水痘减毒活疫苗的研究进展.docx

1、水痘减毒活疫苗的研究进展甘霖I,王明丽'，陈敬贤u1.安徽医科大学微生物学教研室，合肥230032；2.美国酊伦比亚大学病理与细胞生物学教研室，纽约10032摘要:水痘是由水痘-带状疱疹病毒(VZV)引起的种高传染性疾病。接种疫苗是预防和控制VZV流行的最有效手段。美国从1995年开始实施儿童接种水痘疫苗的政策，显著降低r水痘相关疾病的发病率和病死率。近年来，水痘疫苗在我国应用越来越广泛。本文就水痘减毒活疫苗Oka株的研发，疫苗的有效性、安全性,病毒减毒的分子生物学特征和免疫策略等方面进行综述，以期能更全面地认识水痘减毒疫苗在预防和控制VZV传播方面所起的作用。关键词:水痘带状疱疹病毒

2、;Oka疫苗株；水痘疫苗ProgressinvaricellavaccineresearchGANLin1,WANGMing-Li1,JasonChen1,2I.DepartmentofMicrobiology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China;2.DepartmentofPathologyandCellBiology,ColumbiaUniversityNY10032,USAAbstract:Varicellaisahighlycontagiousdiseasecausedbyvaricella-zostervirus(VZV).Vaccina

3、tionhasprovidedthebestmeanstocontrolinfection.Anumberofcountriesmaintainauniversalchildhoodvaccinationpolicysince1995,resultinginadramaticdecreaseintheincidence,morbidityandmortalityrelatedtovaricella.Inthisarticle,wereviewthedevelopmentofvaricellaOkavaccine,theresearchinvaccineefficiencyandsafety,t

4、hemolecularmechanismofattenuation,aswellasnewideasinimmunizationstrategy,summarizingthecurrentadvancesandlimitsofthevaricellavaccinesinceitsworldwideapplication.Keywords:Varicella-zostervirus;Okastrains；Varicellavaccine水痘-带状疱疹病毒(varicella-zostervirus,VZV)属疱疹病毒a亚科,为双链DNA病毒，其原发感染为水痘，潜伏感染再激活时可引发带状疱疹。水痘

5、通常表现为轻症自限性疾病，伴有特征性皮肤疱疹,偶尔会出现严重的并发症，包括细菌继发感染、败血症性休克、肺炎和脑炎，病死率较高。成人发生水痘虽然比较少见，但出现严重并发症的概率明显增加。严至的并发症在免疫缺陷患者中更常见，免疫缺陷儿童中有50%的水痘患儿会发生并发症。带状疱疹是体内潜伏的VZV被激活所致，多发生于成人、老人和免疫缺陷的个体，临床表现主要是神经痛及沿周围神经分布的水疱样皮疹,随着年龄增大，带状疱疹所致的神经痛症状越为明显，持续时间更长。基金项目：国家自然科学基金(30872253)；安徽省科技攻关计划(08010302179)通信作者：陈敬贤，E-niail：jc28Columbi

6、a,eduCorrespondingauthor：JasonChen,E-mail:jc28C世界卫生组织(WorldHealthOrganization,WHO)建议水痘疾病相对严重的国家普及疫苗接种。日本和美国分别于1987年、1995年开始推行给易感儿童接种疫苗。迄今VZV减毒疫苗株v-Oka已在日本、美国、韩国、中国和欧洲许多国家相继被用于预防水痘。本文就水痘Oka疫苗的研发，疫苗的安全性、有效性，病毒减毒的可能分子机制和有关免疫策略的新思路等进行综述，以期能更全面地认识水痘减毒疫苗在预防和控制VZV传播方面所起的作用。1水痘疫苗的有效性研究1974年日本学者Ta

7、kahashi等从1名典型的水痘患儿水疱液中分离得到Oka疫苗株的亲本(pOka)，后经在豚鼠胚胎成纤维细胞和人成纤维细胞株(WI-38,MRC-5)多次传代后,获得了VZV减毒疫苗株v-Okao疫苗首先在健康的儿童志愿者中进行试验，结果显示，疫苗不仅具有良好的安全性和免疫原性，而且有助于防止水痘在易感儿童之间传播。对接种该疫苗的儿童所进行的长期抗体水平检测显示，两年以后98%儿童的血清VZV抗体仍保持阳性,初步说明疫苗具有长期的保护作用。在临床早期的有效性研究中，美国采用了随机、双肓、设置安慰剂对照的方法，在健康儿童中检测1次接种Oka疫苗（Merck公司）后第1年的有效率,结果为100%”

