缺氧致细胞凋亡发生机制研究进展

1、缺氧致细胞凋亡发生机制研究进展         【关键词】  缺氧；细胞凋亡；凋亡基因细胞凋亡（apoptosis）是由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致细胞死亡的过程。大量研究表明，心肌细胞的凋亡可能与组织中抗细胞凋亡基因与促凋亡基因的表达失衡有关，同时也可受细胞周围的刺激信号所诱导或抑制1，2。缺氧是因组织供氧减少或利用氧障碍引起细胞发生代谢、功能和形态结构异常变化的病理过程。研究显示组织缺氧可诱发细胞凋亡，如复制心肌细胞缺氧模型中可观察到伪足缩短或消失，紧密的星形心肌细胞变得疏松孤立，呈条索状

2、；细胞核发生断裂，呈分叶、碎片状，核膜完整包被形成凋亡小体；细胞质皱缩，核固缩、深染，染色质浓集等主要凋亡形态变化特征3。同时，缺氧也可诱导体外培养的心肌细胞发生凋亡4；李雅莉等5认为神经元凋亡是脑缺血缺氧损伤的主要形式。探讨缺氧致细胞凋亡的发生机制是临床干预缺氧性损伤的基础，本文综述其发生机制。   1  线粒体损伤   细胞内氧化磷酸化、能量代谢和抗活性氧化均有赖于线粒体的功能。研究表明，缺氧所致的细胞凋亡，均首先表现为线粒体功能紊乱，尤其是线粒体跨膜电位(m)的破坏。组织细胞缺氧时，细胞膜离子泵功能障碍，膜通透性增强，膜流动性下降，膜受体

3、功能障碍导致Na+大量内流，胞内Na+浓度升高，可激活钠泵增加Na+排出，从而消耗大量ATP，这又进一步增强线粒体氧化磷酸化过程。严重缺氧时，ATP生成减少，使钠泵功能障碍，细胞内Na+增多，促进细胞内钠水潴留，导致线粒体膜通透性增加，线粒体肿胀。当线粒体部位的PO2降到临界点1mmHg时，可抑制线粒体内脱氢酶的功能，ATP生成进一步减少，呼吸链被破坏。   在凋亡过程中起重要作用的不仅是线粒体呼吸链活性的丧失，更重要的是细胞色素C（Cyt C）自线粒体的释放。Cyt C是一种核编码的蛋白质，分子量约14.5KU，位于线粒体内膜的呼吸链复合物和之间，在传递电子和ATP生成过

4、程中起重要作用。生理情况下,线粒体内膜对物质通透具有高度选择性，Cyt C很难从内膜进入胞质中。许多实验结果显示，细胞在各种有害因素如缺血缺氧、自由基生成增多、胞内钙超载等刺激下，通过胞内信号转导，或直接使线粒体结构受损，线粒体应激，使线粒体内外膜间的通透性转换孔（permeability transition pore,PTP）开放，使凋亡启动因子如呼吸链成分Cyt C自线粒体释放入胞质中。Cyt C作为一种凋亡诱导蛋白可以激活其他凋亡蛋白的活化，其在细胞质中与半脘氨酸蛋白酶-9（caspase-9）酶原、凋亡蛋白酶活化因子-1（apoptotic protease activation f

5、actor-1,APAF-1）结合在一起形成一巨大的复合物，caspase-9得以激活，接着又激活了caspase-3，从而引导细胞进入了不可逆的“被删除”阶段6。   线粒体改变引起细胞凋亡已知有5种机制：电子传递、氧化磷酸化和ATP产生的破坏；释放激活caspases家族的蛋白，如Cyt C；改变细胞氧化还原潜能7；细胞自发的受Bcl-2抑制的核固缩和DNA裂解依赖线粒体的存在；线粒体释放的死亡因子还包括：AIF、Smac/D IABALOA IF、Endo-nuclease G8。   2  钙超载   自从Kaise

