牛结核病疫苗研究概述.docx

1、牛结核病疫苗研究概述谭伟，谢志勤，谢芝勋(广西壮族自治区兽医研究所，广西畜禽疫苗新技术重点实验室，南宁530001)中图分类号：S858.23文献标识码：A文章编号：1004-4264(2014)15-0027-06摘要：BCG疫苗株自Cahnecte和Guerin俩人分离出至今已有近百年的历史。13CG疫苗可用于预防牛结核病，但对牛的保护效果不完全，所以人们仍在不断地研发新型的牛结核病疫苗，本文将介绍目前正在使用及研发的牛结核病疫苗的主要类型、面临的挑战及今后的发展方向，关箓词：牛结核病疫苗；BCG疫苗；牛结核分枝杆菌20世纪初期，由于牛奶没有经过巴斯德氏灭菌法消毒，人喝了含有牛结核分枝杆菌

2、MycobacteriumboSs.M.bovvs)的牛奶后常会染上结核病。目前市场上销售的牛奶都是经过灭菌消毒的，所以人通过饮用牛奶感染M.bovis几乎是不可能的。Mbo/s可以感染牛、野生动物及人。据粗略估计，人群中的结核病约有10%是由材.bows感染所引起的，但Mb。在人际间直接传染的病例却很少见"2】。M.bovis可以引起牛结核病，这是一种人畜共患、慢性消耗性传染病，目前已被世界动物卫生组织和我国列为乙类动物疫病。牛结核病不仅会给畜牧业造成严重的经济损失，还会直接威胁到人类健康。在经济发达国家中，主要是实行检疫与淘汰相结合的策略(Testandslaughtercont

3、rolstrategy)来控制牛结核病。简单地说，就是首先利用结核菌素皮肤试验检出被材.boSs感染的动物，然后及时将其淘汰宰杀以防止健康牛群被感染。这样可以有效地根除或显著降低牛结核病的发病率。但由于检测成本高，筛除被M.bovis感染的动物经济损失大，所以上述办法目前在一些发展中国家仍很难实施。即使在英国等发达国家，近些年来牛结核病的发病率仍呈持续上升趋势，这可能与收稿日期：2014-02-12基金项目：广西特聘专家专项基金(2011B020)和广西科技重大专项(1222003-2-4洪同资助。作者简介：谭伟(1956-),男.北京人，博士.主要从事病毒分子生物学研究。通迅作者：洲芝勋，研

4、究员.主要从事丑食传染病分子生物学研究。M.bovis感染野生动物并在其中的流行有关。据不完全统计，牛结核病每年在全球造成的直接经济损失超过几十亿美元，其破坏力比其他疾病要严重得多。研发新型的牛结核病疫苗将有助于预防M.bovis的感染，控制牛结核病的发病率。1牛结核分枝杆菌牛结核分枝杆菌M.bovis)是结核分枝杆菌属的重要一员，也是牛结核病的致病因子。与引起人类结核病的结核分枝杆菌(A/ycobac怕/7Z/Dtuberculosis.M.tuberculosis)不同，M.bovis的宿主多样，分布范围较广。M.bovis的野生动物宿主包括英国和爱尔兰的欧亚推(Eurasianbadge

5、r)、美国的白尾鹿(white-taildeer)、新西兰的刷尾负鼠(brushtailpossum)、西班牙的公野猪和红鹿、非洲的水牛及野猪等。在自然环境中，M.bovis感染牛或其他宿主的途径主要是通过呼吸道。在人为的试验性感染模型中.M.bovis可以经多种途径感染牛，如静脉内注射、皮下注射、口服、鼻内、气管内、扁桃体内、吸入性甚至接触性等方式。M.bows感染奶牛后可引起结核性乳腺炎、胸腺炎等，致使奶牛产奶量下降、奶源污染、牛奶质量降低。牛感染M.bovis后出现的损伤多见于上呼吸道，一般在感染后2周就可以观察到。M.bovis被肺部巨噬细胞吞噬后，可在其内繁殖。分泌IFN-y的CD4

