生物技术综合实验自编教材1

1、生物技术综合实验指导生物技术综合实验化学与生命科学学院刘杰凤 王 颖 马 超 董宏坡 尹爱国合编2010年8月引 言随着生物技术的发展，生物工程的专业技术人员的需求更为迫切，特别是生物技术已经渗透到各个行业，并已蓬勃发展。生物技术的发展不但要有深厚的理论基础，而且要求专业技术人员具有较强的动手能力，因为该学科是一门实践性较强的科学。在培养生物技术专业学生时要特别注意学生实验能力的培养，尤其是专业基本操作。本专业学生的实验课程已经包括生物化学实验、微生物实验、基因工程实验、细胞工程实验和发酵工程实验等课程实验。这些实验为培养学生的基础操作能力、提高学生的实际动手能力等奠定了良好的基础，但是这些实

2、验都是单个的小实验，各个实验各自为一体，没有系统地相互关联，学生完成实验后没有一个完整的概念。本实验以基因工程、细胞工程和发酵工程实验为基础，组成了生物工程中上游、中游和下游技术。其中每一个部分放弃了原来单独小实验的结构，而改为一个独立的大实验，增加了学生的设计性和主动性。这些实验既注重和加强了原来各自的实验内容，又注意到相互联系。本讲义分为三个部分，第一部分“DNA重组技术与基因检测芯片技术”；第二部分“动物细胞培养及细胞活性检测技术”；第三部分“发酵工程及分离提取技术”。这些实验采取大实验方法，使学生有一个完整的操作过程，对理解生物工程的上游、中游和下游技术有了感性认识。目录第一部分分子生

3、物学与基因工程实验1实验一质粒的制备1实验二 DNA的琼脂糖凝胶电泳2实验三外源DNA片段在质粒载体中的克隆3实验四感受态细胞的制备5实验五质粒的转化及转化子的鉴定7（一）、热激法转化7（二）、电转化法7实验六植物总DNA的快速少量抽提9（一）、SDS提取法9（二）、CTAB提取法10实验七总DNA质量检测及酶切10实验八 PCR技术11第二部分蛋白质的分离、纯化13动物肝脏过氧化氢酶的提取分离纯化13动物血中超氧化物歧化酶的提取与纯化15实验一紫外分光光度法测定蛋白质含量20实验二考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量22实验三过氧化氢酶活力的测定24实验四离子交换柱层析法分离纯化蛋白质2

4、6实验五 SDS-PAGE电泳测定蛋白质分子量29附录33附录一试剂配方33附录二硫酸铵饱和度常用表36附录三常用缓冲溶液的配制38参考文献39第一部分分子生物学与基因工程实验实验一 质粒的制备质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。一、 实验目的掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。二、实验材料含有质粒pUC18载体的大肠杆菌菌液，克隆有水稻外源片段的BAC的大肠杆

5、菌菌液。三、实验原理在pH 12.0 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。四、实验步骤1. 取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LA培养基上37过夜培养；2. 用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有Amp抗生素的LB培养基中，37摇床250 r/min过夜培养

6、；3. 吸取1.5 ml菌液，12000 g离心2min，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净；4. 加入300l溶液 I振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）；5. 加入300l溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5min；6. 加入300l溶液III颠倒混匀，放置于冰上10min，使杂质充分沉淀；7. 12000 g离心10分钟；8. 吸取800 l上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5min；9. 12000 g常温离心15min；10. 倒尽上清，加75乙

7、醇浸洗除盐（放置片刻或离心3min后倒去上清）；11. 室温放置或超净台上风干DNA；12. 加40l灭菌超纯水或TE溶解；13. 质粒、BAC的质量检测，于-20保存。五、备注质粒检测：电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型。吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.71.9之间，说明质粒质量较好，1.8为最佳，低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染。实验二 DNA的琼脂糖凝胶电泳带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物

8、大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。一、 实验目的掌握琼脂糖凝胶电泳的原理，学习琼脂糖凝胶电泳的操作。二、实验材料质粒DNA、BAC、植物总DNA或它们的酶切产物。三、实验原理在pH值为8.08.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。四、实验步骤1用胶带将洗净、干燥的制胶板的