8、。随后芬兰采用相同的方法进行研究'显示Oka疫苗（GlaxoSmithKline公司）的有效率90%。水痘疫苗上市并广泛应用后，美国曾在加利福尼亚、得克萨斯和宾夕法尼亚3个州监测疫苗使用后的水痘发病情况。数据显示，在此期间这3个州水痘发病率下降近80%，与水痘相关的住院率下降88%,水痘引起的病死率下降66%,而且减毒活疫留的使用没有增加带状疱疹的发病率。澳大利亚从1999年开始使用Oka疫苗，结果14岁儿童中水痘相关的住院病例呈逐年下降趋势5。所有这些资料都显示水痘疫苗在降低VZV所致疾病的发病率和病死率方面十分有效。另一项研究为通过检索19952（X）6年PubMed中关于水痘疫苗

9、有效性的报道来总结疫苗的免疫效果。研究者根据报道中水痘患者皮肤疱疹的数量以及是否存在并发症等将病例分为轻微（皮疹50个）、中等（皮疹50-500个）、严重（皮疹500个或存在严重并发症）。结果显示，水痘疫苗对所有类型水痘的总预防效果为44%-100%,预防中等与严重之间水痘的效果为86%100%,预防严重水痘的效果是100%。总之，根据10多年来世界上多个国家的实践经验,v.Oka疫苗的预防效果是值得充分肯定的。2水痘疫苗减毒机制的研究NCR:nonccMlingregion；ORFreadingframe(GomiY,etal.,2002.图1v-Oka与p-Oka基因组之间的核昔酸差异Fi

10、g1.MutationsbetweentheOkavaccinevirus(v-Oka)andtheparentvirus(p-Oka)随着分子生物学技术的不断发展，人们开始从分子水平研究v.Oka水痘减毒活疫苗的减毒机制。首先，通过比较减毒后的v-（）ka与减毒前的亲本pOka的全基因序列来了解它们在分子水平上的差别。对病毒基因组的多个部分用聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）扩增，然后克隆PCR产物或直接对PCR产物测序。比较v-Oka与p-Oka的全基因序列，发现两者之间只有42个碱基发生了改变。DNA序列分析认为，其中有20个碱基改变导致了氨基酸发生转

11、换，有17个是沉默突变，另外5个发生在非编码区。令人惊讶的是，在42个碱基改变的位点中有15个落在开放读码框架（openreadingframe,ORE）62中，其中包括8个氨基酸置换，提示ORF62的基因突变可能与p.Oka的减毒有重要关系。ORF62（以及它的重复拷贝ORF71）编码立刻早期蛋白IE62JE62是VZV的主要转录激活因子，直接参与病毒复制。除了IE62以外，其他12个氨基酸发生置换的位点分别位于ORF6、9A、10、21、31、39、50、52、55（1）.55（2）、59和64（图1）。核酸序列研究发现，v.Oka是由不同的病毒株组成的混合体。有研究者通过空斑纯化方法从V

12、-Oka疫苗获得13个不同的分离株。对它们的ORF62序列进行分析，发现有的株囊括了所有与pOka不同的8个氨基酸(如S70株)，最少的也有5个氨基酸改变(如S7-13株)。为了研究这些不同氨基酸的改变对病毒生物学性状的影响，通过比较S7-01、S7.13、v.Oka和p-()ka在人胚肺成纤维细胞中形成的空斑大小，发现P-Oka形成的空斑最大，依次为S713、vOka、S7Ql。进一步利用感染性中心试验(infectiouscenterassay)来计数病毒感染的细胞数量，结果显示pOka感染细胞的数量是v-Oka的2.1倍，是S7-13的2.6倍，是S7Q1的4.2倍。以上结果提示,不同的

