一氧化氮在萘乙酸诱导不定根形成过程中的作用研究_图文

1、第39卷 第4期陕西师范大学学报(自然科学版Vol.39 N o.4 2011年7月Journal of Shaanx i Norm al U niversity(Natur al Science EditionJul.,2011文章编号:1672 4291(201104 0060 05一氧化氮在萘乙酸诱导不定根形成过程中的作用研究黄爱霞, 佘小平*(陕西师范大学生命科学学院,陕西西安710062关键词:一氧化氮;一氧化氮合酶;绿豆插条;萘乙酸;不定根形成中图分类号:Q945 文献标志码:AThe role of nitric oxide in1 naphthylaceticacid indu

2、ced adventitious roots formationH U ANG Ai xia,SH E Xiao ping*(Co lleg e of Life Science,Shaanxi N ormal Univer sity,Xi an710062,Shaanx i,China Abstract:T he r ole of nitr ic ox ide(NOin naphthaleneacetic acid(NAA induced adventitio us roots formation in m ung bean(Phaseolus radiatus L.hy pocotyl cu

3、ttings w as studied.The results show ed that,com pared w ith the control,both NO donor sodium nitroprusside(SNPand NAA sig nificantly raised number,fresh and dry w eight of adventitious roo ts.T he treatm ent with com plex of NAA and SNP resulted in significant increase in adv entitious roo ts numbe

4、r compared w ith the treatment using SNP or NAA alone.Carboxy 2 phenyl 4,4,5,5 tetramethy limidazo line(c PTIO,a NO specific scaveng er,effectively inhibited NAA induced adventitious r ootfor matio n,and the optimal co ncentration w as200 mo l/L.Furthermor e,inhibitor o f nitr ic ox ide synthase(NOS

5、,N' nitro L arg inine methy l ester(L NAMEpartly inhibited the effect from NAA,the optimal co ncentration w as30mm ol/L.Detection of endo geno us NO show ed that the lev el of NO w as obviously prom oted by NAA,how ever,innibitd by c PTIO and L NAME.A ll results m entioned above indicated that N

6、O plays a key r ole in NAA induced adv entitious roo ts for matio n,and NOS is involved in the generation of NO in this pro cess.Key words:nitric ox ide;nitric oxide synthase;m ung bean cutting s;NA A;adventitious r oot收稿日期:2011 03 30基金项目:陕西省自然科学基金青年人才项目(2009JM3001;中央高校基本科研业务费专项资金项目(G K200902037;陕西师

7、范大学青年基金资助项目(200801003.第4期黄爱霞等:一氧化氮在萘乙酸诱导不定根形成过程中的作用研究61for matio n1 材料与方法1.1 植物材料绿豆(P haseolus r adiatus L.品种为陕农 20,购自西安市雁塔区种子公司.1.2 主要化学试剂SN P(Na2Fe(CN5NO 2H2O,N O供体、L NAME(N nitro L arginine m ethyl ester,动物NOS抑制剂,DAF 2DA(4,5 diam ino fluor escein diacetate,NO特异荧光探针购自Sigma公司,c PT IO(carbox y 2 phe

8、nyl 4,4,5,5 tetram eth y lim idazoline,NO特异清除剂购自Merck公司,其他试剂均为国产分析纯.1.3 试验材料培养及插条制备选取子粒饱满、大小一致的绿豆种子用0.1%的H g Cl2灭菌5min,自来水冲洗干净,(25 2 下以双蒸水浸种催芽24h后,播于盛有干净湿沙的搪瓷盘中,于(28 2 暗处培养48h,移入光照培养箱内培养(每天光照14h,光强10000lx,温度(25 2 .选取培养5d的绿豆幼苗,从子叶节下6cm处切去原有根系,所得生根试验插条包括一对真叶、一对子叶、上胚轴及部分下胚轴.1.4 诱导生根将上述插条分别插入盛有30mL处理溶液或