9、两端封好，水平放置在工作台上；2调整好梳子的高度；3称取0.24 g琼脂糖于30 ml 0.5×TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至45-50ºC时倒入制胶板中；4凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带；5将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中；pUC18 5l + ddH2O 3l + 溴酚蓝2l 共10l于0.5ml tube中混合后点样；6将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动；7电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5g/ml的溴化乙锭（EB）溶液中染色1015 min，清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果，并照相记录。

10、五、附注1影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：(1) DNA分子大小迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子大小相等，电荷基本相等（DNA结构重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋>线性DNA）(2) 琼脂糖浓度：logU=logU0 Kr胶浓度，U为迁移率，U0为DNA的自由电泳迁移率，为胶浓度，Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNAAgarose：0.5%： 1-30 kb；0.7%： 0.8-12 kb1.2%： 0.4-7 kb；1.5%： 0.2-3 kb.(3) DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA&g

11、t;单链开环。当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。(4) 所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm(5) 碱基组成与温度：一般影响不大4 -30 (6) 嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加在电泳液中)(7) 电泳缓冲液（0.5×TBE）的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0）。2溴化乙锭（

12、EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。3电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（Bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（Xylene cyanol, Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。实验三外源DNA片段在质粒载体中的克隆DNA重组技术包括载体及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的获得及纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。DNA片段的克隆技术是分子操作的核心部分。一、 实验目的学习DNA的酶切、纯化及外源片段与载体的连接，将BAC克隆所携带的外源DNA酶切片段亚克隆到pUC18载体上。二、实

13、验材料外源片段来自一个含有水稻DNA片段的BAC克隆的酶切片段；克隆载体为PUC18。三、实验原理限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平端的外源片段，经DNA的纯化处理后用于连接反应；选择克隆载体pUC18多克隆位点上相应的限制性内切酶切割，并用碱性磷酸酶处理防止载体自连；在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。四、实验步骤1载体pUC18和外源DNA片段的限制性酶切：（50 l反应体系，用1.5ml tube，冰上操作）：DNA 30lR.E 1l10×buffer 5lddH2O14l37反应1hr，分别取8l外源片段酶切产物和5l PUC18

14、酶切产物于1.0%凝胶检测酶切是否完全；按25步纯化、回收DNA2加入ddH2O 150l（扩大体积），加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），颠倒混匀，12000g离心10 min；3吸取上清，加1/10体积3M NaAc和两倍体积无水乙醇，-20放置15分钟以上；412000g4冷冻离心15分钟；5倒去上清，用75乙醇浸洗沉淀，风干后外源DNA溶于10l ddH2O（0.5ml tube中），PUC18溶于20l ddH2O（1.5ml tube中）；6按以下反应去除载体PUC18的5磷酸基团，50反应30 min以上DNA 20lCIAP（TaKaRa）0.5l10 × buffe

15、r 4.0lddH2O 15.5l770水浴10 min, 使CIAP失活；8按25步纯化载体，溶于10 l ddH2O；9连接反应（15l体系）：DNA 10lpUC18 2.5l5 × buffer 1.5lT4 ligase (3U/l) 1.0l16水浴过夜10转化大肠杆菌感受态细胞11转化子的鉴定五、备注1. 根据试验目的和外源片段的不同可选用不同的载体，采用不同粘性末端的双酶切可实现外源片段的定向克隆。2. 克隆中用到的几种工具酶：（1）限制性内切酶限制性内切酶的一个活性单位（1U）：指在50 l反应体系中，37下，经过1小时的反应将1g DNA完全切割所需要的酶量。限制

16、性内切酶的star活性：限制酶在某些条件下使用时对DNA切割的位点特异性可能降低，即可以切割与原来识别的特定DNA序列不同的碱基序列，这种现象叫限制酶的star活性。它的出现与限制酶、底物DNA以及反应条件有关。（2）碱性磷酸酶细菌碱性磷酸酶（BAP）和牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）都能催化水解DNA、RNA、dNTP和NTP上的5磷酸残基。比较而言，CIAP更常用，因其可在70 10内加热灭活或通过苯酚抽提而变性失活，同时CIAP的活性比BAP的高1020倍。它主要用于：（1）克隆时去除载体的5-P，以防载体自连；（2）在用 Kinase进行5末端标记前，去除DNA的5-P。（3）连接酶体外催