13、v-Oka克隆之间在病毒复制效率方面存在一定差异，p-()ka株的复制效率高于vOkao因此,IE62中氨基酸的改变可能导致病毒复制效率以及病毒在细胞之间的传播能力下降。对临床分离的VZV病毒株的ORF62序列进行分析,发现所有的临床分离株都与P-Oka一样，在ORF62均有15个碱基位点与v-Oka不同口。因此ORF62的变化很可能是p-Oka发生减毒作用的主要分子机制。ORF62中这些单一核昔酸的变化还导致一些酶切位点的改变，如BssH",NaeI和SmaIo分析ORF62中的SgI酶切位点的改变能区分V.Oka疫苗株与VZV野生型毒株口°。为了更有效地研究v.Oka的

14、减毒机制，有研究者用细菌人工染色体技术(bacterialartificialchromosome,BAC)克隆(p-Oka的全基因组p-OkaBAC可以在大肠埃希菌(Escherichiacoli,E.coli)DH10B中稳定增殖，从E.coli中提取的DNA转染人胚肺成纤维细胞后可观察到典型的细胞病变，并可传播给邻近的细胞。P-OkaBAC使得研究v-Oka减毒作用的分子机制变得更为简便。3水痘疫苗的安全性研究Merck公司制造的v-Oka水痘减毒活疫苗Varivax于1995年被批准上市，现已应用于世界上46个国家。多个国家的学者对疫苗的免疫效果和安全性做了更多、更全面的研究。Merc

15、k公司本身贝。通过SpontaneousPostmarketingAdverseExperience和VaricellaZosterVirusIdentificationProgram(VZVIP)途径来获取疫苗安全性方面的信息。前者是Merck公司从世界各地收集与应用有关Varivax不良反应的信息反馈系统，情报资料来自医护人员和疫苗接种者及家属的主动报告和医学文献中相关案例的收集，所收集的不良反应主要包括突破感染(breakthrough)和二次传播(secondarytransmission)等。突破感染是指接种疫苗者在42d后患上水痘(42d以内出现皮疹可能由疫苗所致)，说明疫苗在这些

16、个体中没有起到应有的保护作用。二次传播是指接种疫苗者发生感染以后将疫苗病毒传播给了未接种疫苗的个体，导致后者发生了由v-Oka疫苗株引起的感染。Merck公司在19952005年的10年间共向全世界销售了55700000人份的Varivax,一共收到了16683例不良反应报告。VZV毒株分型(VZVidentificationprogram,VZVIP)是利用PCR结合限制性内切酶酶切的方法,将水痘病人的VZV区分为野生型毒株或疫苗株的一项研究课题。临床标本取自下列疫苗接种者:42d内出现50个水疱疹、突破感染、带状疱疹，伴有并发症以及疑似为二次感染的患者，分型工作由纽约哥伦比亚大学附属儿童医

17、院完成。各类不良反应的统计结果如下:接种疫苗后42d内出疹:一共有3192例报告接种疫苗后42d内出现皮疹，其中水痘样皮疹占51%,65%发生在接种后14d内。经VZVIP研究发现，由野生型VZV引起的皮疹发生较早，疫苗接种后2周内出现皮疹的84%是由野生型VZV引起的；而疫苗株引起的出疹发生较迟,36周出现皮疹的83%是由v-Oka株所致。突破感染：关于突破感染的报道有5054例，发生率为0.9/10万。其中大约1%的患者属于病情较为严重(皮疹50个)。在所有突破感染的病例中，经检测均未发现v.Oka疫苗株VZVO带状疱疹:接种疫苗后发生带状疱疹的报道共有697例，患者的年龄在13个月和68

18、岁之间，中位数为3.4岁。用PCR分型技术对其中的95例进行了病毒分型，由v-Oka疫苗株引起的为57例，野生型VZV引起的有38例。进一步分析表明，带状疱疹出现的位置与疫苗接种的位置高度相关。神经系统的不良反应:用PCR分析接种疫苗后出现神经系统不良反应的30例患者的脑脊液，发现仅有2例存在VZVDNA,其中1例为野生型VZV,而另1例未能确定基因型。二次传播:通过VZVIP确认的二次传播有3例,其中1例是30岁孕妇，她的1岁男孩在接种疫苗后的第24天出现约30个皮疹，此后的第16天，母亲出现水痘。另1例为4个月男婴，19d前他不到2岁的哥哥在接种疫苗2周后出现25个皮疹°还有1例

