第03章细胞生物学研究方法

1、第三章 细胞生物学研究方法 细胞生物学研究方法第一节细胞形态结构的观察方法第二节细胞及其组分的分析方法第三节细胞培养与细胞工程第四节细胞及生物大分子的动态变化第五节模式生物与功能基因组的研究第一节细胞形态结构的观察方法第一节细胞形态结构的观察方法一、光学显微镜二、电子显微镜三、扫描隧道显微镜一、光学显微 （light microscope）（P49,30）（一 ）普通复式光学显微镜组成：光学放大系统、照明系统、镜架及样品调节系统；性能参数：放大倍数、分辨率、清晰度、焦点深度、镜像亮度等，其中最重要的是分辨率。分辨率（分辨本领） ：能区分开两个质点间的最小距离。该距离越小，则分辨率越高。显微镜的

2、分辨率计算公式：D=0.61妞Nsin（ a/2）人光源波长，a物镜镜口角，N介质折射率光学显微镜的最大分辨率a最大值140° ;入最小波长450nm；介质折射率N油浸下1.5 （ N空气1.0 ）;因此普通光镜的分辨力极限为 0.2 微米，此数值亦为显微水平和亚微水平的分界点。 （称为瑞利极限， Rayleigh limit ）普通光镜有效放大倍数（经验值） =物镜最大镜口率（数值孔径NA numerical aperture ） x 1000提高光学显微镜分辨力的手段a、缩短照明光线波长；b、应用特殊光学效应，增强反差。光学显微镜样品制备取材固定（ fixation ） ：使用固

3、定剂（ fixative ）杀死细胞，并使细胞结构尽可能接近活细胞；包埋：石蜡切片：切片机脱蜡、染色：多种染料封片、观察。显微镜技术和计算机技术结合倒置显微镜（二）相差和微分干涉显微镜（P51， 31）1、相差显微镜： （ phase-contrast microscope, Ph ）1935年P. Zernicke（德）发明，1953年获得Nobel物理奖；它利用光的衍射和干涉原理，将光的相位差（人眼无法感受）-振幅差（人眼可以感受）无色透明物体中的细节表现为明与暗的对比；适合观察活细胞和未染色的样品 。两束光波之间的相互干涉2、微分干涉显微镜（P51， 32） （ differential

4、 interference microscope ， DIM ）DIM 获得的反差取决于光线穿过样品折射率变化的速率。样品边缘结构反差增大（相对小的距离内折射率发生明显变化） 。Nomarski microscope推荐阅读细胞实验指南下册，科学出版社， P896（三）荧光显微镜（ fluorescence microscopy ）原理： 以紫外光为光源， 激发标本中的荧光物质产生荧光， 从而对某些物质进行定性和定位分析。荧光种类：自发荧光：细胞内某些天然物质被 UV 激发产生的荧光，如叶绿素产生血红色荧光。诱发荧光：细胞中加入荧光染料，与特定成分结合，经过 UV 照射发出荧光。（四）激光扫描

5、共聚焦显微技术（P53 ， 33）（ laser scanning confocal microscope ， LSCM ）推荐阅读细胞生物学荧光技术原理和应用刘爱平等中国科学技术大学出版社The Nobel Prize in Chemistry 2008Green Fluorescent Protein, GFPGFP 用途作为报告基因构建基因工程载体；目的基因的功能研究；蛋白质缔合作用研究；病原体与宿主关系的研究；GFP 在生态学中的应用；GFP 在生物防治中的应用GFP 作为一种新型免疫标记物的探索二、电子显微镜（P56 ， 34）1932年E.Ruska（德国）,1986年获得 Nob

6、el物理奖（一）电子显微镜基本知识电子显微镜是模仿光学显微镜的工作原理， 用电子束来代替可见光束， 用电磁线圈代替玻璃透镜汇聚电子束，通过荧光屏或者胶片捕获图像的观察工具，理论分辨率可达0.2nm 。1、电子显微镜与光学显微镜的基本区别（表3 1）HITACHI H-8100透射电子显微镜3、电子显微镜基本构造（P57 ， 35）电镜特点（1） “照明”光源电子束（ 2 ）放大倍数调节方式改变磁透镜电流强度（3）高电压工作一一几万十几万伏（ 4 ）内部高真空10 4 托（5）样品厚度90nm电子穿透力有限，产热（ 6 ）标本染色技术不同重金属盐（正染，负染）超薄切片技术正染冰冻蚀刻（冰冻断裂）

7、技术freeze etching （ freeze fracture）样品于-190 快速冰冻在真空中用冷却刀切割撕裂真空中冰升华暴露出的断裂面喷碳膜或者碳-铂膜（表面复型膜）用有机溶剂或酶去除样品将膜金属喷镀后在电镜下观察4、电镜三维重构与低温电镜技术低温电镜：不经固定、染色、干燥，低温下成像。5、扫描电镜技术（P62， 38） （ scanning electron microscope ， SEM ）SEM 发明于 1965 年；工作原理： 利用电子束逐点扫描样品表面， 通过检测样品表面散发的二次电子， 将样品表面的形貌逐点成像，并合成为放大的图像。PHILIPS XL20 扫描电子显微

8、镜SEM 的特点：（ 1 ）可观察较大较厚的样品；（ 2 ）景深大，图像清晰逼真，具有强烈的立体感；（3）放大倍数在2020万倍间连续变换，无需多次聚焦；（ 4 ）样品可在样品室内多方位移动和转动；（5）分辨力不太高：310nm（ 6 ）只能观察标本表面，不能观察内部。推荐阅读实用电子显微镜技术付洪兰 高等教育出版社三、扫描隧道显微镜（ scanning tunneling microscope ， STM ） （ P63）1981 年发明；用于探测物质表面形貌的仪器；利用量子力学中的隧道效应。STM 的特点：（ 1 ）具有原子尺度的高分辨本领；（ 2 ）真空、大气、液体环境中都能工作；（ 3

