制半夏抑制基质金属蛋白酶活性及抗肿瘤机理的实验研究

1、制半夏抑制基质金属蛋白酶活性及抗肿瘤机理的实验研究 作者：戈宏焱 杨金刚 房学讯 赵树华 李有田【摘要】 目的研究制半夏对基质金属蛋白酶-16（MMP-16）活性的抑制作用。方法根据抑制MMPs活性后底物降解速率降低的原理，通过检测底物降解速率，测定中药制半夏对MMP-16的抑制作用。结果与空白对照组及阳性对照组相比，制半夏具有较强的抑制MMP-16活性的作用，其抑制活性IC50=23 g/ml。结论半夏水煎剂在体外具有抑制MMP-16活性的作用，其抑制活性较强，且存在剂量依赖关系。 【关键词】 制半夏； 基质金属蛋白酶； 酶活性分析； 抗肿瘤Abstract：ObjectiveTo stud

2、y the inhibitory action of pinelliae tuber on matrix metalloproteinase-16 (MMP-16).MethodsThe decreasing of the degrade rate of substrate is associated with the inhibition of matrix metalloproteinase-16. We studied the inhibitory activity of pinelliae tuber on MMP by observing the degrade rate of su

3、bstrate. ResultsPinelliae tuber strongly inhibited the activity of MMP-16, and the IC50 was 23 g/ml.ConclusionThe apozem of pinelliae tuber has inhibitory activity on MMP-16 in a dose-dependent manner in vivo.Key words：Pinelliae tuber; Matrix metalloproteinase; Methods for the analysis of enzymatic

4、activity 我国传统中药半夏Pinelliae tuber具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效。长期的临床实践表明半夏具有确切的疗效。半夏生品有小毒，临床上内服必须经过炮制或与生姜配伍以减轻毒性，故本实验所用半夏均为临床应用广泛的炮制半夏。基质金属蛋白酶（MMPs）是一类锌离子依赖的蛋白水解酶家族，能够降解细胞外基质成分，参与众多重要的生理和病理过程1。根据报道, MMPs活性的抑制对肿瘤细胞的行为有重要的影响24。本实验研究制半夏体外抑制基质金属蛋白酶16活性的作用及抗肿瘤机理，从而为从分子水平上研究半夏的治病机理奠定基础，也为进一步从半夏中提取基质金属蛋白酶抑制剂提供实验依据。1

5、器材1.1 材料制半夏（吉林大学中日联谊中药房提供的道地药材），自制缓冲溶液（50mmol/L HEPES，0.2M NaCl，10 mmol/L CaCl2，20mol/L ZnSO4，0.05 % Brij-35）,荧光底物DQ-gelatin（美国Sigma公司），已知广谱MMP的抑制药物15 nmol/L GM6001。1.2 仪器Bio-Red FLx-800荧光酶标仪(美国), DPX-9082B-1 点热恒温培养箱(上海福玛实验设备有限公司)。2 原理与方法2.1 原理实验所用底物为荧光底物，酶降解底物后发荧光，通过荧光酶标仪检测反应体系的荧光强度变化。抑制活性的测定是在反应体系

6、中加入半夏提取物，提取物中抑制成分与酶结合，占据酶的活性中心，使底物不能与酶结合，从而导致酶降解底物速率降低，荧光强度变化减慢。2.2 方法1 3 结果 图17分别是空白对照组与半夏水提物浓度分别为4，12，20，28和36 g/ml的实验组及阳性对照组的测定结果，图中“Mean V”表示随时间变化的荧光强度的变化速率，可以作为相对的底物降解速率，根据实验方法中所给出的公式，能够出不同浓度的半夏提取物对MMP-16的抑制百分数。通过以上数据，能够推测MMP-16的活性抑制50%时所需要的半夏的量，见图8，IC50=23 g/ml。图1 空白对照组（略）图2 4gml-1半夏水提物的测定结果（略

