浅论积雪草酸与化疗药物联用抗肿瘤效应的初步研究

1、浅论积雪草酸与化疗药物联用抗肿瘤效应的初步研究                作者：林娜，高静，方春钱，张海峰，杨永建，顾亚君，郭文洁【摘要】  目的： 研究积雪草酸（asiatic acid，AA）与化疗药物环磷酰胺（CTX），5氟尿嘧啶（5Fu）联用的抗肿瘤作用。方法： 采用在体与离体实验相结合的方法，观察AA与5Fu或CTX联用对肝癌细胞株HepG2增殖和Heps肝癌腹水瘤、实体瘤生长的影响。用MTT法检测联用AA和5Fu的抗肿瘤效果。结果

2、： 10，15，20，25 mol/L AA与50，7.5，1 mol/L 5Fu联用，具有显着的抗肿瘤作用，AA不降低5Fu对HepG2细胞增殖的抑制作用。AA和CTX联用于Heps腹水瘤小鼠，发现AA（50,100 mg/kg）和CTX（20 mg/kg）联用与单用CTX一样，能抑制腹腔积液的增生，且可延长Heps腹水瘤小鼠的寿命；AA和CTX联用于Heps实体瘤小鼠，有明显的抑瘤作用，而且AA能对抗CTX诱导的谷胱甘肽（GSH）水平的降低，可能对肝脏的抗氧化能力有一定的保护作用。结论： AA与化疗药物联用，可以减弱化疗药物的毒副作用。 【关键词】  积雪草酸； 5氟尿嘧啶； 环

3、磷酰胺； 联合用药； 抗肿瘤AbstractObjective: Study the antitumor effects of asiatic acid（AA）combined with chemotherapeutics cyclophosphamide(CTX) or 5fluorouracil(5Fu).  Methods： The cytotoxic effects of the combination of AA and 5FU on tumor cell lines HepG2 were detected by MTT assay.Mice transplanted wi

4、th Heps solid tumor and ascites carcinoma were used to study the combination antitumor effect of AA(50,100 mg/kg) and CTX(20 mg/kg).  Results： When AA(10, 15, 20, 25 mol/L) and 5Fu(50, 7.5, 1 mol/L) was combinated to treat the cells, the growth of HepG2 cells were inhibited obviously. On the ot

5、her hand, AA prolonged the survival time of mice with Heps ascites carcinoma compared with those in CTX group and showed significant antitumor activity simultaneously. The protection of AA on hepatic GSH level insulted by CTX in mice with Heps solid tumor treated with AA and CTX confirmed the attenu

6、ated toxicity effects of AA, which might be associated with hepatopretection of AA. Conclusion： The present data suggest that AA attenuate the toxicity of some chemotherapeutics and may be helpful in cancer treatment with the combination of chemotherapeutics.Key words  asiatic acid; 5fluorourac

7、il; cyclophosphamide; drugcombination; antitumor   肿瘤已成为人类致死的三大疾病之一。目前临床使用的环磷酰胺（CTX），5氟尿嘧啶（5Fu）等抗肿瘤药物化疗时均产生明显的不良反应，引起正常组织的多器官毒性、免疫抑制、反复感染， 机体衰弱等现象1, 2。本实验室已有的研究也发现CTX通过影响小鼠肝脏线粒体功能从而导致肝损伤3。我国一些传统中药因其较少的不良反应 、对机体具有保护和调理作用, 成为中西药联合化疗的研究热点。研发新型抗肿瘤增效、减毒剂可能是战胜恶性肿瘤的途径之一4。     积雪草酸（

8、asiatic acid，AA），又名亚细亚酸，是我国传统中药积雪草的五环三萜类组分之一。经研究证明，AA具有促进成纤维蛋白合成5, 6、对抗CCl4和DGalN诱导的肝损伤7、对抗神经细胞的氧化损伤8等细胞保护作用。另外，也发现AA具有抑制肿瘤细胞增殖的作用9, 10。但是对于AA应用于在体抗肿瘤治疗的实验研究尚未见报道。本研究将在体与离体实验相结合，观察了AA与5Fu或CTX联用对肝癌细胞株HepG2增殖和Heps肝癌腹水瘤、实体瘤生长的影响。   1  材料和方法1.1  材料   人肝癌细胞株（HepG2）：南京大学徐力致老师

