏差的1010倍，设定在扩增曲线倍，设定在扩增曲线指数增长期 C(t)值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的值：荧光信号（扩增

3、产物）到达阈值时所经过的扩增循环次数Threshold line C(t) value C(t) value18.12 +/- 0.04Threshold line C(t) value C(t) value18.12 +/- 0.04C(t) value18.12 +/- 0.04C(t) value18.12 +/- 0.04化学反应原理化学反应原理 依据反应中所选荧光物质的不同,实时荧光定量PCR的化学反应原理通常分为荧光染料和荧光探针两种:1、SYBR荧光染料: SYBR是一种与双链DNA小沟结合的染料。在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料, SYBR荧光染料特异性掺入DNA双

4、链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。2、TaqMan荧光探针:该探针是一种寡核苷酸探针。 PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,两端分别标记一个荧光基团和一个淬灭基团。当探针与靶序列配对时,荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。PCR扩增时,Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解,使荧光基团和淬灭基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。SYBR Green I法 结合双链结合双链DNADNA分子

5、小沟分子小沟延伸结束，形成双链延伸结束，形成双链DNADNA，SYBR SYBR GreenGreen结合到双螺旋小沟中，当受到适结合到双螺旋小沟中，当受到适合光源激发，发射出荧光，反映产物合光源激发，发射出荧光，反映产物浓度浓度 优点优点使用方便，无需复杂的设计使用方便，无需复杂的设计成本较低成本较低 缺点缺点与非特异性产物结合，无模板特异性与非特异性产物结合，无模板特异性试验方法较难优化试验方法较难优化灵敏度低灵敏度低TaqMan探针法 水解型水解型报告基团，淬灭基团报告基团，淬灭基团FRETFRET（荧光谐振能量传递）（荧光谐振能量传递）识别特异性产物识别特异性产物 优点优点特异性高，可

6、准确定量特异性高，可准确定量灵敏度高灵敏度高设计不同标记的探针，可进行多重检测设计不同标记的探针，可进行多重检测 缺点缺点一个探针只适用于一个目标一个探针只适用于一个目标价格较高价格较高探针设计较繁琐探针设计较繁琐两种化学的比较RT-qPCR的实验设计和数据处理绝对定量与相对定量绝对定量与相对定量绝对定量 标准品，标准曲线标准品，标准曲线已知浓度的相应已知浓度的相应DNADNA模板，按不同浓度稀释模板，按不同浓度稀释根据实时根据实时PCRPCR反应得到相应的反应得到相应的C(t)C(t)，构建标准曲线，构建标准曲线 样品样品与标准品同时进行与标准品同时进行PCRPCR反应得到未知浓度样品的反应

7、得到未知浓度样品的C(t)C(t)值值unknown104103相对定量 相对定量的目的相对定量的目的比较基因在不同情况下的表达差异（倍数关系）比较基因在不同情况下的表达差异（倍数关系） 相对定量的问题相对定量的问题样品材料不均一造成的差别样品材料不均一造成的差别 内标基因内标基因内标通常是内标通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因（内等看家基因（内标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响）标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响）对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的误差误差特特 点：点： 一般一般PCR产

8、物都需要经过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭产物都需要经过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭（EB）染色紫外光观察结果或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳）染色紫外光观察结果或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测和银染检测,不仅需要多种仪器不仅需要多种仪器,而且费时费力而且费时费力,所使用的染所使用的染色剂溴化乙锭对人体又有害处色剂溴化乙锭对人体又有害处,在这繁杂的实验过程中会在这繁杂的实验过程中会带来假阳性的污染。而荧光定量带来假阳性的污染。而荧光定量PCR克服了常规克服了常规PCR的的许多缺点许多缺点,有着如下显著的优点有着如下显著的优点:(1)特异性好。使用针对靶序列设计的特异性探针对定量分子进行识别,具有很高的准确性。同时,靶序列由引物和探针双重控制,特异性好、假阳性低。(2)灵敏度高。荧光定量PCR检测技术是综合了PCR技术、荧光标记技术、激光技术、数码显像技术为一体的技术,因此大大提高了其检测灵敏度。(3)线性关系好、线性范围宽。由于荧光信号的产生和每次扩增产物成一一对应的关系,通过荧光信号的检测可以直接对产