蜈蚣多糖对Hela细胞的增殖抑制作用研究

1、    蜈蚣多糖对Hela细胞的增殖抑制作用研究作者：李兴暖韩雅莉余卫国【摘要】  目的研究蜈蚣多糖对人宫颈癌细胞Hela细胞的抑制作用及作用机制。方法用MTT法检测蜈蚣多糖对Hela细胞生长的抑制作用；流式细胞仪和Annexin V-FITC/PI双荧光染色分别检测蜈蚣多糖对Hela细胞周期及凋亡情况的影响。结果在一定浓度范围内蜈蚣多糖可显著抑制Hela细胞的增殖，改变Hela细胞的细胞周期，使细胞阻滞于G2/M期，并能诱导细胞凋亡。结论蜈蚣多糖可能通过改变Hela细胞的细胞周期，诱导细胞凋亡，从而对Hela细胞的增殖有一定的抑制作

2、用。 【关键词】  蜈蚣多糖；细胞周期；细胞凋亡Abstract:ObjectiveTo investigate the inhibitory effects of polysaccharide from Scolopendra subspinipes mutilans (PSSM) on Hela cells and its mechanism. MethodsMTT assay was used to test the effect of growth inhibition on Hela cells. Cell cycle and cell apopotsis wer

3、e detected by flow cytometry and AnnexinV-FITC/PI fluorescence staining.ResultsPSSM could obviously inhibit the proliferation of Hela cells at specific concentration range, change the cell cycle of Hela cells and block Hela cells at G2/M phase, and induce cell apoptosis.ConclusionPSSM can inhibit th

4、e growth of Hela cells by changing cell cycle and inducing apoptosis.Key words:Polysaccharide from Scolopendra subspinipes mutilans; Cell cycle; Cell apoptosis少棘蜈蚣Scolopendra subspinipes mutilans L. Koch又名百足, 属节肢动物门，多足纲，唇足目，螟蚣科动物，为 中国 药典记载的正品药材，为我国传统的镇痉、通络类药物。祖国医学记载和临床实践均已证明其具有镇静熄风、通络止痛、解毒散结等药用功效1。

5、现代 药理实验也证明了蜈蚣具有抗肿瘤和抗动脉粥样硬化等作用2,3，临床用于 治疗 肿瘤以及心脑血管病等症。传统中药均以整虫入药，但蜈蚣体内成分复杂，且有效成分尚不明了，无法对其药理作用做进一步研究。为了探讨蜈蚣抗肿瘤作用，本文以少棘蜈蚣为原料，对其体内多糖进行了分离纯化，并进一步对其进行了Hela细胞增殖的作用的研究，为进一步探索蜈蚣抑瘤作用机制奠定基础。 1 材料 1.1 材料少棘蜈蚣Scolopendra subspinipes mutilans L. Koch购自汕头市恒青药店，由广东 工业 大学生药研究室对其进行种类鉴定。人宫颈癌Hela细胞，由汕头大学医学院分子病理实验室提供，微血管

6、内皮细胞MVEC，由汕头大学多学科研究中心提供。1.2 试剂与仪器DEAE-52为 Whantman 公司产品；1640培养基、胰蛋白酶、噻唑兰（MTT）、碘化丙啶（PI）均购自Sigma公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司；新生牛血清购自杭州四季青生物有限公司。Thermo Labsystems酶标仪（Thermo公司）；Shel Lab二氧化碳培养箱； EpicsXL 流式细胞仪（Backman Coulter公司）；倒置显微镜、荧光显微镜（Olympus公司）；Nikon Coolpix 4500数码相机。 2 方法 2.1 蜈蚣多糖(pol

7、ysaccharides from Scolopendra subspinipes mutilans L. Koch, SSP)的制备少棘蜈蚣87 g 研钵磨碎，加入1 000 ml蒸馏水90恒温水浴搅拌4 h，过滤，残渣加入500 ml蒸馏水，重复上述步骤，过滤，合并滤液，浓缩滤液。取上清液，加5倍体积95乙醇4静置过夜，离心，去上清液，沉淀用少许蒸馏水溶解。Sevag法去蛋白数次4，将去蛋白溶液透析干燥，过DEAE-52离子交换纤维素色谱柱，以0.05，0.1，0.2，0.4和1 mol·L-1 NaCl 进行阶段洗脱，共得到3个糖峰，其中浓度0.05 mol·L-1的

8、NaCl洗脱峰糖含量最高，收集此组分透析干燥，待用。2.2 Hela和人微血管内皮细胞 ( Human microvascular endothelial cell,MVEC) 的培养取对数生长期的Hela和MVEC细胞接种于含10小牛血清的1640培养基中，接种浓度为5×105 个/ml，置37，5CO2 浓度，饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养24 h。去原培养基，加入含有SSP浓度分别为0，0.5，1，1.5，2，4 g/ml的维持液（含1.5小牛血清的1640培养基），置培养箱中继续培养24 h和48 h后进行实验。2.3 蜈蚣多糖（SSP）对Hela细胞增殖的影响取对数生长期H

9、ela细胞按上述方法接种于96孔板中，贴壁培养24 h，去原培养基，加入含有0.5，1，1.5，2，4 g/ml SSP维持液，总体积为200 l，分别培养24，48 h后取出，每孔加入MTT 20 l继续孵育4 h，吸去上清，加入200 l二甲基亚砜，振荡15 min，酶标仪检测570 nm波长下各孔吸光值（A），按下列公式 计算 细胞增殖抑制率。细胞增殖的抑制率（%）（1实验组A值/对照组A值）×100取MVEC细胞作为正常细胞对照，实验方法同上。2.4 蜈蚣多糖（SSP）对Hela细胞周期的影响取对数生长期Hela细胞，接种到50 ml培养瓶中，按上述方法培养，贴壁培养24 h后取出，加入含有SSP浓度分别为0.5，1，1.5 g/ml 维持液中，培养24，48 h后常规消化收集细胞，用PBS清洗3次，加入70预冷乙醇4固定过夜，离心去乙醇，用PBS清洗两次， R NaseA（50 g/ml）37 消化30 min，PI染色后上机检测细胞周期变化5。2.5 蜈蚣多糖对（SSP）Hela细胞凋亡的影响将盖玻片切成4块，加入12孔板中，取100 l 5×104个/ml的细胞悬液加到玻片上，4 h后待细胞贴壁后再加入900 l培养基，继续贴壁培养20 h。去掉原培养液，用PBS清洗3次后，加入含0.5，1，1.