海马神经细胞培养-

1、实验材料:1、所有用于细胞培养的器械、器皿剂溶液必须灭菌消毒。2、多聚赖氨酸铺板以磷酸盐缓冲液(PBS或蒸馏水荣分解多聚赖氨酸(分子量为30-70KD至1mg/ml。分装储存。临用前稀释至终浓度为20-60mg/ml过滤备用。在培养板或皿中加少量多聚赖氨酸溶液,以覆盖底部为宜,在37、CO2孵箱中过夜。次日,用移液管吸取多聚赖氨酸,并用水洗2-3遍,晾干备用,如果培养目的适用于电生理的单细胞记录或者免疫组化和荧光染色,则在培养皿的底部加上盖玻片,多聚赖氨酸铺于盖玻片上,则更易得到强烈的荧光信号。3解剖液(HEPES平衡盐溶液取100ml 10x 平衡盐溶液(Hanks balance salt

2、 solution,HBSSHEPES 3.9g,NaHCO3 0.84g,青霉素 104 U,链霉素 100mg,H2O 800ml。以1mol/LHCl调节PH至7.2,再加H2O之后总体积为1L,以0.2m直径的滤菌器过滤,4保存。4、DMEM 培养基(Dulbeccos modified Eagles mediumDMEM 培养基500ml,加小牛血清和或马血清各10%(血清需经56,30min 灭活1% 的青/链霉素.5、无血清培养基最常用的一种无血清培养基为,Neurobasal+2%的b27+1%抗生素6、2.5%胰蛋白酶(typsin溶液临用前以解剖液稀释至终浓度0.125%。

3、7、台盼蓝(typan blue 溶液终浓度为0.2%-0.4%。8、阿糖胞苷终浓度为8-10 mol/L。9、动物妊娠天数的选择通常选择出生24h之内的乳鼠。实验步骤:1、脱臼处死乳鼠,75%的酒精浸泡3-5min,将清洗完的乳鼠放入含预冷解剖液的培养皿中。2、用两把尖镊逐个去除鼠的头部皮肤和颅骨,取出全脑,置于另一含预冷解剖液的(PBS?培养皿中,小心剥离并去除脑膜及脉络丛。3、在中线处用尖镊分离大脑半球,在解剖显微镜下小心去除嗅球、中隔、丘脑及下丘脑,剥离脑膜及脉络丛,在大脑皮层下方小心取出海马,置于含冰冷解剖液的6cm培养皿中。4、用弯头尖镊把海马剪成小碎片,收集全部海马碎片,置于一含

4、有0.25%胰蛋白酶溶液的培养皿中(该溶液必须在37孵箱中预暖,在孵箱中消化5-7min。5、收集全部海马碎片,置于10ml预暖的DMEM培养基的试管中(培养基中含有10%的胎牛血清和或马血清各,1%抗生素,以及谷氨酰胺。最好用培养基洗2-3遍,以中止消化反应。6、加少量培养基于试管中,以中空塑料管反复吹打10-15次,直成细胞悬液。加培养基于同一试管中至约10ml,静置约10min。取1-2l细胞悬液于99l0.2%-0.4%台盼蓝溶液中,用细胞计数板计算存活和死亡的细胞数,从而测定细胞密度(细胞计数:活体细胞具有排斥台盼蓝的能力,而死亡细胞则能吸收台盼蓝变成蓝色。7、根据实验需要,以培养基

5、稀释细胞悬液至所需的细胞密度,接种细胞至经多聚赖氨酸铺板过夜处理的培养皿或培养板中。通常细胞密度为(2-2.5x105细胞/cm2.8、待6-8h细胞贴壁后,换培养基为含2%B27的Neurobasal,含有B27 和0.5mM的谷氨酰胺。9、培养2-3d培养基中加入8-10mol的阿糖胞苷,以抑制或阻止非神经细胞和原代胶质增殖。10、每三天用Neuronbasal使用液半量换液三、形态学观察细胞接种6-12h,开始贴壁,细胞成圆形或椭圆形,两周后神经元最为丰满,胞体圆形或多角形,四周晕光明显,胞核及核仁清晰可见,位于细胞中央或一边,神经多而粗大,分支成网络。培养一月后,细胞开始退化。一般认为

6、,培养2-4周开始实验比较适宜。附:血细胞计数法及台盼蓝测细胞活度(一实验材料和实验前准备1、显微镜,血细胞计数器,盖玻片2、毛细移液管,1 ml血清移液管,5ml试管,擦镜纸或软布3、0.4%的台盼蓝溶液,0.3%苯胺黑(nigrosin溶液,95%,乙醇4、用擦镜纸或者软布将血细胞计数板的计数池擦干净。再用酒精95%血细胞技术板和盖玻片,晾干备用。5、讲清洁干净的盖玻片覆盖于血细胞技术板的计数池上。6、胞浓度=4大格细胞数/4×稀释倍数×104/m(二实验步骤1、制备制备细胞悬液取一试管,分别加入0.4%台盼蓝溶液0.2ml (或0.3%苯胺黑溶液及混合均匀的细胞悬液0

7、.8 ml,用手轻柔振荡试管,以混合悬液和染料。2、以中空移液管轻柔混匀细胞悬液后,立即用毛细移液管吸取少量细胞悬液,置移液管尖头于细胞计数板计数池的边缘(小心不要移动盖玻片,缓缓释放细胞悬液。通常一侧计数池可以容纳20 ul细胞悬液。3、细胞计数每个正方形的边侧都有三根线,在左侧和上方,应将接触到三根线的中线的内侧线的细胞计算在内,技术两侧计数池,共八个正方形。四、注意事项1、L-多聚赖氨酸(0.1mg/ml包被培养板后,要待其干后才能接种,因为其对神经元有毒性。L-多聚赖氨酸(0.1mg/ml能回收再利用。2 、取脑组织时动作尽量要快,并且尽量低温操作。3 、分离皮层和海马时,要尽量分离脑膜和血管,否则有大量的成纤维细胞。4 、用吸管轻轻吹打细胞时,尽量不起泡沫,以免损伤神经元。5 、接种细胞的过程,动作要快,以免细胞聚集。6 、接种细胞后,24h勿移动,以免影响细胞贴壁。五、结果、大多数神经元在接种1h内贴壁,3-5h开