浅论罗格列酮延缓糖尿病大鼠血管钙化的发展

1、浅论罗格列酮延缓糖尿病大鼠血管钙化的发展 【摘要】 目的： 观察罗格列酮对糖尿病大鼠钙化血管的治疗作用及对骨转录因子Msx2表达的影响。方法： 在高脂饮食加小剂量链脲佐菌素腹腔注射处理的基础上，加用维生素D3和尼古丁处理，制备糖尿病合并血管钙化大鼠模型(糖尿病合并血管钙化组)，给予部分糖尿病合并血管钙化组大鼠罗格列酮灌胃 (2 mgkg-1，每天1次，共8周)处理，同时设立空白对照组。实验第21周末，处死各实验组大鼠，检测各组大鼠的代谢指标，进行血管 von Kossa染色，检测血管钙含量和碱性磷酸酶活性，应用realtime PCR方法检测 Msx2 mRNA 及蛋白免疫印迹方法检测 Msx

2、2 蛋白在血管中的表达变化。结果： 与对照组相比，糖尿病合并血管钙化组大鼠血管内存在弥漫性的钙盐沉积，血管内钙含量增高,碱性磷酸酶活性增强，Msx2 mRNA和蛋白表达明显增高 (均P0.05);而给予罗格列酮处理后，钙盐在血管内的沉积明显减少，钙含量和碱性磷酸酶活性分别下降8.37%、10.59%，Msx2 mRNA和蛋白表达也分别下降 36.73 %、 42.55 %(与糖尿病合并血管钙化组相比,均P0.05)。结论： 罗格列酮可以延缓糖尿病大鼠血管钙化的发展，并可以减少钙化血管中Msx2的表达。 【关键词】 2型糖尿病; 血管钙化; 转录因子 Msx2; 罗格列酮; 大鼠与非糖尿病患者相

3、比，2型糖尿病患者易于发生大血管钙化。血管钙化是指钙磷病理性地沉积在血管壁上。根据其在血管壁上沉积的部位不同，分为内膜钙化和中膜钙化。目前中膜钙化已经成为心血管疾病死亡率的独立预测因素1。中膜钙化主要表现为沿中膜弹力层的钙盐沉积，导致血管僵硬度增高和顺应性下降。血管僵硬度的增高则进一步导致心脏做功、脉搏压和脉搏波速度增加，最终引起血管膨胀受损，左室肥厚和冠脉灌注减少。Msx2(msh homeo box homolog 2)是骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein2, BMP2)下游的一个转录因子，主要调控膜内成骨的发生。Cheng等34研究结果显示，Msx2可以调

4、节血管外膜的成肌纤维细胞向成骨样细胞表型分化，诱导血管钙化的发生。本实验即通过建立糖尿病合并血管钙化的大鼠动物模型，观察罗格列酮对于糖尿病大鼠钙化血管的治疗作用及对Msx2表达的影响。1 材料和方法1.1 材料6周龄雄性 Wistar 大鼠(体质量160180 g，30只)购自上海实验动物中心;链脲佐菌素 (streptozotocin, STZ)、维生素D3、尼古丁、钙检测试剂盒和碱性磷酸酶活性检测试剂盒购自美国 Sigma 公司;罗格列酮药物原粉由中国药科大学袁耀佐博士惠赠;血脂比色法检测试剂盒购自英国 Randox 公司;血清胰岛素放免法检测试剂盒购自美国 Linco Research

5、公司;BCA 试剂盒购自美国Pierce 公司;Trizol 购自美国 Invitrogen 公司;Prime Script RT reagent 试剂盒和SYBR Premix Ex Taq PCR 试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司;realtime PCR 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;蛋白裂解液购自碧云天生物技术研究所;Msx2 山羊抗大鼠多克隆抗体购自美国 Santa Cruz 公司，actin兔抗鼠多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG 和兔抗山羊 IgG 购自北京中衫金桥生物技术有限公司;ECLPlus 检测试剂盒购自英国 G

6、E Healthcare 公司;所用其它试剂均系市售分析纯产品。1.2 动物模型制备将30只雄性 Wistar 大鼠随机分成3组(对照组、糖尿病合并血管钙化组和罗格列酮组)，每组各10只。给予糖尿病合并血管钙化组和罗格列酮组大鼠高脂饲料(50%碳水化合物，20%猪油，10%豆油，11%蛋白质，2.5%胆固醇，6.5%纤维和其他物质)喂养，对照组大鼠予普通饲料喂养。8周后，予糖尿病合并血管钙化组和罗格列酮组大鼠腹腔注射小剂量链脲佐菌素 (25 mgkg-1)，建立2型糖尿病模型。对照组大鼠予等量柠檬酸钠溶液腹腔注射。 1周后参照Niederhoffer等报道的方法，对糖尿病合并血管钙化组和罗格列