9、双蒸水的三角瓶中处理24h,以双蒸水处理为对照.处理时插条下端均浸入液面下2cm,每处理3个重复,每重复10个插条,置于光照培养箱(每天光照14h,光强10000lx,温度25 2 中.在处理时间内,每24h以相同浓度新鲜溶液更换一次.处理时间到后,将溶液更换为双蒸水,此后双蒸水亦每24h更换一次,直到处理第7天统计生根为止.处理第7天统计长出胚轴表面1mm以上的根数,测量根长、鲜重和干重.1.5 内源NO荧光检测2 结果与分析2.1 SNP和NAA对不定根发生的效应SNP为一种NO供体,0.5mm ol/LSNP能释放出2.0 mo l/L的NO5.不同浓度SNP对绿豆62陕西师范大学学报(

10、自然科学版第39卷下胚轴插条生根的影响如图1. 图1 SNP 对绿豆下胚轴插条生根的影响Fig.1 Effect of SNP on the rooting ofm ung bean hypocotyl cuttings由图1可见,与蒸馏水和300 mol/L NO -2/NO -3(NO 体内代谢产物处理相比,所试浓度SNP 均显著促进绿豆下胚轴插条不定根产生,且表现明显的浓度效应.即在300 mol/L 以下时,随浓度增加,生根数明显增加;超过300 mol/L 以后,生根数则逐渐下降,此时插条基部因受高浓度SNP 的毒害而逐渐表现出失水萎蔫等外观伤害症状,生根部位也逐渐上移到液面以上部位

11、.300 mo l/L 为SNP 促进绿豆下胚轴插条生根的最适浓度,其生根数比对照增加了304.48%.与蒸馏水相比,300 mo l/LNO -2/NO -3处理并未显著增加插条生根数,表明SNP 的生根效应与其本身释放的NO 有关,但与NO 在植物体内的代谢产物无关.NAA 为生长素类似物,能够显著诱导插条不定根形成,具有显著的浓度依赖效应(表1.不同浓度NAA 与300 mol/L SNP 混合处理的根数高于两者单独处理.因NAA 诱导的根较为粗、短,与SNP混合处理后根长增加明显.以300 mol/LSNP 与20 mo l/LNAA 混合使用的效果最好(表1.表1 SNP 与NAA

12、复合处理对绿豆下胚轴插条生根的效应Tab.1 Ef fect of mixture of NAA and SNP on the rooting of mung bean hypocotyl cuttings 处理/( mo l L -1插条/根数根长/mm 对照7.10 0.40 5.27 0.24SN P(30023.40 1.63 5.24 0.25N A A (113.40 1.12 5.36 0.21N A A (1+SN P(30025.95 1.42 5.61 0.31N A A (1022.89 2.19 3.56 0.27N A A (10+SNP (30025.35 2.22

13、 2.30 0.35N A A (2018.30 2.56 1.89 0.26N A A (20+SNP (30034.25 2.21 5.56 0.47N A A (50N A A (50+SNP (30020.35 2.282.96 0.342.2 c PTIO 和L NAME 对NAA 诱导不定根发生的效应外源SN P 显著促进插条生根(图1和NAA 与SNP 混合处理的生根效果好于各自单独处理(表1的结果暗示,NAA 和N O 在生根诱导机制中可能有一定关联.为进一步探讨NO 在NAA 诱导不定根形成中的作用,我们使用了NO 特异清除剂c PTIO 和动物NOS 抑制剂L NAM E(

14、可抑制NOS 催化的NO 的生成处理插条.表2显示,与对照相比,30mmo l/L L NAM E 或200 m ol/L c PTIO 单独处理显著延缓或抑制了不定根发生,表现为生根数显著减少,根长被抑制,鲜重和干重也明显降低,表明NO 在不定根发生和发育过程中有重要作用.另外,L NAM E 和c PTIO 也显著抑制或延缓了NAA 诱导的不定根发生,表明NO 在NAA 诱导生根过程中可能起信号传递作用.表2 L NAME 和c PTIO 对绿豆下胚轴插条生根的影响Tab.2 Eff ect of L NAME or c PTIO on the rooting of mung bean h

