第八章酶分子的定向进化

1、1第 八章 酶分子的定向进化2第一节简介一、理论来源o随着电子科学的迅猛发展及计算机的广泛应用，酶学研究跨入了新的阶段。o利用基因工程的原理，可以在实验室中模拟自然界中的漫长进化过程，并由此建立了酶分子的定向进化方法，用于构建新的非天然酶或改造天然酶分子。4三、发展方向n酶催化的精确性和有效性往往并不能满足通常的工业化要求，天然酶通常缺乏有商业价值的催化功能及其他性质。因此，对天然酶分子水平上的改造，显得十分重要。n酶分子仍具有巨大的进化潜力，是酶的体外定向进化的基本先决条件。n酶分子存在进化潜力的主要原因如下：n天然酶在生物体内存在的环境与酶的实际应用环境不同n实际应用中，期待酶的活力和稳定

2、性越高越好，但在生物体内对环境适应的进化主要表现在整体的适应能力、调控能力的增强n某些酶或蛋白质待进化的性质不是在生物体内所涉及的，如对蛋白质药物改造消除其副作用5v酶分子的定向进化是从一个或多个已经存在的亲本酶（天然或人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过筛选最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。v其原理如图81：6711第三节定向进化的策略n一、易错PCR技术为代表的无性进化n二、DNA改组技术为代表的有性进化n三、基因家族之间的同源重组n四、外显子改组n五、杂合酶n六、计算机辅助设计n七、突变库的构建及应用12一、易错PCR技术为代表的无性进化 易错PCR是

3、在采用Taq酶进行PCR扩增 目的基因时，通过调整反应条件，改变Taq酶的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变构建突变库。 如提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种dNTP浓度等。 关键：突变频率适中，理论上每个靶基因导入的取代残基个数为1.55之间。 连续易错PCR（sequential error-prone PCR），将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变，使每一次获得的小突变累积产生重要的有益突变。13141516 以单一的酶分子基因进行定向进化时，基因的多样化起源于PCR等反应中的随机突变，但由于突变大多是有害的或者是中

4、性的，采用这种过程集中有利突变的速度比较慢。 从自然界中存在的基因家族出发，利用它们之间的同源顺序进行DNA改组实现同源重组，由于每一个天然酶的基因都经过千百万年的进化，并且基因之间存在比较显著的差异，所以获得的突变重组基因库中既体现了基因的多样化，又最大限度的排除了那些不需要的突变。 此策略拓宽了酶分子突变库中的序列空间，而且限制了有害突变的掺入而不会增加突变库的大小和筛选难度，从而保证了对很大的序列空间中有希望的区域进行快速定位。1718五、杂合酶v1.杂合酶的定义v把来自不同酶分子中的结构单元或是整个酶分子进行组合或交换，以产生具有所需性质的优化酶杂合体。192.研究杂合酶的意义与应用v

5、蛋白质工程应用于酶学的主要目的是通过改变现存酶的特性，创造出具有新特性或性能有所改善的酶。v研究杂合酶的意义天然酶在现存的工业条件下稳定性较差或其催化水平很低；天然酶在工程菌中的折叠效率较差或对蛋白酶敏感；酶的催化活力需要扩大或减小；需要创造具有新反应活力的酶。v杂合酶的应用：改变酶的非催化特性；创造具有新活力的酶；研究酶的结构与功能之间的关系。203.展望v在新酶的开发和现有酶的改造利用方面，杂合酶技术显示了巨大的应用前景。v杂合酶技术是将DNA水平上的突变筛选与蛋白质水平上的酶学研究相结合的一门综合技术，将传统酶学活性筛选法同简便的DNA重组技术有机地结合起来，使酶工程的研究摒弃了繁琐的蛋