9、 ）非破坏性测量，保持样品原貌。原子力显微镜（ atomic force microscope ， AFM ）本节完第二节 细胞及其组分的分析方法一、超速离心技术（ P64， 39）离心技术原理不同的细胞器具有不同的密度和体积，因此，可以利用离心方法加以分离和纯化。1、差速离心（differential centrifugation ）利用不同的离心速度产生的不同的离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分离开来。适合分离沉降速率差别较大的亚微结构颗粒。多次离心达到纯化的目的2、密度梯度离心（P65）（ 1 ）速度沉降分离密度接近大小不一的组分（ 2 ）等密度沉降分离不同密度的组分将介质形成一涵盖所

10、有组分密度的密度梯度， 不同的样品由于其密度差异， 在离心过程中进入到等密度介质区域即不再移动，从而实现分离的目的。速度沉降和等密度沉降的比较二、细胞成分的细胞化学显示方法（P65， 40）利用一些显色剂与被测物质中的某些基团特异性结合，来判断核酸、蛋白质（酶） 、糖类、 脂类在细胞中的分布和含量。福尔根（Feulgen）反应显示 DNA格莫瑞（ Gomori ）反应显示碱性磷酸酶三、特异蛋白抗原的定位与定性P66， 40原理：抗体能够自行识别并结合对应的抗原目的：检测特定蛋白质在细胞内的分布状况和含量。（一）免疫荧光技术（二）免疫电镜技术人成纤维细胞中肌动蛋白束（800X）BHK细胞中的微管

11、蛋白（500X）四、细胞内特异核酸的定位和定性研究对象：细胞内特异核酸（ DNA 或 RNA ）目的：定位、定量分析方法：原位杂交（ in situ hybridization ， ISH ）以目标核酸的互补序列为探针， 对细胞或者组织标本进行杂交处理， 使目标核酸可视呈现的技术。是细胞生物学、细胞遗传学、分子生物学相互交融的研究手段。构建 DNA 分子物理图谱核型分析光谱核型分析（ spectral karyotype ， SKY ）SKY of Human五、定量细胞化学分析与细胞分选技术P69， 41细胞分选（ cell sorting ）是细胞生物学中较新技术，是利用流式细胞仪（ fl

12、ow cytometery ， FCM ）对细胞或者其他生物微粒（如染色体）进行分选，并对其进行定量分析（大小、形状、核酸含量和蛋白质含量等）的技术。1、流式细胞仪（ FCM ）是集合了流体喷射、 激光、 伽马射线能谱、电子计算机、 显微荧光光度计量等技术于一体的设备 ;可以定性和定量分析生物颗粒（包括细胞）的物理化学特性并将之分离纯化 ;目前的 FCM 已经运用于细胞生物学、肿瘤学、免疫学、血清学、药物学等研究领域，可以用来分析免疫复合物、 病毒、脂质体、 细胞器、 原核细胞、 真核细胞、 简单多细胞生物等等。BECKMANMOFOLXDP流式细胞仪流式细胞仪结构和工作原理2、标记细胞：免疫

13、荧光染色荧光素标记抗体： 异硫氰酸荧光素（FITC）、 藻红素（PE）、 德克萨斯红（Texas Red）荧光染色分为：直接染色和间接染色荧光染料直接染色使用PI （碘化丙咤，propidium iodide ）或DAPI ,对固定处理过的细胞（核）直接进行染色第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术一、细胞培养P70,421、什么是细胞培养是指从机体内取出某种组织或者细胞， 模拟机体内的生理条件使其在体外生存、 生长和繁殖的过程。细胞培养示意图2、细胞培养分类：按照培养过程中培养物是否经过了分割，分类为：（ 1 ）原代培养（ primary culture ）直接从机体取出组织或者细胞后所进

14、行的首次培养。（ 2）继代培养（secondary culture） /传代培养（subculture ）当原代培养的细胞增殖到一定的密度后， 将其从原培养容器中取出， 按照一定的比例向另外一（多）个容器中接种所进行的再培养，简称传代。传代的累计次数就是细胞的代数。两个概念（ 1 ）细胞系（ cell line ） ：通过原代培养并且经过传代后所形成的细胞群体，由于来源于原代培养物，故一个细胞系往往由多个生物学性状不同的细胞群体组成。如 HeLa 、 CHO 等。（ 2 ） 细胞株 （ cell strain ） ： 利用单细胞分离培养法或者克隆形成法从原代培养物或者细胞系中选择出来的细胞群体

15、， 一个细胞株往往具有特殊的生物学性状或者标记， 并且可以持续存在。二、细胞工程（ cell engineering ）细胞培养、分化诱导、细胞融合、显微注射等。（一）细胞融合与单克隆抗体技术1、细胞融合（cell fusion ）两个或者多个细胞融合成双核或者多核细胞的现象。产生的细胞称为融合细胞。2、细胞融合的应用：动物和植物的不同种、属之间的细胞可以融合;动植物之间的细胞可以融合;应用于研究核质关系、绘制染色体基因图谱、制备单克隆抗体、研究肿瘤发生机制等领域。3、人工诱导细胞融合：病毒诱导融合：灭活的仙台病毒等。化学诱导融合： PEG电激诱导融合：单克隆抗体技术（1984 年诺贝尔化学奖）（二）显微操作技术与动物克隆第四节 细胞及生物大分子的动态一、荧光漂白恢复技术（ P45） Fluorescence Photobleaching Revov