6、'T淋巴细胞可以抑制Mbou/s在巨噬细胞中的繁殖，而CD8T淋巴细胞则能够裂解被M.bovis感染的巨噬细胞。据报道，负责抗原提呈的主要细胞一树突状细胞(Dendriticcell.DC)也可以吞M.boviA但DC细胞杀伤M.bovis的能力要比巨噬细胞弱。牛感染M.bovis后病变早期主要表现为肺部肉芽肿反应，在肉芽肿内可发现巨噬细胞，其内含有耐酸的结核杆菌，在损伤的组织周围可观察到钙化及纤维性包囊。通过显微镜观察到的病理损伤主要是集中在肺和胸部的淋巴结，肺部淋巴结的损伤通常可从230mm不等。病变晚期会出现细胞坏死，病灶内可含有坏死的中性粒细胞、巨噬细胞及T淋巴细胞团。2牛结核

7、病疫苗的种类Calmette和Guerin最早使用BCG疫苗来预防牛结核病"°】。但BCG疫苗对牛的保护作用不完全，免疫效果至今还不能令人满意(气所以人们在不断探索和研发新型的牛结核病疫苗。目前正在使用和研发的牛结核病疫苗的主要类型包括：传统及改造型BCG疫苗、新型M.bovis减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、重组病毒载体疫苗以及能区分被感染与被免疫动物的疫苗等。2.1传统及改造型BCG疫苗、新型M.bovis减毒活疫苗传统的BCG疫苗是由Calmette和Guerin于20世纪初期研制的】。他们从患有结核性乳腺炎的牛体中分离到一个M.bovis菌株，通过将此菌株在甘油

8、浸润的土豆片培养基中反复连续传代最终得到了BCG疫苗株叩。BCG疫苗对牛的保护作用不完全，且保护效果差异很大接种BCG来预防牛结核病的效果在新生牛犊中比在成年牛中要明显得多，这或许和新生牛犊与成年牛对分枝杆菌免疫状态的差异有关。但接种BCG对新生牛犊仍只有部分保护作用，因为从被免疫的新生牛犊的组织中仍可以培养分离出M.bovis,并可观察到病理损伤。BCG疫苗的保护作用主要表现为减轻M.bovis造成的病理损伤，降低被感染组织中的细菌量。但是给牛接种BCG疫苗后可能会干扰结核菌素皮肤试验(皮试)的判定。因为牛接种BCG疫苗后，在很长一段时间内会增强对皮试的敏感性，导致被免疫接种的牛皮试反应阳性

9、，使被MboWs感染与被BCG疫苗免疫的牛很难区分。目前普遍认为BCG疫苗虽能保护牛抵抗人为的、试骏性的材.赤依感染，但在野外预防M/xmC天然感染的效果却不佳"气因此迫切需要研制新一代的更有效的牛结核病疫苗。传统的BCG疫苗可以经过基因改造来降低其繁殖力或提高其免疫原性。例如，通过灭活BCG基因组中的某些基因可以产生营养缺陷型BCG(AuxotrophicBCG)菌株，这种经改造的BCG菌株在动物体内的繁殖力下降，但仍可提高小鼠抵抗M.bons感染的能力3)。M.bovis的基因组中含有RD1(Resistantdeterminant1)区，而所有已知的BCG菌株都不含此区。据报道

10、，在BCG疫苗中表达RD1区含有的蛋白质能够提高BCG疫苗的保护作用目前已完成Mb。"。及BCG巴斯德株的全基因组测序“气经比较发现，M.bovis基因组中的RD1、RD2及RD14三个区在BCG巴斯德株中已发生缺失，因此找出RD2及RD14区内能提高BCG免疫原性并将其在BCG中表达，将有助于改善BCG疫苗的免疫原性及接种效果。另外人们也正在研制新型M.bovis减毒活疫苗，希望能找到与材毒力密切相关的基因，并将其从M.bovis的基因组中去除掉。最好是能达到减弱毒力而不降低疫苗免疫原性的目的。因此需要深入研究的致病机理，弄清与M.bovis毒力有关的因素，为研制新型牛结核病活疫苗

11、提供新的靶位。通过化学突变法人们得到了Afboms的两个弱菌株“8】。试验表明这两个弱菌株在牛和豚鼠中无毒性，并可保护牛免于M.bovis的感染。但它们对牛的保护效果与BCG疫苗基本相当，因此仍需继续研发保护作用更佳的M.bovis的弱菌株。理想的弱菌株在其基因组中至少应缺失两个与毒力有关的区域，以防止菌株恢复毒力。目前对M.bovis弱菌株的研究仍主要集中在寻找影响毒力及免疫原性的基因等方面。2.2亚单位疫苗亚单位疫苗主要通过基因表达载体来产生具有免疫原性的M.bovis蛋白质。例如，基于Mboms的早期分泌性抗原靶位6ku蛋白(Earlysecretoryantigenictarget-6