17、化磷酸二酯键的形成可使用两种酶：大肠杆菌连接酶和T4噬菌体连接酶，但几乎在所有的克隆中T4噬菌体连接酶都是首选的酶，因其能在正常的反应条件下能有效的将平端连接起来。3. 氯仿对眼睛、皮肤、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌剂并可损伤肝脏和肾脏，操作时需戴手套、安全镜并在通风橱中进行。苯酚是强腐蚀剂，能引起严重烧伤。操作时应戴手套、安全镜、穿防护服，并在通风橱中进行。实验四感受态细胞的制备体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。为了提高受体菌摄取外源DNA的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和CaCl2法将外

18、源DNA导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl2感受态细胞。一、实验目的学习感受态细胞的制备过程二、实验材料大肠杆菌菌株DH5或DH10B三、实验原理电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。转化效率为1091010 转化子/g DNA；对于热激法，是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106 107转化子/g DNA。四、实验步骤（一）、CaCl2法制备感受态细胞1前夜接种受体菌（DH5或DH10B），挑取单菌落于LB培

19、养基中37摇床培养过夜（约16小时）；2取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；3将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作4吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10min；54下3000 g冷冻离心5min；6弃去上清，加入100l预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20min；74下3000 g冷冻离心5min；8弃去上清，加入100l预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9细胞悬浮液可

20、立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（70）。（二）、电转化法制备大肠杆菌感受态细胞1. 前夜接种受体菌（DH5或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37摇床培养过夜；2. 取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37摇床上剧烈振荡培养至OD6000.6（约2.5-3小时）；3. 将菌液迅速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作4. 吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10min；5. 4下3000g冷冻离心5min；6. 弃去上清，加入1500l 冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；7

21、. 4下3000g冷冻离心5min8. 弃去上清，加入750l 冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9. 4下3000g冷冻离心5min10. 加入20l 冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；11. 立即使用或迅速置于-70ºC超低温保存。五、备注影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项：(1) 细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）；(2) 所有操作均应在无菌条件和冰上进行；(3)

22、 经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；(4) 化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；(5) 所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；(6) 质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA；(7) 一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；实验五质粒的转化及转化子的鉴定质粒的转化是指将质粒或以它为载

23、体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。一、实验目的掌握热激法或电转化法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定方法。二、实验材料外源片段与载体的连接产物；大肠杆菌感受态细胞。三、实验原理（1）热激法：大肠杆菌在0 CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。（2

24、）电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于孔DNA等大分子进入。同时DNA在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。四、实验步骤（一）、热激法转化1制备选择性培养基平板：在融化的250ml LA培养基中250l Amp（100mg/ml），250l X-gal (20mg/ml)，25l IPTG (200mg/ml)，混匀后倒入灭菌培养皿中；2取出3管制备好的感受态细胞，放在冰上融化；3每100l感受态细胞加入约20ng质粒DNA，3管分别加连接产物、标准超螺旋质粒DNA（阳性对照）及不加入任何DNA（阴性对照），用移液器

25、轻轻吸打均匀，在冰上放置30min；4热击：将离心管放置42水浴，热击90秒，注意：勿摇动离心管；5冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置12min；6复苏：每管加400l SOC培养基，在37摇床温和摇动温育45min，使细菌复苏；7布皿：取适当体积均匀涂布于含有IPTG、X-gal、抗生素（Amp）的LA平板；8培养：倒置培养皿，于37培养1216小时即可观察到蓝白相间的菌落（其中白色菌落为含有外源插入片段的转化子，蓝色菌落是载体自连的转化子）（二）、电转化法1制备选择性培养基平板：在融化的250ml LA培养基中250l Amp（100mg/ml），250l X-gal (20mg/ml)，