6、白质序列研究和繁重的菌种选育的传统做法，为加快构建新酶和改进生物工艺过程开创了一条新路。vDNA与蛋白质研究技术的突破也必将推动杂合酶技术的发展。新克隆的基因序列不断增多，基因组序列信息日新月异，提供了越来越多的同工酶信息，使我们能够更正确地预测可作为分子筛选引物的保守序列和用这些引物对培养和未经培养的微生物进行筛选。v从筛选的角度看，发展趋势是从活性筛选向分子筛选转移。v基因数据库和其他生物信息工具的利用将越来越频繁。v筛选工作的最终关键是开发具有特异性的分析方法。21六、计算机辅助设计对酶分子结构信息及其它与酶分子相关的结构数据的充分利用可以大大减小由于盲目的随机突变形成的突变库容量过大而

7、给筛选带来的困难。Frances H Arnold 用计算机的方法限制突变库的大小，减小搜索范围从而优化酶的定向进化方法。筛选正向突变可能性大的突变库有效地减小了突变库的大小，增大了筛选效率和成功的可能性。22七、突变库的构建及应用n（一）构建理想的基因文库要考虑的因素n1.基因文库的质量n（1）基因文库的代表性文库中包含的DNA分子应能完整地反映来源基因的全部可能的变化和改变，文库质量的最重要的指标，可用库容量来表示。n（2）突变基因片段的序列完整性文库中重组或突变DNA片段应尽可能完整地反映出天然基因的结构。n2.文库筛选可选择的具体方法最理想的情况是对于具体构建出的一个突变基因文库应能够

8、使用多种筛选方法。23（二）构建突变文库的载体系统n1.噬菌体载体系统n最早使用的载体系统，在载体本身的设计方面已经相当成熟。n优点：插入片段的载容量大，适合于大片段的克隆。感染效率高、鉴定容易，有较好的质量控制指标。基因文库质量高、代表性好，稳定性好，适合长期保存。n缺点：构建成文库后，可采用的文库筛选方法有限。基因片段无法在宿主细胞中表达。242.质粒载体系统n优点：可实现对基因文库的功能性筛选。n实现基因的功能性筛选需满足的条件：文库中的基因编码序列能在宿主细胞中表达，产生具有天然构象的编码产物；在检测出目的功能的同时，能直接或间接编码这一表型的基因。n缺点：n载体容量小，长片段易丢失。

9、n转化效率低，易失活。253.哺乳类细胞表达载体n这种研究策略在发现和鉴定出人类细胞中与重大生理现象和重大疾病相关的功能基因的工作中显示了良好的应用前景，是基因文库技术发展的一个新动向。26（三）文库的筛选n1.筛选文库的策略n根据已知基因编码产物的特定活性进行筛选。不需要附加任何先决条件，通过检测在特定条件下来源于两个文库的基因编码产物之间发生相互作用的情况从而确定出两个文库中所有可能在生理上发生相互作用的基因对，描绘出某一特定类型细胞内表达出的基因之间发生的基因相互作用的联络图。n2.基于基因编码蛋白质的检测筛选表达文库（1）噬菌体表面展示系统（2）酵母双杂交系统（3）酵母单杂交系统27（

10、四）基因文库技术在功能基因组学研究中的应用n人类基因组计划n功能基因组学28第四节定向进化的应用一、提高酶分子的催化活力w实例1：L-天冬氨酸酶定向进化研究w实例2：-天冬氨酰二肽酶的定向进化w实例3：31四、提高底物的专一性和增加对新底物催化活力n提高底物专一性，可以使酶更加适应工业化生产，而底物专一性是可以通过进化来提高的n利用结合能力来代替催化能力进行筛选的不利之处是，有时提高结合能力超出了酶反应所需最适值，反而降低酶的催化效率五、对映体选择性的定向进化n定向进化可以提高R转氨酶的对映体选择性32六、变换催化反应专一性 最近研究表明，立体选择性酶的专一性是可以变化的，也就是酶的柔性，利用定向进化方法可以改变酶的专一性 调整酶的底物专一性对于合理化设计而言是十分困难的，但对于定向进化却是一种比较容易达到的目的33第五节总结与展望w酶分子定向进化策略是非常有效的、更接近于自然进化过程的一种蛋白质工程研究新策略，是分子进化的一个重要分支，是组合化学的思想和方法在酶分子改造上的应用w以基因重组技术为表现形式，有性进化思想对于酶（