植物生理学实验

1、YUNNAN NORMAL U NIVERSITY本科学生综合性实验报告光合色素的提取、理化性质分离、吸收光谱及含量的测定学号： 134120171 姓名： 王晓莲学院：生命科学学院专业、班级 13生物科学C班实验课程名称：植物生理学实验教师及职称：李忠光开课学期：2015至2016 学年 下 学期填报时间：2016 年 4 月2日云南师范大学教务处编印实验序号实验二实验名称光合色素的提取、理化性质分离、吸收光谱及含量的测定实验时间2016.3.15-29实验室睿智三4281.实验目的(1)掌握光合色素的提取方法以及了解有关的理化性质。(2)掌握光合色素的分离方法以及了解有关的吸收光谱。(3)

2、掌握用分光光度计测定叶绿素含量的方法2 .实验原理I光合色素的提取与理化性质光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等。提取液中 无任何电子受体，因此可以观察荧光现象。离体叶绿素在有氧气和光照条 件下，发生光氧化作用，结构遭到破坏，形成加氧叶绿素等产物。叶绿素 是一种双竣酸酯，可以发生皂化反应。叶绿素分子中 Mg2+f仆咻环结合不稳定，可以被H+、Cu2大Zn2痔离子所取代。n光合色素的分离与吸收光谱光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等。不同光合色素的分子量、分子结构、极性、溶解度、支持物对它们的吸附力等不同， 因而分配系数不同，故彼此可以分开。叶绿素的吓咻环结构对光

3、有很强的 吸收，主要是红光和蓝紫光。m 光合色素含量的测定混合液中的两个或多各组分，只要它们的光谱吸收峰不互相重叠，仍 然可以根据 Lambert-Beer定律（A = k L C ）求出各组分含量。Lambert 定律：A = k L; Beer定律A = k C。叶绿素a、b在80炳酮溶?中的Amax: 分别为663nm 645nm 由此得出：见推导过程Ca = 12.7 A 663 2.69 A 645 ；Cb = 22.9 A 645 4.68 A 663Ca+b = 8.02 A 663 + 20.20 A 645,A663 = C a.k al + C b.k blAs45 = C

4、b.k b2 + C a.k a2由于K是一个常数，而A可以通过分光光度计测出，故求二元一次方 程组可得到此公式。k比吸收系数。即溶剂和波长不变的情况下，当物质的浓度 （C）为 1g/L（0.1%）,比色皿的直径（光径，L）为1cm时所测出的吸光度即为比吸收 系数。故其单位为：g.cm£ 摩尔吸收系数。即溶剂和波长不变的情况下，当物质的浓度（C） 为 1mol/L,比色皿的直径（光径，L）为1cm 时所测出 的吸光度即为摩尔吸收系数。故其单位为:mol.cm3 .实验设备及材料(1)材料鲜植物叶片、丙酮、碳酸钙、石英砂、 20%KOH甲醇溶液、苯、自来水、50%醋酸、醋酸铜、启动剂、

5、80%丙酮(2)实验设备试管、滤纸、研钵、玻璃棒、锥形瓶、剪刀、移液管、洗耳球、烧杯、漏斗、离心机、便携式叶绿素测定仪、分光光度计、天平、离心管、滴管4 .实验步骤I光合色素的提取与理化性质(1)光合色素的提取：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，取1/2片叶片，放 入研钵中并加入少许 CaCO3和石英砂及5 ml丙酮，充分研磨，再加入10 ml丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。(2)观察荧光现象：与光线垂直的方向观察色素颜色。(3)光破坏作用：1ml色素提取液于室内，1ml于太阳光下，30min后观 察颜色变化。(4)皂化反应：取一支试管，加入色素提取液 2.5ml,再加入20%KO

6、H 甲醇溶液1ml,摇匀，再加入苯2.5ml,轻轻摇动，沿试管壁慢慢加入自来水1ml,轻轻摇动后观察，注意观察整个过程颜色的变化。(5)取代反应：取一支试管，加入3ml色素，逐滴加入50%醋酸直至溶 液变为黄褐色。倒出一半，加入少许醋酸铜粉末，酒精灯上加热，与另一 半比较颜色的差异。II光合色素的分离与吸收光谱(1)光合色素的提取：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，取1/3片叶片，放 入研钵中并加入少许 CaCO3和石英砂及5 ml丙酮，充分研磨，再加入10 ml丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。(2)光合色素分离：剪取适当长度和宽度的滤纸条- 用上行纸层析法分离色素一 启动剂：石油

7、醍：丙酮：苯=10: 2: 1(3)吸收光谱的测定光合色素的吸收光谱：取色素溶液1 mL ,加入丙酮3 mL,摇匀后在 分光光度计上400到700 nm处每隔10 nm进行扫描。各色素的吸收光谱：上述层析出的34种色素，分别剪下后溶于3 mL 丙酮中，按上述方法扫描。川光合色素含量的测定方法一：快速测定法由于叶绿素a、b在652nm处有共同吸收，k = 34.5 L g-1. cm-1。可直 接用便携式叶绿素测定仪测定植物叶片的叶绿素含量，最后浓度单位为mg/dm2方法二：分光光度计法色素提取：将上述植物叶片洗净并用滤纸吸干，准确称取已知 的叶圆片 0.05g左右，加入少许CaCO3和石英砂及