7、酮组大鼠制备钙化模型：上午8:00给予维生素D3 (300 000 Ukg-1)肌肉注射，尼古丁溶于花生油(质量浓度为25 mgkg-1)按5 mlkg-1灌胃，晚上20:00给予尼古丁重复灌胃1次。予对照组大鼠等量生理盐水肌肉注射和单纯花生油灌胃处理。4周以后，给予罗格列酮组大鼠罗格列酮2 mg(kgd)-1灌胃8周，予糖尿病合并血管钙化组和对照组大鼠生理盐水灌胃。于实验第21周末，注射过量戊巴比妥钠处死动物，经心脏采血留取血标本，摘取胸、腹主动脉用生理盐水冲洗后称质量，于-80 贮存备用。1.3 代谢指标检测各组大鼠的血糖 (glucose, Glu) 通过葡萄糖氧化酶法检测，利用 Ran

8、dox 公司的比色法试剂盒检测血总胆固醇 (cholesterol, Cho) 和甘油三酯 (triglyceride, TG) 含量，血胰岛素 (insulin, Ins) 水平利用Linco公司的放免试剂盒检测。所有操作重复3次。1.4 von Kossa染色取大鼠胸主动脉段约0.5 cm，在10%福尔马林溶液中固定后石蜡包埋，制作6 m厚切片，常规脱蜡、脱水。浸入5%硝酸银溶液，在日光下照射30 min后用蒸馏水清洗数遍，将切片置于5%硫代硫酸钠溶液中1 min后蒸馏水清洗数遍，用1%伊红染色复染数秒钟。脱水、透明后封片，光镜观察，拍照。1.5 钙含量和碱性磷酸酶活性检测取主动脉组织(约

9、 10 mg)于 55 彻底烘干，加入 10%甲酸(按 30 lmg-1 组织干重)，4 过夜。按照钙检测试剂盒说明书操作，利用比色法检测血管组织中的钙含量。取-80 贮存的主动脉组织，加入PBS后制备匀浆，12 000g离心10 min，上清液利用BCA试剂盒进行蛋白定量检测。血管组织中碱性磷酸酶活性按照试剂盒说明书检测，碱性磷酸酶活性用 硝基苯酚为标准值计算，1单位表示30 min内产生1 nmol硝基苯酚的活性。结果用蛋白含量进行标准化。1.6 realtime PCR使用Trizol提取大鼠血管组织中总 RNA，按照Prime Script RT reagent试剂盒说明书，逆转录合成

10、 cDNA。按照 SYBR Premix Ex Taq PCR 试剂盒说明书进行realtime PCR反应，所用Real Time PCR扩增仪为LineGene (Bioer, 杭州博日)。Msx2上游引物为5CCTTCCCTATCAACTCCC3，下游引物为5TACAT GCCATATCCCACC3;GAPDH上游引物为5TAT GATGACATCAAGAAGGTGG3，下游引物为5 CAC CACCCTGTTGCTGTA3。95 5 s，60 20 s，36个循环。实验结果使用2CT方法分析。1.7 蛋白免疫印迹(Western blotting)使用蛋白裂解液提取血管组织中总蛋白质，

11、用 BCA 试剂盒测定蛋白浓度，将各组蛋白稀释成等浓度后，进行 SDSPAGE 凝胶电泳分离，用BioRad 系统转移至PVDF 膜上，用 5%脱脂奶粉封闭后加入山羊抗大鼠Msx2 抗体( 1200)孵育过夜，洗膜后在辣根过氧化物酶标记兔抗山羊 IgG中孵育1 h，最后用ECLPlus检测试剂盒以 X 线片自显影显示结果。各组 Msx2 蛋白表达以actin作为对照。1.8 统计学处理所有实验数据均使用SPSS 13.0统计软件进行分析，结果以x-s表示，用单因素方差分析(ANOVA)作统计学处理，组间比较用StudentNewmanKeuls(SNK)方法检验，P0.05为差异有统计学意义。

12、2 结 果2.1 代谢指标结果见表1。与对照组大鼠相比，高脂饮食加小剂量的链脲佐菌素腹腔注射使糖尿病合并血管钙化组和罗格列酮组大鼠血糖明显增高(P0.01)，大鼠体质量和血胰岛素水平则明显下降(P0.05)。与糖尿病合并血管钙化组大鼠相比，罗格列酮组大鼠的血糖水平明显下降(P0.01)，而体质量则有所增加(P0.01)，但血胰岛素水平无明显变化。各组大鼠的血总胆固醇和甘油三酯水平无明显差异。表1 各组大鼠一般生化代谢指标比较1)与对照组相比，P0.01; 2)与糖尿病合并血管钙化组相比，P0.012.2 von Kossa染色von Kossa染色是用来检测血管中钙盐的沉积。在对照组大鼠血管中