26、25l IPTG (200mg/ml)，混匀后倒入灭菌培养皿中；2取出制备好的感受态细胞，放在冰上融化；3每管感受态细胞加入1l连接产物，用移液器轻轻吸打均匀，置冰上；4电转化仪选择1800V作为输出电压；5将要转化的混合物加入预冷的1 mm的电转化杯中，立即按下按纽电击；6立即加1ml SOC培养基到转化杯中重悬细胞；7将细胞转入合适的培养管中37ºC培养1小时；8吸取合适体积的菌液涂布已倒好的选择培养基平板；937ºC培养过夜，观察结果。五、备注1利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时，用转化细胞铺平板的密度要低（90mm平板上不得超过105个菌落），同时37培养不应超过20小

27、时，具氨苄青霉素抗性的转化体可将内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围的抗生素，从而导致对氨苄青霉素敏感的卫星菌落的出现。2鉴定转化子中是否含有外源DNA片段常用的方法有：(1) 互补；(2)杂交筛选；(3) 插入失活（一些老质粒如pBR322等）;(4) 小量提取质粒酶切检测、PCR检测实验六植物总DNA的快速少量抽提DNA分子是分子生物学研究的基本材料，依不同的实验目的可采取不同的抽提方法获取数量和质量不等的DNA。一、实验目的了解植物DNA抽提的主要方法，掌握SDS法抽提烟草DNA。掌握CTAB法快速抽提水稻DNA。二、实验材料及试剂烟草叶片，水稻叶片，1.5×CTAB，氯仿

28、/异戊醇(24:1)，95%乙醇或无水乙醇等。三、实验原理植物DNA的抽提常采用两种方法：（1）SDS法：离子去污剂，过程长，纯度高；（2）CTAB法：该方法简便、快速，DNA产量高(纯度稍次，适用于一般分子生物学操作)。 CTAB是一种非离子去污剂，植物材料在CTAB的处理下，结合65°C水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再

29、用7075%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。再经过氯仿/异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离出来。四、实验步骤（一）、SDS提取法1. 取0.1g-0.2g新鲜叶片，置液氮中研磨成粉。2. 将冻粉大致平均分配到两个1.5mL的离心管中，各加入900L提取缓冲液，轻轻搅动，使粉末充分散开。3. 各加入100L 10%SDS，充分混匀，于65水浴中保温10-30min,(间隔摇晃2-3次)。4. 各加入160L 5mol/L乙酸钾，充分混匀，冰浴中放置30min 。5.4下12，000r/min离心15min。6. 上清液转入新离

30、心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）,轻轻颠倒离心管数次，放置3-5min。7. 于4下8，000r/min离心10min 。8. 上清液转入另一离心管中，加入2/3倍体积、-20预冷的异丙醇，混匀，放置30min，观察DNA沉淀生成。9. 于4下8，000r/m离心10min，倾去上清液，将离心管倒置于吸水纸上，控干上清液。10. 用80%的乙醇洗涤沉淀，吹干10-15min。11. 加入100LTE（含20ug/mL的RNase）缓冲液充分溶解(若溶解不好，可置37水浴中保温1hr，促进溶解)。12. 如需纯化，则应进行步骤131613. 加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，放置几mi

31、n后10，000r/min离心5min，重复1次。14. 转移并量出上清液体积，置新离心管中，加入1/5倍体积的3mol/L NaAC，混匀，加入2.5倍体积的无水乙醇，轻缓混匀，室温放置数min。15.10，000r/min离心5-10min,按照9操作，去尽上清液。16. 用80%乙醇洗涤沉淀2-3次，吹干。17. 加入10L TE或ddH2O溶解DNA，备用。（二）、CTAB提取法1. 采集适量幼嫩叶片，用液N2研成粉末，0.4 g装入1.5ml离心管中（-20预冷）。2. 预热1.5×CTAB到95，加1ml到装有叶片粉末的离心管中，混匀（防止冻融）。3. 立即置于65水浴3

32、0min，每5分钟，上下颠倒1次。4. 12000g离心5分钟。5. 吸取上清液约600l，加入等体积（600l）氯仿/异戊醇(24:1)，上下颠倒数次，至下层液相呈深绿色为止。6. 12000g离心5分钟。7. 取450l上清于一新1.5ml离心管，加入1ml 95%乙醇和45l 10M NH4AC），混匀，室温放置10min。8. 12000 g离心10min，去上清，用75% EtOH浸洗沉淀，自然干燥约30 min。9. 加入50l 1/10 TE或无菌水（含20g/RNase），置于4过夜，待DNA溶解后，检测DNA浓度及质量。五、注意事项1尽量取材幼嫩叶片，如太老，酚类物质多，必须