19、为35岁的父亲感染了水痘，他的1岁男孩在接种疫苗17d后出现12个皮疹。所有3例病人都与家庭中的疫苗接种者有过密切的接触。播散性感染:在所有的疫苗接种者中，共有7例播散性的VZV感染被确认是由V-Oka引起的，其中6例为免疫缺陷病患者，另1例为唐氏综合征病人。10年的监测研究显示，v.Oka疫苗(Varivax)的使用显著降低了水痘相关的住院率、病死率和医疗费用。大多数不良反应都不严重：2/3的报告病例表现为发热、出疹或者注射部位反应;诸如脑膜炎这样的严重并发症极为少见，旦主要发生在细胞免疫损伤的患者中。目前看来,v-()ka疫苗具有普遍的耐受性和良好的安全性，但继续监测它的安全性是很必要的。

20、4免疫策略的探讨最近有研究显示在接受水痘疫苗免疫接种的儿童中水痘的发病率有上升趋势，但是这些突破感染大多未引起严重的临床症状。因此，研究者开始关注如何更加有效地使用水痘疫苗。哥伦比亚大学的Gershon教授认为，以前检测血清中VZV抗体含量的方法可能不够准确，所检出的抗体中包括了许多对感染不起保护作用的抗体，因而对疫苗的免疫效果估计偏高。使用能够更好地反映保护性抗体的膜免疫荧光抗体方法(fluorescentantibodytomembraneantigen,FAMA)，检测一次免疫接种后儿童血清阳性率只有76%,6，因此有必要增加免疫接种的剂量。已有报道显示增加接种剂量是安全的，并可显著增强

21、免疫应答。以VZV病毒糖蛋白为抗原的酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)检测VZV抗体，显示二次接种麻疹-风疹-腮腺炎水痘四联疫苗比一次接种的阳性率从89%上升到99%，血清中抗体的几何平均效价从13.0u/ml上升到588u/ml171o而同时其他3种病毒(麻疹风疹-腮腺炎)的相应抗体效价并未明显提高，提示VZV病毒与其他病毒不同，一次免疫所产生的免疫反应不够完全。另一项长达10年以上的研究发现,二次免疫比一次免疫受体发生突破感染的概率要低。所以初次接种水痘疫苗以后，在适当的时候再加强免疫1次，将会获得更好的预防效果。另外，疫苗的覆盖

22、率对疫苗的预防效果也有影响。日本从1987年开始推荐在12个月的易感人群中应用水痘疫苗，但是并没有列入计划免疫接种的范围，1987-2005年疫苗接种的覆盖率只从6.8%增长至32.1%,水痘的流行病学特征和自然感染率并没有发生明显改变3】。如果能将水痘疫苗列入计划免疫范围，将大大增加水痘疫苗的免疫接种覆盖率。在此基础上，再实施加强免疫1次来保持疫苗接受者抵抗野生型VZV感染的能力，将可能逐步减少野生型VZV的感染率，最终消灭野生型vzvo5展望疱疹病毒感染十分普遍，即使痊愈，大多还会伴终身潜伏感染。疱疹病毒相关疫苗的制备困难较大，进展缓慢。VZV减毒活疫苗是迄今第I个也是唯一得到国际上广泛应

23、用的疱疹病毒疫苗。V-Oka株水痘疫苗在预防水痘方面所起的功效非常显著。然而，疫苗的使用方法还需要优化。目前所遇到的最主要问题包括突破感染常有发生，有少部分儿童对1个剂量的水痘疫苗不产生免疫反应，以及1次免疫往往不能提供足够的免疫刺激来产生长效的记忆性T细胞。因此，不仅要大力推广水痘疫苗的接种范围，还需要加强疫苗应用后的相关研究,才能使人们更好地认识和使用水痘疫苗，并可能拓展它的使用范围。参考文献|1JAsanoY,TakahashiM.Clinicalandserologictestingofalivevaricellavaccineandtwo-yearfollow-upforimmuni

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