13、未见钙盐沉积(图1a)。在糖尿病合并血管钙化组大鼠血管中，可见全层有明显的深褐色钙盐沉积(图1b)。而使用8周罗格列酮灌胃处理后，罗格列酮组大鼠的血管中，钙盐沉积情况较糖尿病合并血管钙化组大鼠明显好转(图1c)。A.外膜; M.中膜; I.内膜a.对照组大鼠血管; b.糖尿病合并血管钙化组大鼠血管; c.罗格列酮组大鼠血管图1 大鼠血管von Kossa染色 4002.3 钙含量和碱性磷酸酶活性检测2.4 血管中Msx2 mRNA和蛋白的表达变化 3 讨 论糖尿病合并心血管钙化的发生率是非糖尿病的4倍。血管钙化的发生与否是糖尿病患者预后的一个重要预测因素。有研究1表明，在2型糖尿病患者中，发生

14、中膜钙化的患者下肢截肢的风险要增高4倍，同时发生心血管病死亡的几率也会增高2倍。罗格列酮是噻唑烷二酮(thiazolidinedione,TZD)类治疗糖尿病药物，通过结合和活化过氧化酶体增殖物活化受体(peroxisome proliferator activated receptor gamma,PPAR)，调控脂肪细胞、内皮细胞以及其他细胞中特异基因的表达，从而提高细胞对胰岛素作用的敏感度，它除了可通过改善糖、脂代谢对防治糖尿病并发症有益外，还能抑制糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE) 表达增加 ，抑制炎症

15、因子TNF、IL6、IL1表达，下调基质金属蛋白激酶活性。 这种抗炎症特性有助于阻止和治疗动脉粥样硬化进展以及其它的炎症。本实验通过在高脂饮食加用小剂量STZ腹腔注射处理的基础上，加用维生素D3和尼古丁的方法，制备了2型糖尿病合并血管钙化的大鼠动物模型，观察罗格列酮对糖尿病大鼠血管钙化的治疗作用。我们发现，无论是糖尿病合并血管钙化组大鼠，还是罗格列酮组大鼠，其血糖水平都较对照组明显升高，而血胰岛素水平则明显下降，这一结果提示，该两组大鼠都具有了2型糖尿病的基本病理学特征。进一步的血管von Kossa染色结果显示，在糖尿病合并血管钙化组大鼠的血管全层可见弥漫性钙盐沉积，同时该组大鼠血管钙含量和

16、碱性磷酸酶的活性也较对照组成倍增高。这一结果提示，糖尿病患者体内慢性持续性的血糖增高可能是血管钙化发生发展的高危因素。在对糖尿病合并血管钙化的大鼠加用罗格列酮干预后，我们发现，在大鼠血糖明显下降的同时，血管von Kossa、钙含量和碱性磷酸酶活性这3项反映血管钙化的指标也较糖尿病合并血管钙化组大鼠有明显改善。这一结果提示，罗格列酮可以通过控制血糖来延缓血管钙化病变的进展。为了进一步研究糖尿病血管钙化发生的机制，我们还检测了钙化大鼠血管中Msx2 mRNA和蛋白的表达变化。Msx2基因是同源基因Msh家族成员，在骨形成和成骨细胞分化过程中发挥重要作用。既往的离体实验研究显示，钙化的大鼠血管平滑

17、肌细胞中Msx2基因表达成倍增高。本实验结果显示，作为在骨形成过程中一种重要的转录因子，Msx2在钙化的血管内大量表达，这一现象提示血管钙化是一个类似于骨形成的、主动的过程。Msx2的大量表达可以引起下游的另一个骨转录因子 Osterix表达增加，并进一步引起碱性磷酸酶的表达增加，最终导致异位的钙盐沉积。我们在加用了罗格列酮干预后，血管内Msx2 mRNA和蛋白表达则明显下降，这可能与罗格列酮的抗炎症作用有关。有研究显示，炎症介质 TNF可以加剧Msx2在血管内的表达。罗格列酮用于降糖治疗的同时，通过其抗炎作用的发挥，抑制炎症介质的释放，减少了Msx2的表达 ，对于延缓钙化的发展起到了一定的作

18、用。血管钙化的确切机制目前还不是十分清楚，并且也无有效的治疗方法。我们的研究结果显示,糖尿病可以明显加速血管钙化的发生发展，而降糖药物罗格列酮可以减缓糖尿病患者血管钙化的进展，这为今后的基础研究和临床实验提供了一定的研究基础。【参考文献】 1LEHTO S,NISKANEN L,SUHONEN M,et al.Medial artery calcification.A neglected harbinger of cardiovascular complications in noninsulindependent diabetes mellitus J.Arteriosclerosis,Th

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20、 differentiation of multipotent mesenchymal progenitors J.J Biol Chem,2003,278:4596945977.SHAO J S,CHENG S L,PINGSTERHAUS J M,et al.Msx2 promotes cardiovascular calcification by activating paracrine Wnt signals J.J Clin Invest,2005,115:12101220.NIEDERHOFFER N,BOBRYSHEV Y V,LARTAUDIDJOUADIENE I,et al.Aortic calcification produced by vitamin D