12、kuprotein.ESAT-6)制备的亚单位疫苗可以增强小鼠、豚鼠及恒河猴对菌株感染的抵抗力"卜司。亚单位疫苗的优点是安全性好，没有毒力回复突变的危险；不含非特异蛋白，副作用小；便于纯化及质量控制；接种动物后不易引起结核菌素皮试阳性。亚单位疫苗的缺点是免疫原性较差、常需多次加强免疫，而且单独使用对动物的保护作用差。辅以合适的佐剂可增强亚单位疫苗的免疫原性心)。亚单位疫苗与BCG疫苗联用也可增强免疫效果。牛体内枷感染的主要机制是细胞免疫，而亚单位疫苗则主要是刺激机体产生体液免疫，其诱导产生细胞免疫的能力较弱。2.3DNA疫苗DNA疫苗主要是指通过DNA质粒来表达M.bovis菌株具有

13、免疫原性的蛋白质，以达到刺激机体产生保护性免疫的目的。DNA疫苗的优点是易于大量生产、便于质量控制、疫苗稳定性好、容易保存和运输，同时可以刺激产生细胞及体液免疫反应。常用的免疫原有：M.bovis的ESAT-6及培养过滤液蛋白-10(culturefiltrateprotein-10.CFP-10),23,o单独使用DNA疫苗在牛群中的保护效果低于BCG疫苗。虽然DNA疫苗单用效果差，但若辅以佐剂或与免疫刺激分子CD80和CD86联合使用，则免疫效果比单用DNA疫苗要好"I。若DNA疫苗与BCG疫苗联用则效果更佳(询。DNA疫苗刺激产生细胞免疫的能力明显优于亚单位疫苗，但这两种疫苗的

14、免疫原性及保护作用均比BCG疫苗要差。2.4重组病希栽体疫苗常用的重组病毒载体有：修饰改造过的痘苗病毒Ankara株(ModifiedvacciniavirusAnkarastrain.MVA)、禽痘病毒(Fowlpoxvirus)、重组复制缺陷型腺病毒等四倒。目前已构建出含有编码分枝杆菌Ag85A蛋白基因的重组MVA表达载体或禽痘病毒表达载体细。重组病毒载体疫苗目前主要是用于“免疫刺激-加强方案”来提高BCG疫苗的免疫效果。研究表明，采用BCG刺激、MVA-Ag85A重组病毒载体加强要比用BCG刺激、BCG加强效果好得多"J。2.5能区分被感染与被免疫动物的疫苗由于接种BCG疫苗会

15、造成被免疫的动物结核菌素皮试反应阳性，有可能误将被免疫的动物错判为被感染的动物，导致经免疫接种的动物被误杀。为解决这一问题，人们研制了能区分被感染与被免疫动物(Differentiatinginfectedfromvaccinatedanimals.DIVA)的DIVA疫苗。DIVA疫苗的优点是能区分被M.bovis感染和被疫苗免疫的动物，可以与检测-宰杀控制方案”同时并用。M.bovis的ESAT-6蛋白及CFP-10蛋白常作为牛结核病诊断试验中的抗原。大多数结核分枝杆菌属的细菌(包括材£。刀s菌株)含有编码这两种抗原的基因，而BCG和大部分的非结核性分枝杆菌则不含这两种基因l27

16、28Jo因此，牛接种BCG疫苗后，体内不产生针对ESAT-6及CFP-10蛋白的免疫反应，而当牛被Mb。万s感染后，则会产生针对以上两种蛋白的免疫反应。检测ESAT-6和CFP-10的表达可以用来区分被BCG疫苗免疫过和被M.bovis感染过的动物。通过比较不同结核分枝杆菌的基因组有助于发现M.bovis毒株特异性的蛋白质。目前下列结核分枝杆菌的全基因蛆测序已完成：M.bovis、M.tuberculosis、M.aviumsubsp.avium.M.aviumsubsp.Paratuberculosis及BCG巴斯德株,629,o经比较发现，M.bovis基因蛆中含有的RD1、RD2及RD1