33、用10 mM的-ME处理2研钵预冻，粉末至加CTAB前不要融化324:1的氯仿/异戊醇抽提时动作应轻柔，转移用的枪头最好是剪宽了的4所用试剂必需灭菌手套六、思考题（1）DNA降解的可能原因（2）提高DNA产量的措施实验七总DNA质量检测及酶切一、实验目的了解掌握检测DNA 质量的方法以及DNA定量的方法；了解影响DNA在琼脂糖凝胶中泳动速率的因素；训练DNA的琼脂糖凝胶电泳操作及DNA的限制性内切酶操作。二、实验原理参见实验二；限制性内切酶的特点：见“基因操作原理”。三、实验材料及试剂水稻总DNA或BAC克隆DNA，琼脂糖，限制性内切酶DraI，EcoRI，EcoRV，HindIII 四、实验

34、步骤1取10l DNA于0.8% 凝胶检测；2将DNA调节浓度至300-400 ng/l ；2仔细阅读将所用的任何一种酶产品说明书，熟悉反应条件及酶切的贮存浓度（10U-50U/l）厂家配套试剂；3计算据反应条件所需要的各种试剂准确用量：（0.5 ml tube中）DNA(3-5g) 10l10× buffer reaction 1.5lEnzyme (15 U/l) 0.8l（冰上）ddH2O2.7l混匀，短暂离心；437温浴1-2 hrs (纯DNA) 或10 hrs（粗制DNA）；5加入上样缓冲液终止酶切反应，也可65加热10 min使酶变性失活；6电泳检测酶切效率：每个样品取

35、1/10量用琼脂糖电泳检测，制胶及点样方法同上。五、结果分析1、若水稻DNA呈现均匀连续分布的一片，则酶切效果好，否则需重做；2、DNA被切断：DNA降解，重新提DNA；3、DNA切不动：杂质多（多糖，蛋白质，酚类，有机溶剂等），重新纯化；4、若是BAC克隆DNA，酶切后应出现多条很清晰的不同大小DNA带。六、思考题1、什么是酶星活性？如何避免？2、影响酶切效率的因素？3、EB指示剂原理？实验八 PCR技术聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）是一种体外核酸扩增系统，是分子克隆技术中的常用技术之一。PCR具有反应快速、灵敏、操作简便等优点，已广泛应用于分

36、子生物学的各个领域。一、实验目的掌握PCR原理，学习PCR操作过程二、实验材料转基因水稻叶片总DNA，外源基因的特异引物三、实验原理PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为变性、退火、延伸三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量扩增。四、实验步骤1. 调整模板浓度至10 ng/l；2. 按下列体系配制反应混合液，混匀，加一滴矿物油，离心5秒Template DNA 2 .0l （20 ng）10× buffer2.0 lMgCl2（25mM）1.5 lPrimer F (

37、10M) 0.2 lPrimer R (10M) 0.2 ldNTPs（2mM）2.0 lTaq（5U/l） 0.2 lAdd ddH2O to 20 l3PCR反应循环条件设置：953' 1 cycle 941' 551' 721'30" 35 cycles 728' 1 cycle 4forever 4检测：加2l溴酚蓝，混匀，短暂离心，取15l反应产物点样电泳；5在1%的琼脂糖凝胶上点样电泳；EB染色，紫外观察。五、备注1引物设计应具有特异性，依靠引物设计软件进行引物设计；引物分装成多管，不宜反复冻融多次；2PCR反应的各种成份不能遗漏，

38、操作应戴手套，冰上操作；3根据引物的Tm值和扩增片段长度以及PCR仪的特性来设定PCR循环条件；4注意分析电泳检测PCR产物时出现拖带或非特异性扩增带、无DNA带或DNA带很弱的可能原因。第二部分 蛋白质的分离、纯化动物肝脏过氧化氢酶的提取分离纯化一、实验目的1、学习和掌握从动物细胞中提取蛋白质的方法及其原理。2、学习和掌握用紫外分光光度计测定酶活的原理及方法。3、学习和掌握离子交换层析法的基本原理和层析分析蛋白质的实验操作方法。4、学习和掌握SDS凝胶电泳的原理和操作方法，学会利用SDS凝胶电泳来鉴定蛋白质的纯度和测定蛋白质的相对分子量。二、实验原理过氧化氢酶是一种可溶性蛋白酶，广泛存在于动

