质粒DNA的提取实验

1、试验六 质粒DNA的提取一、试验目的通过本试验学习和把握碱裂解法提取质粒二、试验原理质粒(Plasmid)是独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。它是一种环状的双链DNA分子，存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。本试验利用SDS碱裂解法提取质粒DNA。将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁裂开，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。在裂解过程中，细菌蛋白质、裂开的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被SDS（十二烷基硫酸钠）包盖。当用K+取代Na时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去变性剂后，就

2、可以从上清中回收复性的质粒DNA。三、试验材料与试剂1、试验材料 大肠杆菌（含有携带插入片段的质粒PMD-18T）2、试验试剂 (1) 溶液：Tris·HCl(pH8.0)25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L,葡萄糖50mmol/L； (2) 溶液(新颖配制) ：NaOH 0.2mol/L,SDS 1%(W/V)； (3) 溶液(100ml)：5mol/L乙酸钾60ml,冰乙酸11.5ml(pH4.8),水28.5ml； (4) 氯仿异戊醇（24：1）； (5) 异丙醇、70%乙醇；四、试验步骤（一）提取质粒1. 挑转化后的单菌落(含PMD-18T质粒)，接种到2

3、0ml含有适当抗生素(Amp)的丰富培育基中(LB培育液)，于37猛烈振摇下培育过夜。（由老师完成）2. 将1.5ml的培育物倒入1.5ml的EP管中，于4 以12000rpm离心1min。3. 离心结束, 弃去上层培育液，再向离心管中加入1.5ml的培育物，于4 以12000rpm离心1min。4. 弃去上层培育液，使细菌沉淀尽可能干燥。5. 将细菌沉淀重悬于100l冰预冷的溶液中,用Tip吸头吹打沉淀至完全混匀(无块状悬浮)。6. 加200l新配制的溶液于每管细菌悬液中,盖紧管口,快速颠倒离心管5次,以混合内容物,留意动作肯定要轻柔缓和，切勿振荡!将离心管放置于冰上(2min)。7. 加1

4、50l用冰预冷的溶液III,盖紧管口,反复颠倒数次,使溶液在粘稠的细菌裂解物中分散均匀,之后将管置于冰上35min。8. 4 以12000rpm离心5 min,将上清液（400 l ）转移到另一离心管中。9. 加等体积的氯仿：异戊醇（24：1）振荡混匀。 4 以12000rpm离心5min，将上清液（300 l ）转移到另一离心管中。10. 加2/3体积的异丙醇沉淀质粒DNA,振荡混匀,于冰上放置15min。11.4 以12000rpm离心5min。当心吸去上清液，将离心管倒置于纸巾上，以使全部液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。12. 加1ml 70乙醇溶液洗涤沉淀，振荡混匀, 4 12000

5、rpm离心5min。弃去上清液，在空气中使DNA沉淀干燥（约5-10分钟）。13. 用20l灭菌的蒸馏水溶解DNA,加1l胰RNA酶37 消化RNA 30min。14. 用1%的琼脂糖凝胶电泳检测质粒的提取状况。五、试验结果我组为第7组，由电泳图谱可以看出，电泳得到3个条带，条带较为清楚。最前面的一条带为超螺旋的质粒DNA（分子量2000bp），中间的条带为两条链均发生断裂而形成的线形DNA；最慢的条带为一条链发生断裂的开环质粒DNA。六、思考题1. 试述在提取质粒过程中溶液I、II、III的作用是什么?（1）溶液：Tris·HCl(pH8.0)25mmol/L,EDTA(pH8.0

6、)10mmol/L,葡萄糖50mmol/L；主要作用是使细菌悬浮，此外EDTA 可抑制DNase的活性。(2) 溶液(新颖配制) ：NaOH 0.2mol/L,SDS 1%(W/V)；碱会使细胞壁裂开，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA排放到上清中；在裂解过程中，细菌蛋白质、裂开的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，可被SDS包盖。(3) 溶液(100ml)：5mol/L乙酸钾60ml,冰乙酸11.5ml(pH4.8),水28.5ml；K+置换了SDS中的Na+，得到PDS（十二烷基磺酸钾），这些复合物可以从溶液中有效地沉淀下来，经离心除去。2. 描述质粒DNA的电泳图谱，并解释产生的现象及可能的缘由？试验中得到的质粒DNA电泳图谱显示共有三条带，其中：最快的一条带是超螺旋的质粒DNA；中间的是线