17、4三个区在BCG巴斯德株中是不存在的。因此建立方法来检测RD2及RD14区中表达的特异性蛋白，也将有助于区分被Mbou/s感染与被BCG免疫的动物，同时不影响DIVA疫苗与“检测-宰杀控制方案”一起应用。3加强免疫提高BCG疫苗的效力可以通过不同的加强免疫方案来实现。由于BCG预防牛结核病在成年牛中的效果很差，所以加强免疫方案主要应用于被BCG接种过的新生牛犊。单独使用DNA疫苗在牛群中的保护效果低于BCG疫苗，但用DNA疫苗进行免疫剌激、用BCG进行免疫加强的效果比单用DNA疫苗或单用BCG疫苗都要好。这种免疫接种方式称为异种加强免疫方案(Heterologousprime-boostimm

18、unizationstrategies)o这种接种方式采用表达同一种抗原的两种不同类型的疫苗，在一定的时间间隔内对动物分别进行免疫剌激和免疫加强。常用的免疫刺激-加强方式有：DNA疫苗刺激、重组病毒载体疫苗加强；重组病毒载体疫苗刺激并加强；重组病毒载体疫苗刺激、BCG疫苗加强等。据报道，先用BCG疫苗刺激，再用DNA疫苗或亚单位疫苗来加强，可得到很好的保护效果m】。进一步的研究发现不论采用BCG疫苗刺激、DNA疫苗加强或是DNA疫苗刺激、BCG疫苗加强的方式均可提高疫苗的保护效果*32】。总之，用BCG进行刺激、用DNA疫苗或亚单位疫苗来加强的效果要比单用BCG疫苗要好得多3)。采用BCG疫苗

19、刺激、再用病毒裁体疫苗来加强免疫效果会更佳'徇。另外，异种加强免疫方案的效果比同种加强免疫方案要好(约。4影响BCG疫苗效力的因素BCG疫苗对不同个体的牛或人的保护作用及效力差别很大。虽然已有研究证明BCG疫苗在实验室建立的动物模型中有较好的保护作用，但当BCG疫苗用于野外实地预防材自然感染时，大多数情况下保护作用很差。影响BCG疫苗效力的因素有很多，例如，BCG不同菌株在基因水平的差异、制备疫苗的方法、接种途径、宿主的年龄、刺激免疫与加强免疫之间的时间间隔、宿主遗传结构及免疫状态的差异等，均会影响到BCG疫苗的保护效果。接种疫苗的牛是否曾在免疫前被材。/5感染过或接触过环境中的其他分

20、枝杆菌也会影响BCG疫苗的效果。有研究认为牛若曾接触过环境中的分枝杆菌，可能会产生针对分枝杆菌基础水平的保护性免疫(刈，但这种保护作用不会由于接种BCG疫苗而有所加强。这可能是由于牛接触了环境中的分枝杆菌后，体内产生了抑制分枝杆菌繁殖的免疫反应，使得接种BCG疫苗后的保护效果不明显段。接种所使用的疫苗剂量也是一个重要的影响因素。研究表明，接种大剂量的BCG疫苗(1Oe1O,oCFU)提高动物抵抗M.bovis感染的能力并无明显帮助|3司，而接种小剂量(103106CFU)的BCG疫苗则可有效地提高预防效果尽管人用BCG疫苗多采用一次性接种，但试验表明BCG疫苗初次免疫动物的效果欠佳，常需要加强

21、免疫来提高动物对何.。，态感染的抵抗能力。而且在接种疫苗后的12个月内进行加强免疫保护效果最佳，若在2个月后再进行加强免疫则保护效果下降°气据报道，尽早给新生牛犊接种BCG疫苗会诱导产生明显的免疫保护作用°71。BCG疫苗在体内存留的时间长短也会影响疫苗的效果，存留的时间长则保护效果相对持久。5牛结核病疫苗研发方向理想的牛结核病疫苗应能阻断M.bovis在牛群中传播、防止其在牛群中建立感染，同时不引起结核菌素皮试反应阳性，从而便于区分被感染与被免疫的动物。有效的牛结核病疫苗还应具有以下特点：能使被疫苗免疫的牛群在受到M.bovis攻击时，快速诱导产生特异性的细胞免疫反应及I