39、植物和微生物细胞中，哺乳动物的肝与红细胞含量较高。过氧化氢酶是一种含铁卟啉的酶，该酶能催化过氧化氢分解成氧和水，对减轻机体活性氧损伤具有一定的意义。本实验以鸡肝为材料，学习从动物细胞中提取酶的方法和技术。首先从鸡肝中提取可溶性的蛋白质，并测定其蛋白质的含量和过氧化氢酶的活力；然后采用硫酸铵分级盐析、DEAE纤维素梯度洗脱来分离纯化过氧化氢酶；分部收集洗脱组分，并测定过氧化氢酶活力，将酶活力高的组分合并；最后采用SDS-凝胶电泳鉴定过氧化氢酶的纯度和测定其分子量。三、主要仪器、材料和试剂主要仪器：紫外分光光度计、冷冻离心机、超声波破碎仪材料及试剂：鸡、样品提取缓冲液：称取Tris 0.606g，

40、KCl 0.746g，甘油20.00g，加双蒸水到总体积100ml，用HCl调pH至7.1。硫酸铵。其余见相关实验。四、实验内容1、肝脏研磨液的制取取新鲜的肝脏(如猪肝、鸡肝、兔肝等)去掉其中非肝细胞部分(如大血管、胆、脂肪等)，用刀切成小块，冷冻至4以下，放在多功能豆浆机内搅成糊状，制成肝脏研磨液。2、水浸提法提取过氧化氢酶按研磨液与水的体积比为1:5计算，加入相应体积的蒸馏水浸提，浸提温度为25，浸提时间为5 h左右。4下以10000r/min离心20 min，得上清液备用。3、将浸提液分为3份：一份用于测总蛋白含量及过氧化氢酶活性：一份保存冰箱中用于最后SDS-PAGE电泳；另取一份用于

41、盐析、透析等。4、过氧化氢酶粗酶液的盐析及透析先测量提取液的总体积，根据附录后的硫酸铵饱和度的常用表计算需加的硫酸铵的量（一般用0的表）。（1）将硫酸铵研磨成粉末加入粗酶液中，使达40%饱和度（使大部分杂蛋白沉淀），在电磁搅拌器上边搅拌边加入，然后置冰箱放置12h；注意：加硫酸铵时要缓慢，以避免造成局部浓度过高。（2）12000 r/min冷冻离心20min。收集上清液S1（取部分上清液测总蛋白及酶活性），上清液中再加入硫酸铵使达80%饱和度，12000r/min冷冻离心20min，收集上清液S2（取部分上清测总蛋白及酶活性）。注：蛋白含量测定见实验1或2，酶活力测定见实验3）。（3）将第二次

42、离心的沉淀复溶于1/20原始体积的缓冲液中，装入透析袋中，用大量的此缓冲液在冰箱中进行透析过夜（4），其间更换缓冲溶液约3-4次，直至无白色沉淀析出为止（用BaCl2溶液检查）。透析完毕后，将提取液保存于冰箱中备用，取部分测酶比活性，也可留部分在最后进行SDS电泳。注：透析袋一般采用赛璐璐和赛璐璐酚等材料做成，使用前需处理，以消除附着的重金属、蛋白水解酶和核酸酶。处理时，将透析袋放入0.5mol/l的EDTA溶液中煮半个小时，弃去溶液，换上水，再煮几次，贮存在含0.01%的NaN3水中（4）。使用时，只能用镊子或戴手套操作。5、透析后的过氧化氢酶采用DEAE离子交换层析纯化（见实验4）。采用分