9、惠赠；ICR小鼠（雄性），体质量1822 g，购自扬州大学比较医学中心，合格证号：SCXK（苏）20020009。动物饲养昼夜循环为10/14 h，环境温度为25左右，自由饮食进水；Heps腹水瘤种鼠源自江苏省肿瘤医院；MTT（Sigma公司）；5Fu（上海旭东海普药业有限公司）；积雪草酸，纯度95%（广西昌洲天然产物有限公司），用于在体实验的AA用环糊精包埋，由江苏大学化学化工学院张蓉仙老师制备；环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：国药准字H32020857）；环糊精（南京中脉远红股份有限公司谢家坤高工惠赠）；谷胱甘肽（GSH）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。1.2 

10、离体实验HepG2细胞培养于含10 %小牛血清的MEM培养基。细胞接种于培养瓶中，置于37，5 % CO2的孵箱中培养，23 d传代1次。将处于对数生长期的细胞接种于96孔培养板，接种密度为2×104 个/ml，每孔100 l。培养24 h后，加入10，20，30，40 mol/L AA，48 h后用检测细胞活性，分析AA对HepG2细胞增殖的影响。采用50，7.5，1  mol/L的5Fu分别与不同浓度AA（10，15，20，25 mol/L）联合用药。以含1 DMSO的培养基为对照。96孔培养板中细胞经药物处理后，弃去培养基，每孔加100  l MTT（Dha

11、nks液溶解，1 mg/ml），37孵育4 h后，吸去上清，每孔加DMSO 100  l，待结晶物充分溶解，用酶标仪（Spectrum 190，Moleculer Devices）于570 nm处测光密度值。1.3  在体实验Heps腹水瘤模型:取Heps腹水瘤小鼠，处死后浸泡于75%乙醇5 min，腹腔穿刺取腹腔积液，计数稀释至1×107个 /ml，取0.2 ml肿瘤细胞悬液接种于ICR小鼠腹腔。Heps实体瘤模型：同Heps腹水瘤模型，制备2×107个/ml的Heps瘤细胞悬液，0.2 ml/只，接种于ICR小鼠右侧腋下。  &#

12、160;      荷瘤小鼠随机分为5组，对照组、CTX组、低剂量AA和CTX联用组、高剂量AA和CTX联用组及高剂量AA组，每组10 只。于腹腔接种瘤细胞的次日开始给药，联合用药组每日皮下注射CTX（20 mg/kg）并分别灌胃低剂量（50 mg/kg）和高剂量（100 mg/kg）AA；CTX组皮下注射CTX（20 mg/kg），以等量环糊精灌胃作为对照；高剂量AA组灌胃高剂量AA（100 mg/kg），皮下注射等量生理盐水。对照组皮下注射等量生理盐水，灌胃等量环糊精。   腹水瘤小鼠存活率检测分3组：对照组,20 mg

13、/kg CTX组，50 mg/kg AA和20 mg/kg CTX联用组。观察小鼠的存活情况，并记录每天存活小鼠只数，进行生存期比较。存活率=存活小鼠/小鼠总数×100%给药15 d后，小鼠眼底静脉丛取血，然后颈椎脱臼处死小鼠，剥取肿瘤组织，称重，计算肿瘤抑制率。取肝脏左大叶相同部位肝组织，用适量生理盐水制备成10%组织匀浆，试剂盒检测GSH含量。1.4  统计方法实验数据运用SAS软件进行单因素方差分析（ANOVA），组间比较作SNKq检验。显着性标准为0.05。腹水瘤小鼠存活率比较用2检验。2  结  果2.1  AA对肿瘤细胞增殖的影响&