22、FN-yo这种疫苗应能减轻牛的病情及组织的损伤程度、限制结核的蔓延、降低重要器官(肺部)内的细菌量。至今还没有研发出一种十分有效的能替代传统BCG的牛结核病疫苗，目前发展牛结核病疫苗主要是考虑如何改进BCG疫苗，如何将新型疫苗与BCG疫苗合用来进一步提高BCG疫苗的效力，而不是取而代之，弃之不用。评估新型牛结核病疫苗是否有效也离不开与BCG疫苗的效力进行比较。发展牛结核病疫苗应考虑研发效力优于BCG的新型减毒M.bovis活疫苗及可用于免疫加强的DNA疫苗、亚单位疫苗或重组病毒载体疫苗。要在降低疫苗副作用的基础上，不断提高疫苗的效力。新生牛犊接种BCG疫苗之后，疫苗保护作用的维持时间值得进一步

23、研究。若保护性免疫维持的时间过短，应弄清是否能通过加强免疫来提高免疫力。不同的佐剂类型刺激产生的获得性免疫反应会有所不同，成功用于小动物免疫试验中的佐剂在牛体内可能会效果不同,3538,o目前还没有找到与牛结核病疫苗联用的合适佐剂。因此研制新型佐剂及摸索BCG与其他疫苗或佐剂联合使用的最佳条件也是提高牛结核病疫苗效力的一个途径。发展DIVA疫苗有助于区分被M.bovis感染与被疫苗免疫的动物，同时还能区分经疫苗免疫后被感染的动物及未被感染的动物。因此发展DIVA疫苗是未来牛结核病疫苗研制的重要方向之一。目前人们还没有找到一个能真实反映BCG疫苗起保护作用的免疫学指标。例如，虽然结核菌素皮肤试验

24、阳性可以作为评判M.bovis感染的一个指标，但BCG疫苗诱导产生的保护性免疫与结核菌素皮肤试验阳性反应的高低并无关,2937'39,o因此皮试结果并不能客观地反映机体抗M.bows感染的能力。所以如何评估牛结核病疫苗的预防作用和保护水平也是疫苗研究的难点和重点。试验表明，大多数有效的牛结核病疫苗能剌激产生特异的T细胞免疫、激活自然杀伤细胞并分泌大量的IFN-yl26,o免疫接种后刺激产生的特异性IFN-y水平常被用来评估疫苗的保护作用及效力。如果在接种BCG疫苗后的24周内，动物体内可产生大量的IFN-y,则免疫接种对动物很可能会产生很好的保护效果,3240,0若疫苗接种后产生的IF

25、N-y«少、速度慢，则这种疫苗的保护作用可能会很差l31'4,l42lo新型的牛结核病疫苗应能快速刺激产生IFN-y,使其保护作用强但病理损伤小，因为产生过量的IFN-y反而会造成病理损伤M3】。因此研究与牛结核病的免疫保护及病理损伤有关的机制对牛结核病疫苗研究至为重要,，有报道指出中心记忆T细胞(CentralmemoryTcell)介导的免疫反应也与疫苗的保护性反应密切相关，可用来评估疫苗的效力3】。研究指出，IL-4mRNA表达督及lgG1抗体水平与牛肺部的损伤程度有关"245七因此研究被疫苗保护与被M.bovis感染的动物中细胞因子表达水平上的差异，有助于发

26、现能反映出的疫苗保护效果、病情的轻重及病理损伤程度的免疫指标。在目前使用的多种BCG疫苗的接种方案中，异种免疫加强方案的效果最佳。有效的免疫加强方案应能同时诱导激活CD4,及CD8*T细胞反应。找出并确定能客观反映疫苗保护水平的免疫学指标将有助于发展新型牛结核病疫苗及正确地评估疫苗的保护作用。6结语近年来研发的牛结核病疫苗各具其优缺点，但总的来说它们的保护效果并没有明显优于传统的BCG疫苗。新型牛结核病疫苗的发展和评估仍要以BCG疫苗为基准。研制牛结核病疫苗应当优先考虑的问题包括：降低BCG疫苗的副作用、提高其免疫原性及刺激产生细胞免疫的能力，BCG疫苗与新型疫苗合理联用，研制合适的佐剂，找出

27、最佳的接种途径，研制DIVA疫苗使疫苗的应用不干扰检疫-淘汰宰杀控制方案的实施等。弄清材.bows的致病机理并找出能真实反映牛结核病疫苗保护水平的免疫学指标，对新型牛结核病疫苗的研发及保护效果的评估将起到进一步的推动作用。参考文献(11CosiviO,GrangeJM.DabornCJ.etal.ZoonotictuberculosisduecoMycobactenumbovisindevelopingcountriesJ.EmergInfectDis.1998.4(1):59-70.|2|GrangeJM.MycobacteriumbovisinfectioninhumanbeingsJ.T

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