7、）图3 12gml-1半夏水提物的测定结果（略）图4 20gml-1半夏水提物的测定结果（略）图5 28gml-1半夏水提物的测定结果（略）图6 36gml-1半夏水提物的测定结果（略）图7 阳性对照组的测定结果（略）图8 不同浓度的制半夏抑制活性的分析（略）4 讨论 MMPs是锌肽酶家族的一员，是组成结缔组织细胞外基质降解过程中必不可少的酶，几乎能降解细胞外基质的所有成分,在体内多种生理和病理过程中起重要作用5。在创伤愈合、骨质再吸收、怀孕和分娩以及乳腺萎缩等与组织重塑有关的生理过程中均有MMPs的参与6，而在类风湿性关节炎、骨关节炎、角膜溃疡、牙周疾病、动脉粥样硬化、心肌梗塞、神经退行性疾

8、病如多发性梗塞等以细胞外基质过度破坏为主要特征的病理过程中MMPs亦发挥重要作用7。MMPs的表达和活化与肿瘤的生长、侵袭和转移呈正相关，在恶性肿瘤中MMPs经常过度表达8。基于此，MMPs已成为恶性肿瘤的一个新靶点。 目前几种广谱、低分子量的用于数种类型的肿瘤治疗的MMP抑制剂已被临床评估。虽然这些小分子药物在临床前的动物实验中能高效地抑制MMP的活性并有效地阻止肿瘤的生长和转移，但是其价格昂贵，并且在临床应用中表现出了强烈的副作用，最终导致后期临床的失败9。其原因可能在于这些抑制剂的特异性不强，对于许多其它种类的MMP的正常生理功能也起了不同程度的影响。因此，寻求高效的、特异性强的MMP抑

9、制剂是这个领域当前工作的重点，也是目前国内外开发抗癌药物的热点。半夏在我国的临床应用悠久，价廉易得，成分分离工艺简便，药效记录多，安全性和毒副作用有验证，这些优势是合成化合物所无法比拟的。本实验表明,制半夏水煎液具有抑制MMP-16活性的作用, 其抑制活性IC50=23g/ml，与空白及阳性对照组抑制活性相比后发现，在体外半夏抑制MMP-16活性的作用较强，且其抑制强度存在剂量依赖关系，水煎液的浓度越大，抑制作用越强。实验结果为从分子水平上研究半夏治疗相关疾病的机理奠定了基础，也为今后进一步从半夏中提取基质金属蛋白酶抑制剂并开发出以MMPs为靶点的中药新药提供了理论依据。 针对MMP-16的抑

10、制效果已经完成，针对其他种类的MMPs的抑制效果仍有待进行，我们将以MMPs的抑制活性为指导，继续分离、鉴定出半夏中的MMPs抑制成分。【】 1 Uta B. Hofmann, Roland Houben, Eva-B,et al. Role of matrix metalloproteinases in melanoma cell invasionJ. Biochimie， 2005,87:307.2 Ming-Chung Jiang, Ching-Fong Liao , Po-Huang Lee. Aspirin Inhibits Matrix Metalloproteinase-2 Ac

11、tivity, Increases E-Cadherin Production, and Inhibits in Vitro Invasion of Tumor CellsJ. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2001:282, 671. 3 Ki-Tae Ha, Tae-Kyun Lee, Keum-Hwa Kwak,et al. Inhibitory effect of Cho-Deung-San on human aortic smooth muscle cell migration induced by TNF-

12、a through inhibition of matrix metalloproteinase-2 and -9 activityJ. Vascular Pharmacology，2004,41: 83.4 Risto Ala-aho,Veli-Matti Khri. Collagenases in cancerJ. Biochimie,2005,87: 273.5 陈华江，乇军杰.基质金属蛋白酶的结构及其调节机制J.国外医学肿瘤学分册，2001，28(1):20.6 Kugler A.Matrix meta11oproteinases and their inhibitorsJ.Anticancer Res1999，19(2):15897 VeliMatti K，Saarialho-kere U. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in tumor growth and invasionJ. Ann Med，19993