43、步洗脱法洗脱，即先用洗脱液A洗脱1个柱体积（收集在一个试管中），流速约0.5ml/min；然后用洗脱液B中a-f的6个梯度分别洗脱一个柱体积，分别收集，流速约0.5ml/min；如下图。蛋白质分步洗脱曲线收集各个洗脱组分，测定每个组分的过氧化氢酶含量及酶活力，将活力较高的洗脱组分进行SDS凝胶电泳。注：洗脱液A用磷酸盐缓冲液（0.1mol/l, pH7.0）洗脱液B用0.05-0.5mol/L的NaCl, 磷酸盐缓冲液（0.1mol/l, pH7.4）：须配制a-f的6种磷酸盐缓冲液（0.1mol/l, pH7.4）各2倍柱体积，其中a-f的NaCl浓度分别为mol/l、b.0.1mol/l、

44、c.0.2mol/l、d.0.3mol/l、e.0.4mol/l、f.0.5mol/l。6、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白的相对分子量（见实验5）。将上述各步得到的样品（粗酶提取液、盐析后、透析后、层析后）与标准蛋白一起进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。7、结果分析将实验过程中的所得数据填于下表中，并测出纯化后过氧化氢酶的分子量。酶液酶液总体积（ml）蛋白质（mg/ml）酶活性（U/ml）总活性（U）比活性U/(mg.N)回收率（%）纯化倍数粗酶液上清S1上清S2透析后层析后8、实验报告要求撰写3000字左右的实验研究论文，标注参考3篇以上。五、备注比活力 = 每ml样品中过氧化氢酶活力单位数

45、/每ml样品中蛋白的质量纯化倍数 = 各阶段比活力数/粗酶液的比活力回收率 = 各阶段酶的总活力单位/粗酶液中的总活力数动物血中超氧化物歧化酶的提取与纯化一、超氧化物歧化酶的提取 原理 l969年，McCord和Fridovich第一次从牛血中提纯到超氧化物岐化酶。自然界中SOD分布极广，其含量随生物体的不同而不同，即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD的种类和含量也有很大差别。迄今为止人们已从细菌，真菌、原生动物。藻类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到SOD。为拓宽提取SOD的原料，筛选或基因过程开发产SOD量较高的菌株。目前，研究开发最多的资源还是从动物血液、动

46、物组织中制备提纯SOD。 从动物血液材料中制备Cu Zn-SOD纯化工艺分为三个主要步骤： （1）原材料的预处理； （2）粗酶液的制备； （3）离子交换柱层析精制。 国内多采用Mccord和Fridovich法，其主要工艺过程为： 第一步，乙醇-氯仿除去血红蛋白； 第二步，有机溶剂和硫酸铵分级沉淀； 第三步，离子交换柱层析精制。 试剂和器材 1、试剂 3.8%（质量分数）柠檬酸三钠；0.9%（质量分数）氯化钠 ；95%（体积分数）乙醇；氯仿；丙酮 ；pH7.6、2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液 ；DEAE-Sephadex A-50 2、器材 猪血；恒温水浴 ；离心机 ；布

47、氏漏斗；抽滤瓶；烧杯、量筒、搅棒等；透析袋 方法和步骤 1、从猪血中提取SOD （1）分离血球 取新鲜猪血，加入到3.8%柠檬酸三钠抗凝液中，新鲜猪血与抗凝液的比例为3：1，轻轻搅拌均匀，4 000r/min离心20min，收集红血球。 （2）除血红蛋白 红血球用3倍体积生理盐水洗涤，4 000r/min离心20min，重复三次，然后向洗净的红血球加入11.1倍体积去离子水，搅拌溶血30min，再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，静置1h，然后4 000r/min离心20min除去变性血红蛋白沉淀，取清液，过滤，收集滤液（记

48、录体积，测酶活性和蛋白浓度）。 （3）热变性 上清液加热到65，保温10min，然后迅速冷却到室温，3 000r/min离心20min，弃去沉淀物，收集上清液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。 （4）沉淀 清液在盐冰浴中冷却，然后在-5以下的操作温度下，加入1.5倍量预冷丙酮，边加边搅拌均匀，即有白色沉淀产生，静置23min，迅速抽滤，弃去滤液得肉色沉淀。沉淀物用少量蒸馏水溶解，4 000r/min离心20min，除去不溶物，用pH7.6的2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液透析，即得粗SOD溶液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。二、离子交换层析纯化超氧化物歧化酶原理 本实验利

