喇咕多糖对α-淀粉酶活性的抑制及其对糖尿病大鼠血糖影响的实验

1、喇咕多糖对-淀粉酶活性的抑制及其对糖尿病大鼠血糖影响的实验        【关键词】  喇咕多糖 -淀粉酶活性 血糖    糖尿病是临床常见病、多发病，并发症、致残率均较高，而且随着全球老龄化趋势的加剧，糖尿病的发病率还将逐年上升。植物提取物1，2降糖的研究已经得到国内外研究机构证实，且具有毒副作用小、疗效确切的优势。我们观察了喇咕多糖在体外对-淀粉酶活性的抑制作用及其对糖尿病大鼠血糖的影响。1   材料与仪器1.1   喇咕多糖的制备

2、3取喇咕壳，用水洗净，于室温下在56HCl中搅拌浸渍24 h，过滤，收集滤渣，水洗后在34NaOH液(加少量肥皂)中热回流46 h，重复2次。滤饼经水洗，干燥即得粗制甲壳质。粗品在0.5高锰酸钾中搅拌浸渍约1 h，水洗后在1的草酸中于6070搅拌3040min，水洗、干燥即得白色精制甲壳质，将其投入50NaOH 140加热2 h，离心，收集沉淀，水洗干燥即得白色喇咕壳聚糖。1.2   动物Wistar种成年大鼠，体重170190g，雌雄各半,由同济医学院老年医学研究所实验动物中心提供。1.3   仪器、试剂-淀粉酶冻干粉（医药集团上海化学试剂公司，批号：

3、F20021030）；麦芽糖（上海源聚生物科技有限公司，批号：030125）；3,5-二硝基水杨酸（中国医药集团上海化学试剂公司，批号：20030704）；阿卡波糖（中国北京拜耳医药保健有限公司出品，批号：00102903）；D-860（甲苯磺丁脲，江苏丹阳市药业有限责任公司出品，批号：0021056）；四氧嘧啶（购自美国Sigma公司，批号：73K1626）；AU-400全自动生化分析仪（本奥林巴林公司出品）；稳捷型血糖仪（美国强生公司提供）。称取3,5-二硝基水杨酸1.0 g，加入1 mmol·L-1氢氧化钠溶液20 ml超声处理30 min, 成乳白色混悬液，再加入50 ml蒸

4、馏水,混匀即成黄色澄清液体，准确称量30.0 g酒石酸钾钠加入，振荡混匀，待酒石酸钾钠完全溶解后用蒸馏水定容至100 ml，盖紧瓶盖,勿使CO2 进入。2  方法2.1  样品活性的测定7支试管编号，一支为对照管，另6支为测定管，对照管加入 0.2ml pH6.6 的0.2 mmol·L-1磷酸缓冲液,另6支试管分别加入浓度为0.001 6，0.008，0.04，0.2，1，5 mg·ml-1的喇咕多糖溶液（-淀粉酶及喇咕多糖溶液均用0.2 mmol·L-1 PH6.6的磷酸缓冲液配制）；7支试管依次加入0.2ml -淀粉酶溶液并及时混匀，各管

5、同时放入37恒温水浴箱，分别加入37预热的淀粉液0.4ml，充分混匀立即放入37恒温水浴保温5 min，然后取出迅速加入0.8 ml的0.4mmol·L-1氢氧化钠溶液终止酶活性。以上实验分别设4组，将喇咕多糖与-淀粉酶的反应时间设为10，20，30，40 min，同时本底基数的测定为喇咕多糖与-淀粉酶反应时间定在10 min，反应后加入37预热的磷酸缓冲液0.4 ml代替淀粉液，其他步骤同样品的测定。2.2  OD值的测定样品及本底基数测定各管中溶液各1 ml，放入10ml刻度试管，再分别加入1 ml DNS试剂混匀，置沸水浴8 min后，室温下冷却15 min，用蒸馏水

6、稀释至10ml并混匀，用721分光光度计于520 nm 处测吸光度即OD值。抑制率（%）= 1-（样品OD值-本底OD值）/ 对照管OD值。2.3  设阳性对照即测定阿卡波糖对-淀粉酶的抑制率阿卡波糖溶液的浓度及抑制率的测定过程，与喇咕多糖抑制率的测定过程相同并同时进行，阿卡波糖溶液与-淀粉酶反应时间定为25min，重复3次。2.4  喇咕多糖对四氧嘧啶糖尿病大鼠模型的降糖作用   按4方法造模，正常Wistar大鼠禁食12 h，按50mg·kg-1体重剂量尾静脉快速注射2.5 %四氧嘧啶生理盐水溶液。造模注射后96h尾静脉采血用强生

7、稳捷血糖仪测定空腹血糖（取血前禁食12h），血糖高于11.1mmol·L-1视为造模成功。将其随机分为3组，每组11只，即造模组（Model）、喇咕多糖组（PP）、阳性对照组。另设正常对照组（Normal）不予造模注射。即日开始灌胃给药，1次/d，连续5 d。正常对照组和造模组给予生理盐水，阳性对照组给予D-860 100mg·kg-1，喇咕多糖组给予喇咕多糖200mg·kg-1，每组灌胃按体积均为每只2 ml/次。给药5 d并禁食10 h后眼眶采血葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖。然后，造模组及正常对照组灌胃7.5%（2ml）的淀粉糊精；多糖组灌胃7.5%淀粉糊精-2