6、r等发现糖皮质激素诱导的胸腺细胞凋亡与Ca2+内流增加有关以来，越来越多的直接或间接证据表明胞浆Ca2+浓度上升是细胞凋亡的一个重要事件。Ca2+作为第二信使或死亡信号转导分子，通过参与某些和细胞凋亡相关的蛋白激酶和核酸酶的活化介导细胞凋亡。缺氧时是导致Ca2+超载的最常见原因，其机制有缺氧时，钠泵功能受损，Na+离子大量内流，细胞内Na+明显升高，Na+/Ca2+交换蛋白以反向转运的方式将细胞内排出、Ca2+进入细胞；缺氧时，细胞膜严重受损，对Ca2+的通透性大大增加；缺氧时产生大量氧自由基，自由基可以造成肌浆网膜损伤，钙泵功能抑制，使肌浆网摄Ca2+减少，胞浆浓度升高；线粒体膜损伤抑制氧化

7、磷酸化过程，使ATP生成减少，细胞膜和肌浆网摄钙能量供应不足，促进钙超载的发生。   钙超载被认为是导致凋亡的重要因素9，其主要机制有：激活与凋亡有关的各种酶，包括激活钙依赖性核酸内切酶使DNA降解，导致细胞凋亡；激活诱生型一氧化氮合酶，引起NO合成增加，高浓度的NO使DNA中嘌呤和嘧啶脱氨基，引起突变和DNA链断裂；同时NO可降低胞浆的pH，并抑制蛋白质和核酸的合成；NO还增加p53表达及减少细胞ATP合成，NO的这些细胞毒性可导致细胞凋亡；激活谷氨酰胺转移酶，催化细胞内肽链间的酰基转移，在肽键间形成共价键，使细胞骨架蛋白分子间发生广泛交联，有利于凋亡小体的形成；激活核转

8、录因子NF-B，加速细胞凋亡相关基因的转录；Ca2+在ATP的配合下使DNA链舒展，暴露出核小体之间的连接区内的酶切位点，有利于DNA核酸内切酶切割DNA。   3  自由基损伤   在诱发细胞凋亡的诸多因素中，内源性或外源性因素产生的自由基增多均被证实可诱导细胞凋亡10。Tory等11通过特异性抑制PC12神经细胞系中Cu-Zn-SOD合成，证明SOD活力下降可导致细胞凋亡，这种凋亡是氧自由基诱导的。Lennon等对4种不同造血细胞HL60、U937、Molt-4和Daudi进行体外培养，发现活性氧（reactive oxygen speci

9、es,ROS）直接引起细胞凋亡。刘戎等12证实ROS可诱导细胞凋亡，抗氧化剂可阻断细胞凋亡的发生。缺氧导致的细胞内Ca2+浓度增加，可以增强Ca2+依赖性蛋白激酶的活性，促进自由基的生成，还可以协同其他因素（如GSH下降）引发线粒体大量产生ROS。氧自由基化学性质活泼，破坏机体正常的氧化/还原的动态平衡，造成生物大分子（核酸、蛋白质、脂质）的氧化损伤，干扰正常的生命活动，形成严重的氧化应激（oxidative stress）状态，机体氧化损伤的后果之一就是诱导细胞凋亡。   自由基可以通过以下途径导致细胞凋亡：氧自由基引起的DNA损伤可激活P53基因；氧自由基引起的DNA损

10、伤可活化多聚ADP核酸合成酶，引起NAD快速耗竭，ATP大量消耗；氧自由基攻击细胞膜上的不饱和脂肪酸，通过脂质过氧化作用直接造成细胞膜的损伤;细胞膜中不饱和脂肪酸（如：花生四烯酸）的氧化产物过氧羟基24碳四烯酸可诱发细胞凋亡；氧化应激激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶，也可以产生膜的发泡现象；氧化应激引起细胞膜的结构破坏，可改变细胞膜的通透性使Ca2+内流增加；自由基对线粒体膜的损害导致其通透性和膜电位改变；氧化应激可活化转录因子NF-B、AP-1，加速细胞凋亡相关的一些基因表达13；氧自由基通过影响某些酶活性蛋白质的活性，诱发细胞凋亡14。    4