15、ypocotyl cuttings 处理/( mol L -17.90 1.852.53 0.265.100.10第4期黄爱霞等:一氧化氮在萘乙酸诱导不定根形成过程中的作用研究63表2还显示,无论NAA 是否存在,L NAME 对生根的抑制效果均显著弱于c PTIO,这可能由于L NAM E 为NO 合成底物L 精氨酸(L Ar g的类似物,其作用方式为与L Arg 竞争NOS 的催化部位进而抑制NOS 活性,而L Arg 作为一种代谢物在植物体中含量较高,所以与其竞争抑制NOS 活性所需的L NA ME 浓度也就较高8.2.3 NAA 对NO 产生的效应如图2所示,内源NO 检测结果表明NA

16、A 显著促进了内源NO 的产生,通过NO 特异的荧光探针结合激光共聚焦显微镜检测到N O 主要分布在正在形成的不定根根原基中,推测其可能与根原基的发育有密切关系.对照插条仅在基部02mm 区域检测到NO(图2a,b,而NAA 处理插条基部02m m 和35mm 都检测到NO 产生(图2c,d,此与NAA 处理显著增加插条生根数一致(表2,表明NO 参与了N AA 诱导的不定根形成. 图2 NAA 对绿豆下胚轴插条基部内源NO 产生的效应Fig.2 Ef fect of NAA on endogenous NO production in basal part of mung bean hypo

17、cotyl cuttings图中a 、b 分别为对照插条基部02mm 和35mm 下胚轴横切片;c 、d 分别为N A A 处理插条基部02mm 和35mm 下胚轴横切片.3 讨论NO 在常温下为气体,在水中溶解度很小,极易透过细胞膜扩散,半衰期约为35s.硝普钠(SNP是一种重要的NO 供体,被植物体吸收后能够释放NO9.Delledonne 等证明0.5mmo l/LSN P 处理大豆悬浮细胞培养液2h 时能稳定产生约2.0 mol/L 的NO5.有研究表明NO 影响根的生长,使用多种释放NO 的化学药品对玉米离体根进行处理时发现,一定浓度的SNP 等能够促进玉米根尖的生长,而NO 清除剂

18、亚甲基蓝能阻断这种作用10.Pagnussat 等人发现外源NO 可明显诱导黄瓜下胚轴不定根的发生,且呈浓度依赖效应11.我们前期的实验结果也表明NO 在不定根形成和发育中起着至关重要的作用,并且主要分布在根原基的分生组织中12.本实验对NO 在NAA 诱导的不定根形成过程中的作用进行了研究.SN P 对绿豆下胚轴生根的影响具有明显的浓度依赖效应,即较低浓度时(100300 mol/L 随浓度增加,生根数明显增加.SN P 促进插条生根的最适浓度为300 mo l/L,超过此最适浓度后,插条生根数随浓度增加而逐渐下降,同时插条基部出现失水萎蔫等外观伤害症状.这与N O 本身是一种自由基,低浓度

19、时有生物效应,浓度高时则表现细胞毒性作用的观点13是一致的.作为常用的人工合成生长素,NAA 能有效促进不定根发生,其诱导的不定根形态较粗、短14.SNP 处理形成的不定根形态较细长.本文的研究表明,NAA 与SNP 混合处理对绿豆下胚轴插条不定根发生的促进效应明显大于单独处理,NO 清除剂c PTIO 与NAA 共同处理则显著抑制NA A 诱导生根的效应,暗示在NAA 诱导绿豆插条的生根过程中NO 起着重要作用.内源NO 检测结果表明NAA 处理能够显著诱导绿豆下胚轴插条基部35mm区域NO 水平提高,且N O 主要分布在正在发育的根原基中.这些结果表明NA A 可能通过诱导NO 生成促进绿