8、80%丙酮2ml,充分研磨，转入 离心管中(离心机使用)，再用5ml 80%丙酮洗研钵，转入离心管中，平衡, 5000rpm离心10min,记录上清液体积，取1ml稀释到4ml。测定：以1cm比色皿分别测定 A663、A645。使A控制在0.1 0.8之间。5.实验结果及分析I光合色素的提取与理化性质一层：浅黄绿色(1)皂化反应：溶液分为三层 二层：浅绿色i三层：深绿色轻轻摇晃过程中：第一层由浅绿色逐渐变为黄绿色第二三层逐渐变为一层，深绿色在第一层下面出现一层油滴层原因：叶绿素是一种由叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起 皂化反应而生成甲醇和叶绿醇及叶绿酸盐，产生的盐能溶于水中，可用此

9、 法将叶绿素与类胡萝卜素分开(2)荧光现象的观察用肉眼可以观察到叶绿素提取液在直射光照射下，反射光为蓝绿色，透射 光为深红色原因：叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定, 当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光；反射光呈蓝绿色是 因为叶绿素对蓝绿色光的吸收很少，而对于其他颜色光的吸收很多，所以 会呈现出蓝绿色的反射光II光合色素的分离与吸收光谱光合色素的分离如图所示将涂有叶绿体色素的滤纸放入层析液后，叶绿体色素随层析液沿滤纸向上推进，在滤 纸上分为四个条带，其颜色由下至上分别为黄绿色、蓝绿色、黄色、橙黄色，由资料 可知由下至上依次为叶绿素b、叶绿素a、叶黄素、胡萝卜

10、素；其中蓝绿色条带最宽， 黄绿色条带次之，黄色、橙黄色条带较细，说明叶绿体中含量较多的是叶绿素a和叶绿素bo吸收光谱（附图）川光合色素含量的测定方法一：快速测定法序号1234平均值含"JU (mg/dm2)31.630.531.627.630.3方法二：分光光度计法波长(nm)663645含量(A)0.2070.077Ca = 12.7 A 663 2.69 A 645 I> G=2.42mg/LCb = 22.9 A 645 4.68 A 663=>Cb=0.79mg/LC a+b=8.02A663+20.20A645: C -a+b=3.12mg/L各叶绿素含量：V=

11、10ml W=0.05g由公式：Chl content= C V (mg.g-1FW)WChla=484mg.g-1FWChlb=158mg.g1 FW6、思考题1、为什么在皂化反应中只能用 20%KOH甲醇溶液，而不能用20%KOH 水溶液？因为色素不能溶于水，甲醇其实在这里只是当做溶剂使用，化学中有“相 似相容”，色素是有机物所以只能溶于有机溶剂2、光合色素的吸收光谱对我们理解光合作用有何意义？叶绿体色素的吸收光谱的来年改革峰值分别在430nm左右和660nm左右。基本不吸收绿光，因而绿光被反射而是叶子（大部分）显绿色。也就 是说主要吸收这些波长的光的能量在叶绿体内合成植物所需要的物质。3

12、、试论述高等植物光合色素的种类和生理功能植物含有几种类型的叶绿素，它们之间的差别在于炫侧链的不同。 大多 数能进行光合作用的细胞还有第二种类型的叶绿素，即叶绿素b或叶绿素c。在高等植物的细胞中含有叶绿素 b,而在其它一些类型的细胞中含有叶绿 素c。不同类型的叶绿素对光的吸收也是不同的，如叶绿素 a最大的吸收 光的波长在420663nm,叶绿素b的最大吸收波长范围在460645nm。当 叶绿素分子位于叶绿体膜上时，由于叶绿素与膜蛋白的相互作用，会使光 吸收的特性稍有改变。4、一般正常的植物叶片，Chla / Chlb = 3 / 1,你所测定的结果符合此比例 吗？Chla=484mg.g1FWC

13、hlb=158mg.g1FW符合5、两种测定方法含量有何不同？为什么？快速测定法用便携式叶绿素测定仪测定植物叶片的叶绿素含量，局部含量测定。比较准确，但不便于整体测定，取样多次平均值也不能代表整体 叶绿素含量；分光光度计法采用低杂散光，高分辨率的单光束单色器，保证了 波长准确度.波长重复性和更高的分辨率，自动调0%T和100%T,自动调波 长用多种方法的数据处理功能，高分辨，宽大的样品糟，可容纳100mm，光径 吸收池和相应的反射附件，仪器配有标准的RS-232双向通讯接口，可外接 打印机，打印相应的实验数据.个性代的外形设计，轻触式按键使操作更为方 便.可见分光光度计广泛应用于医药，卫生，化工，学校，生物化学，石油化工，质 量控制，环境保护及科研实验室等