11、0; 低氧诱导因子-1与P53   近年的研究显示严重或持续缺氧时，缺氧诱导因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）可诱导细胞凋亡，Helton等15在成年大鼠脑缺氧研究中，发现敲除大脑HIF-1基因后可引起凋亡基因表达水平下降，从而减少大脑细胞发生凋亡。HIF-1是细胞及组织缺氧情况下产生的一种氧依赖的转录激活因子，广泛存在于哺乳动物体内，能诱导多种缺氧反应性表达，使细胞及组织产生一系列反应以适应缺氧环境16。HIF-1为缺氧应答的全局性调控因子，在缺氧诱导的哺乳动物细胞中广泛表达，对缺氧具有特异感受性，参与体内许多缺氧反应性基因的转录调

12、节，在低氧性肺损伤介导的细胞凋亡中有着重要的作用。HIF是由和亚基组成的异二聚体，亚基表达受低氧诱导，亚基则属构建型表达。序列同源性亚基目前认为有三种：HIF-1、HIF-2（也称为EPAS1、MOP2、HLF、HRF）、HIF-3，三者均受氧调节，是调节HIF活性的功能亚单位，三者在结构和功能上有许多相似之处。而亚基不受调节细胞周期基因p53、p21、Bcl-2蛋白的调节，常氧时，HIF-1通过泛素-蛋白溶解酶体通路降解而几乎检测不到，因其t1/2很短（约5min）。但细胞低氧时（如1%氧浓度）其t1/2增加到约30min。HIF-1调节的基因涉及细胞能量代谢、离子代谢、儿茶酚胺代谢及血管的

13、发生，其介导转录的基因包括：促红细胞生成素（Epo）、血管内皮生长因子（VEGF）、葡萄糖转运蛋白1和3、血红素氧化酶l、运铁蛋白、转铁蛋白受体基因及编码p53、p21、Bcl-2的基因。   缺氧可能是p53最常见的生理诱导因素。研究发现体内缺氧诱导的凋亡所必需的p53能抑制HIF-1转录激活。p53蛋白是一种定位于细胞核的磷蛋白，能够促进细胞的终末分化和细胞凋亡，机体各组织均有p53表达，但快速的代谢转换使正常细胞的p53蛋白量维持于低水平。除了与凋亡密切相关，p53还被证实是一种转录因子，介导下游基因的转录17。相关实验证实，低氧能增加神经细胞、心肌细胞、肿瘤细胞等的

14、凋亡以及凋亡相关因子p53，Bax表达的显着变化。国外有学者认为，低氧环境下产生两种形式的p53，即野生型p53和突变型p53，分别在细胞凋亡和血管生长过程中发挥重要作用。有学者证实缺氧可诱导野生型胚胎干细胞p53的表达，但在HIF-1基因缺陷的胚胎干细胞中，p53蛋白水平则没有明显变化，从而推测缺氧时p53蛋白水平的升高是HIF-1依赖性的。并证实HIF-1是通过直接结合p53，增加后者稳定性，从而促进细胞发生凋亡18。但Chen D19在体外实验发现HIF-1不能直接结合p53，而是直接与起桥梁作用的p53泛素连接酶Mdm2结合，HIF-1通过抑制Mdm2介导的p53降解并阻止Mdm2介导

15、的p53核转移，增加p53稳定性。活化的p53进入核内，通过调控其下游基因p21/Waf1/Cip1和bax的表达，启动相应的细胞信号途径，或通过诱导线粒体通透性改变而直接转位至线粒体，引起细胞周期停滞，启动细胞凋亡程序。             5  Fas/Fas L   Fas蛋白是细胞膜上的跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体家族，由胞外外结合区、跨膜区及胞浆内区域构成。作为一个膜受体，Fas蛋白可以和T淋巴细胞表面的配体结合，也可以与抗Fas的抗体结合