49、用超氧化物歧化酶的解离性质，在一定缓冲液条件下与离子交换纤维素吸附和解吸的能力不同于溶液中杂蛋白，进而除去杂蛋白。实验中选用DE-32离子交换纤维素。 相关原理请参见实验教材中离子交换层析一章。 试剂和器材 1、试剂 DE-32 ；缓冲液：2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4（pH7.6） ；缓冲液：200mmol/L K2HPO4-KH2PO4（pH7.6） 2、器材 层析柱(2.5cm×25cm)；部分收集器 ；梯度洗脱仪；紫外分光光度计；试管、透析袋 方法和步骤 1、DEAE-纤维素的预处理： （1）称取5gDE-32，撒在盛有75mL 0.5mol/L HCl的烧杯

50、中，室温放置30min，不时轻轻搅拌。 （2）将糊状物移入3号砂芯漏斗中，用蒸馏水淋洗。如此重复，每加一次去离子水，浸泡一段时间，再进行抽滤，至洗涤液pH等于4即可（pH试纸试）。 （3）将糊状物移入烧杯中，加入75mL 0.5mol/L NaOH，放置30min，不时轻轻搅拌，弃去上清液，依同法用0.5mol/L NaOH再处理一次。 （4）将交换剂移入3号砂芯漏斗中，反复用去离子水淋洗，直至洗涤液pH为8.0（可用pH试纸测试）。 （5）将DEAE-纤维素浸泡在150mL去离子水中。用0.5mol/L 盐酸把pH调至7.6，滴定可在pH计上进行，须使悬液最终pH在10min内无变化，然后抽

51、滤。 （6）将上述滤块置于100毫升量筒中，加入75mL缓冲液I，慢慢搅混之后，静置20min，用倾斜法除去上清液中细微粒子，如此重复若干次，最后上清液pH与缓冲液I几乎一致。 2、装柱 （1）层析柱用洗涤液洗清洁，柱的下端联接塑料管，装上螺旋夹。关上螺旋夹，柱内装入缓冲液I，微开螺旋夹。让缓冲液缓慢流出，赶走死区及塑料管中的气泡，柱中保留少量缓冲液，关闭螺旋夹。 （2）将基本平衡好的DEAE-纤维素浆液（约有1倍体积的缓冲液I）放在抽滤瓶中减压除尽气泡，然后沿管壁倒人柱中，待沉降至床高约1cm高度时，部分旋松螺旋夹，让溶液缓慢流出去，注意此时的流速要比正常洗脱时的流速慢，陆续加入较多的浆液，

52、直至达到高10cm以上的柱床体积。 3、平衡 当全部交换剂装入柱中后，用上柱起始缓冲液进行平衡。流速可维持在4mL/15min，直至流出液的pH与上柱缓冲液完全相同。（一般要平衡8h以上或过夜。） 4、层析 用毛细吸管小心吸去交换剂上面大部分液体，打开出口使缓冲液恰流到表面，关闭出口。用毛细吸管小心地沿柱壁四周缓缓加入SOD粗酶液，打开出口，使样品溶液进入纤维素内，至几乎露出床面时，柱壁用少量缓冲液小心洗涤23次，然后装入缓冲液，使液面高出创面23 cm左右。 5、洗脱 （1）按图将梯度洗脱器和层析柱连接好。 （2）在洗脱瓶A（贮存器）和洗脱瓶B（混合器）内各装入100mL缓冲液和缓冲液，注意

53、两洗脱瓶，特别是液面应处于同一水平面，同时应排除连接管内气泡。 （3）开动电磁搅拌器开关，调节搅拌速度，以混合器内缓冲液旋转而无明显旋涡为宜。 （4）将两瓶和柱上下连接管道打开，开始收集洗脱流出液，控制流速在1.5mLmin。 收集液测定蛋白质浓度和酶活性。 （5）收集合并具有SOD活性部分的洗脱液，透析浓缩后冷冻干燥即得纯化SOD（淡蓝绿色产品）。 三、超氧化物歧化酶的活性测定SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。离子(O2 -)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会

54、引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2 -)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。 按金属辅基成分的不同可分成3种类型。最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D酶蛋白的分子量约为3.2×104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。 原理 SOD的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。其中化学法应用最