8、00 mg·kg-1喇咕多糖混合物（2 ml）；阳性对照组灌2 ml 7.5% 淀粉糊精及100 mg·kg-1剂量的D-860混合物。测定给淀粉后0.5，1，2 h的血糖值，采血及测定方法同空腹血糖。2.5   统计方法计量资料用±s表示，t检验。 1         3  结果3.1  喇咕多糖体外对-淀粉酶活性的抑制作用喇咕多糖10，20，30，40 min 4个时间段的量效曲线接近直线，呈剂量依赖性； 6个浓度组均于20 min

9、时间段达最大抑制率，在30 min段抑制率下降，40 min稍回升，提示各浓度组存在相近的时效关系,且存在最佳作用时间。阿卡波糖的量效曲线也接近直线，并随药物浓度增加而递增，最大抑制率70.9%。见图12。3.2   喇咕多糖对四氧嘧啶糖尿病大鼠血糖水平的影响四氧嘧啶糖尿病大鼠，多糖组后的空腹血糖值明显低于造模组，差异有极显著性意义（P0.01），多糖组的餐后2h血糖明显低于造模组，差异有显著性意义（P0.05）。多糖组的血糖水平与造模组相比均显著降低（P0.01）。结果见表1和图3。表1  喇咕多糖对糖尿病大鼠空腹及餐后血糖的影响（略）与模型组比较，*P0.01

10、， *P0.05；n=114  讨论    糖尿病的药物治疗分为两类：胰岛素治疗及口服降糖药物治疗。但大多数药物治疗均有一定的副作用，患者难以坚持治疗,因此探索新的降糖药物势在必行。淀粉酶抑制剂降血糖是20世纪70年代后兴起的新的降血糖思路。-葡萄糖苷酶抑制剂副作用较小，此类物质可抑制消化道，尤其是十二指肠的淀粉酶活性，因而减少或延缓消化道淀粉水解为单糖，使单糖的吸收减少而降低血糖，所以对糖尿病病人餐后高血糖以及过食碳水化合物引起的脂肪增加有对抗作用。据国内有关报道，一些多糖类化合物有体外抑制淀粉酶活性作用5，6。kobayashi k7筛选了40种生药

11、提取物对小鼠血浆中淀粉酶活性和餐后血糖的影响。这些天然物质可抑制胃肠道中-淀粉酶的活性，有望改善糖尿病患者餐后的血糖升高。    甲壳素是一种天然直链状酰胺类多糖，化学名为l,4-二乙酰胺基-2-脱氧-p-D-葡聚糖。壳聚糖是甲壳素的主要衍生物，是由甲壳素经脱乙酰基后得到的一种高分子氨基多糖。化学名称为(1-4)2-氨基-2-脱氧-B-D-葡萄糖，或简称聚氨基葡萄糖。由于这种壳聚糖的大分子结构中存在大量氨基，从而大大改善了甲壳素的溶解性和化学活性，因此使它在医疗、营养和保健等方面具有广泛的应用价值。近十年来国内外的家都将它作为人体第六生命要素进行深入研究和开发。&

12、#160;   本研究显示，喇咕多糖在体外对-淀粉酶活性具有较强的抑制作用，且呈剂量依赖性，0.001 6（5 mg·ml-1）喇咕多糖溶液抑制率的量效曲线近似直线，其抑制率相当于同等浓度阿卡波糖抑制作用的50%左右。喇咕多糖抑制率的时效曲线提示喇咕多糖对-淀粉酶的抑制作用可能是可逆的，并可能存在时间依赖性，即存在最佳作用时间。    动物实验显示，喇咕多糖可显著降低四氧嘧啶高血糖大鼠的空腹血糖及餐后血糖，其降低空腹血糖水平与D-860（甲苯磺丁脲）相当，其降低餐后2h血糖效果明显优于D-860；且对正常大鼠血糖水平无显著影响，表明喇

13、咕多糖可降低四氧嘧啶大鼠的空腹血糖及改善餐后血糖过度升高，而不会导致低血糖，其降血糖机制可能与其抑制-淀粉酶活性、延缓碳水化合物在肠道的吸收有关，其机理有待进一步研究。【】  1徐仲溪,王坤波.茶多糖化学及生物活性的研究J.茶叶科学,2004,24（2）：75.2付海平,黄怀生,胡孟阳，等. 茶多糖生物活性及提取纯化的研究进展J.茶叶通讯,2006,33（2）：24.3侯惠民甲壳质 一种具有广泛应用价值的新材料J.医药，1988，19(7)：328.4张均田.药理实验方法M.北京：北京医科大学协和医科大学联合出版社, 1998：982.5刘华珍,江红磊,杨劲松.微生物产生的淀粉酶抑制剂研究·发酵、分离与理化性质J.中