16、，从而启动细胞凋亡。Fas蛋白介导细胞凋亡的机制可能有：Fas L或抗Fas的抗体与Fas蛋白结合，引起神经鞘磷脂酶的活性迅速上升，使神经鞘磷脂分解产生神经酰胺，神经酰胺作为第二信使激活相应的蛋白激酶，从而诱导细胞凋亡。抗Fas抗体或肿瘤坏死因子与Fas蛋白结合后可以激活ICE（IL-1converting enzyme）样的caspase，后者可以降解H1组蛋白，使染色体松弛，DNA链舒展，而暴露出核酸内切酶的酶切位点，使DNA链更容易被切割。Fas蛋白激活后也可以通过Ca2+信号传递死亡信息而导致细胞凋亡。此外，近年来研究发现，在FAS/FAS L诱导的细胞凋亡过程中，FAS和FAS L交

17、联能够引起细胞内ROS含量增加和细胞氧化还原状态的改变。Suzuki等20用化学荧光指示剂Chemluminescence（该指示剂能与包括O2、OH、单线氧等各种ROS反应）观察B淋巴瘤细胞株BJAB和Ramos以及T淋巴细胞性白血病细胞株Jurkat在Fas/Fas L交联后胞内ROS含量变化，发现Fas/Fas L交联引起细胞内特异性ROS迅速产生，因此，Fas/Fas L还可以通过自由基的作用导致细胞凋亡。   总之，缺氧是许多疾病发展过程中一个重要的病理过程，细胞凋亡是缺氧损伤的重要形式，缺氧可通过线粒体损伤、Ca2+超载、自由基、HIF-1、P53、Fas/Fa

18、s L等多种途径导致细胞凋亡。【参考文献】  1 曹立珍,毛一卿,谭焕然.异丙肾上腺素对大鼠心肌细胞凋亡相关基因表达的影响J.药学学报,2000,35(11):801-8052 李长龄,陈世忠,王银叶,等.实验性心肌缺血时内源性ET,CGRP和NO水平的变化及心舒平的调节作用J.中国中药杂志,2002,27(7):534-5373 李建宇,李灵芝,龚海英,等.蕨麻对缺氧诱导心肌细胞凋亡的影响J.中华老年心脑血管病杂志,2007,9(9):619-6224 周舟,王小华,朱光旭,等.缺氧诱导心肌细胞凋亡与Caspase-3 激活及细胞内钙超载的关系J.中国应用生理学杂志,2005,21

19、(1):10-145 李雅莉,赵玲,张兰,等.二苯乙烯普对缺糖缺氧致海马神经元凋亡的影响J.中国新药杂志,2007,16(20):1670-16726 张颖,李树清.线粒体脑缺血神经元凋亡信号转导途径J.中国微循环,2007,11(5):343-3457 Camilleri BS,Vanderwerff H,Caldwell E,et al.Distinct alterations in mitochondrial mass and function characterize different models of apoptosisJ.Exp Cell Res,1998,239(2):277

20、-2928 Li LY,Luo X,Wang X.Endonuclease G is an apoptotic Dnase when released from mitochondriaJ.Nature,2001,412(6842):95-999 刘胜中,杨双强.细胞凋亡与心肌缺血/再灌注损伤J.心血管病学进展,2007,28(4):613-61710Buttke TM,Sandstrom PA.Oxidative Stress as a mediator of apoptosisJ.Immunol Today,1994,15(1):7-1011Troy CM，Shelanski ML.Down-regulation of copper/zinc superoxide dismutase causes apoptotic death in PC12 neuronal cellsJ.Proc Natl Acad Sci USA,1994,91(14):6384-638712刘戎,宣昭林.活性氧、线粒体与细胞凋亡J.中国地方病防治杂志,2005,20（5）:30-3313金惠铭,王建枝主编.病理生理学M.第6版.北京:人民卫生出版社,2004.13614梁幼雅，刘四军，张熔文,等.不同中医疗法对缺氧/复氧大鼠心肌细胞凋亡的干预作用J.中国现代药物应用,2007,1(6):