20、豆插条不定根发生,NO 可能作为生长素信号转导途径的下游分子起作用,这与在黄瓜中的研究结果相一致11.在动物中早已证实NO 是由L Arg 、NADPH 和分子氧通过NOS 催化形成,该反应的终产物为L 瓜氨酸、N O 和N ADP +15.不少NOS 蛋白已被纯化,基因已被克隆16.植物体中也已证实有NOS存在,如Delledonne 等5和Durner 等17分别在烟草和大豆中检测到了NOS 活性,并且发现这种活性受动物NOS 抑制剂L NAM E(N G mono methy l64陕西师范大学学报(自然科学版第39卷L arg inine和LNNA(N W nitro Lar gini

21、ne等的抑制.本文的结果证明,动物NOS抑制剂L NAME 明显抑制NAA诱导的绿豆下胚轴插条生根,表明绿豆插条不定根发生过程中存在类似动物的NOS,同时说明NOS及其催化产物NO在NAA诱导的绿豆插条不定根发生中起重要作用.4 结论本文研究得到如下结果:(1合成生长素NAA 和NO供体SNP均明显诱导不定根发生且二者间有累加效应;(2NO清除剂c PTIO和NO产生酶NOS抑制剂L NAME均显著降低NAA诱导的不定根发生;(3N AA确实诱导了下胚轴插条基部3 5mm区域NO产生.这些结果清楚地表明,N O作为信号分子参与了NAA调节的不定根发生.参考文献:1K oshkand D E.T

22、 he mo lecule of the yearJ.Science,1992,258:1861 1861.2Daw so n T M,Dawson V L.N it ric ox ide:act ion andpatho lo gical ro lesJ.N eur oscientist,1995,1:7 9. 3Bethke P C,Gubler F,Jacobsen J V,et al.Do rmancyof A r abido psis seeds and barley g rains can be bro ken by nitr ic ox ideJ.Planta,2004,219:

23、847 855.4H uang Aixia,She X iaoping,Huang Chen,et al.T hedynamic distributio n o f N O and NA DP H diaphor ase activ ity during IBA induced adv entitio us ro ot for mation J.P hy siolog ia P lantarum,2007,130:240 249. 5Delledo nne M,Xia Y iji,D ixo n R A,et al.N it ric o xidefunctions as a signal in

24、 plant disease resistanceJ.N ature,1998,394:585 588.6Clar k A,Desikan R,H ur st R D,et al.NO w ay back:nitr ic o xide and pro gr ammed cell death in Ar abido psis thaliana suspension culturesJ.T he Plant Jour nal, 2000,24:667 677.7M ata C G,Lamatt ina L.N itr ic o x ide induces sto matalclo sur e an

25、d enhances the adaptiv e plant r espo nse against droug ht st ressJ.P lant Physio log y,2001,126:11961204.8Lum H K,Butt Y K C,L o S C L.H ydrog en per ox ideinduces a rapid pro duction of nitric ox ide in mung bean (P haseo lus aureusJ.N itr ic ox ide:Bio lo gy and Chemistr y,2002,6:205 213.9Brune B

26、,Lapetina E G.Activ atio n of a cy tosolic A DPribosy ltr ansfer ase by nitr ic ox ide generat ing ag entsJ.Jo ur nal of Biolog y Chemistry,1989,264:8455 8458. 10Go uv a C M C P,So uza J F,M aga lh es A C N,et al.NO r eleasing substances that induce gr ow th elongat ion in maize ro ot seg ment sJ.Plant Gr ow th Regulat ion,1997,21:183 187.11Pag nussat G C,Lanteri M L,L amattina L.N itr icox ide and cyclic GM P ar e messeng ers in the indole acetic induced adventitious r oot ing