流式细胞术在血小板检测中的应用于方法介绍 - 图文-

1、 Flow Cytometry June 2000 · · · 一次性 12´75 mm Falcon 试管。 微量加样器和加样头。 BD 抗体：2-8°C 保存。 荧光抗体 对照管 试验管 FITC PAC-1+RGDS PAC-1 PE IgG1 CD62P PerCP CD61 CD61 · · RGDS (PAC-1 阻断剂：用 PBS 配制，10mg/ml。 血小板激活剂：ADP，浓度 2´10 M，2-8°C 保存。也可选用其他激活剂， 如 PMA、纤维蛋白、TRAP。 -4 · &

2、#183; · · · · PBS 缓冲液：含 0.1%NaN3，过滤后 2-8°C 保存。 固定液：含 1%多聚甲醛的 PBS 缓冲液，2-8°C 可保存一周。 振荡混匀器。 FACS 流式细胞仪：进行数据获取。 CaliBRITE Beads/FACSComp 软件：FACS 仪器校正，预设获取条件。 CellQuest 软件：试验数据获取和分析软件。 操作步骤 1. 标本采集： (1 采血管顺序编号。 (2 抽取静脉血，采血管中注入 2ml。 (3 于 10 分钟之内完成血小板激活和染色步骤，操作时应注意减少人工激活。 2. 血

3、小板激活： (1 试管内加入 50mlADP，450ml 全血，轻轻摇匀。 (2 室温孵育 5 分钟。 (3 立即染色。 3. 荧光抗体染色： (1 Falcon 管编号。 (2 在对照管中加入 PE 同型对照、CD61 PerCP、PAC-1 各 20ml，RGDS 加 49 Flow Cytometry June 2000 10ml。 (3 在试验管中加入三种抗体各 20ml。 (4 在对照管和试验管中各加入未激活或激活的血标本 5ml。 (5 轻轻混匀，室温暗处孵育 15-20 分钟。 (6 各管中加入 1ml 冷的固定液 (2-8°C，充分混匀， 2-8°C 阴暗处

4、放置 30 分 钟。 (7 24 小时内上机分析。 4. 上机获取数据： (1 开机： · · · · · · · · · 检查鞘液筒装满，废液筒倒空。 先打开流式细胞仪，再打开计算机。 仪器气路加压，排空气泡。 做 FACSComp。 调出 获取条件，FSC 和 SSC 选择 Log 方式。 获取条件为 CD61 PerCP 阳性。 使用对照管调整 FL1 和 FL2 的 PMT，使阴性群体位于 FL1 vs FL2 点图 左下角。 分别使用 PAC-1 FITC / IgG1 PE / CD61 Pe

5、rCP 和 PAC-1 FITC+ RGDS / CD 62P PE / CD61 PerCP 调整 FL2-FL1 和 FL1-FL2 补偿。 获取各管的试验数据。 (2 打开 CellQuest，顺序放置对照管和试验管，获取数据： 5. 结果分析： 在 CD61 vs SSC 点图中设门找血小板群。 CD61 vs SSC 点图显示有三群， CD61 阳性/低 SSC 一群主要由单个血小板组成，CD61 阳性/高 SSC 一群主要由黏附血小 板的血细胞组成， CD61 阳性/散射光更低的一群主要由血小板来源的 碎片组成。由于在生理和病理情况下，血小板群和红细胞群的大小、颗粒度会有交叉， 因

6、此，不建议使用 FSC-SSC 图设门。 在 CD61 vs SSC 点图中找出 CD61 PerCP 阳性的血小板群 (单个血小板和黏 附在 WBC 上的血小板，设门。门内做 PAC-1 FITC vs CD62P PE 点图的双参数 分析，统计结果。 50 Flow Cytometry June 2000 注意事项 1. 采血时请用大号针管，抽出的前 2ml 血应弃去不用。 2. 尽量避免标本受到物理振动。 3. 取血后 10 分钟内完成染色操作。 4. 在 Falcon 管中加血标本 5ml， 管壁上不能有残留血， 未染色的部分会影响试验结果。 5. 为了检测和控制血小板体外激活，建议使用正常未受激活的血标本平行做质量控 制。 51 Flow Cytometry June 2000 附：BDIS 血小板活化试剂 BD 抗体： CD PAC-1 CD62P CD61 Isotype g1 CaliBRITE 3 Ig Subclass IgM IgG1 IgG1 Form FITC PE PerCP PE Unlabeled,FITC,PE,PerCP Catalog No. 340507 348107 340506 340013 340486 Tests 50 100 50 25mg 25 辅助试剂： 浓 RG