14、#160;  如图1所示，AA的剂量小于20 mol/L时，对HepG2细胞的生长没有明显影响；当剂量达到30 mol/L时，细胞活性显着降低；随着剂量的继续加大，抑制细胞增殖的作用逐渐加强。2.2  AA和5Fu联用抑制肿瘤细胞增殖   采用10, 15，20，25 mol/L的AA，分别与50，7.5，1 mol/L 5Fu联用。结果如图2所示。随着5Fu浓度的降低，5Fu和AA联用的抗肿瘤效果也逐渐降低。10, 15，20，25 mol/L 的AA和5Fu联用后抗肿瘤趋势与单用5Fu的趋势一致。说明AA对3个浓度 5Fu的抗肿瘤效果均没有影响。2.

15、3  AA与CTX联用对Heps腹水瘤小鼠存活率的影响由图3可以看出： CTX组小鼠出现死亡较早，和AA联用后，死亡延缓。说明AA有降低CTX毒性，延长荷瘤鼠寿命的作用。      接种肿瘤后第14天荷瘤小鼠存活率统计分析表明，20 mg/kg CTX组小鼠的存活率低于对照组，说明CTX抑瘤的同时产生了明显的毒性作用；而AA与CTX联用组小鼠的存活率有所提高，提示AA有延长荷瘤小鼠寿命、降低CTX毒性的作用（表1）。表1  化疗第14天各组荷瘤鼠的存活率（略）   2.4  AA与CTX联用抑制Heps实

16、体瘤的作用   由图4可以看出：20 mg/kg CTX对Heps实体瘤具有良好的抑制作用，单用100 mg/kg AA 的抗肿瘤活性较弱，两者联用后具有显着的抗肿瘤作用，50，100 mg/kg AA均没有减弱CTX的抗肿瘤活性。   2.5  AA与CTX联用对荷瘤小鼠抗氧化能力的影响   从图5可以看出：CTX组荷瘤小鼠肝组织中GSH含量显着下降，而AA和CTX联用组GSH含量和对照组相比差异无统计学意义，说明AA对抗了CTX 诱导的荷瘤小鼠肝脏GSH水平的降低。3 讨论   AA对不同肿瘤细胞具有

17、不同的抗肿瘤机制9,10，低剂量时则可以保护细胞对抗损伤5，7。本研究首次将AA应用于中西药联合化疗，通过AA和5Fu联用，观察体外联合用药的效果；AA和CTX联用，观察在体抗肿瘤的效果。结果表明，选择合适的剂量，可以使AA在不影响抗肿瘤药物作用的前提下，发挥其细胞保护作用。   之前有文献报道：在CTX引起的肝毒性过程中，自由基和氧化应激是两个不可忽视的因素，两者导致脂质过氧化反应的剧烈进行，胞内抗氧化防御体系通过非酶促反应清除自由基，GSH 迅速耗竭11。从Heps实体瘤模型结果可知， AA对抗CTX诱导的肝脏GSH活性的降低，提示AA对肝脏具有保护作用，这与以前的研究

18、结果一致8。   AA单独应用没有发挥理想的抑瘤作用，而影响药物作用的因素很多，且由于实验中观察到AA的水溶性不好，我们推测生物利用度不高可能是重要的影响因素之一。因此也许通过改变AA的剂型，使其在体内能达到抗肿瘤的血药浓度，可以进一步研究AA的在体抗肿瘤效果，为AA 的临床应用提供理论依据。【参考文献】  1Bukowski RM. The need for cytoprotection J. Eur J Cancer, 1996, 32A(4): S2-S4.2Fraiser LH, Kanekel S, Kehrer JP. Cyclophosphamide toxicity.Characterizing and avoiding the problem J. Drugs, 1991, 42(5): 781-795.3张海峰, 高静, 林娜, 等. 环磷酰胺致肝损伤时肝细胞线粒体的变化J. 江苏大学学报:医学版,2008, 18