微流控芯片论文

1、微流控芯片中的分离与富集姓名：邹振 学号：S10222012 专业：生物医学工程（湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室，长沙，410082）摘要 本文综述了微流控芯片中的分离与富集的方法。这些技术的发展也为试样前处理的进一步发展提供了新的机遇。与常规分离技术相比，微流控芯片分离技术由于具有较大的比界面面积和较短的扩散距离，因而系统具有较高的分离效率和较快的分析速度。而最近一些基于场效应的微流控分离富集分析系统的建立，更为微流控芯片中的分离与富集提供了新的理论基础和应用应用价值。关键词 微流控芯片 分离 富集 多相层流 场效应自1990年由瑞士的Manz和widme提出微全分析系统1的概念

2、以来，微流控分析技术到现在十几年的时间里己经取得了极大的发展。“微全分析系统”或“芯片实验室”是指通过化学分析设备的微型化与集成化，最大限度地将分析实验室的功能转移到便携设备中，甚至集成于方寸大小的芯片上。这就对试样的前处理步骤提出了较高的要求，需要对微量的试样自动完成检测前的前处理操作，如混合2、反应3、分离(如液-液萃取4-7、固相萃取8-9、过滤10和渗析11等)、浓集、稀释等。微流控技术的发展也为试样前处理的进一步发展提供了新的机遇。在微系统通道中，出现一系列不同于宏观体系的尺度效应，如微通道中表面张力的影响远大于重力因素，基于扩散的传质效应显著等，在微通道内流体总是表现为稳定的层流状

3、态，以及较短的扩散距离和扩散时间。这些不同于宏观体系的特点，导致了许多不同于常规方法的微流控无膜分离技术的产生，如无膜液-液萃取和无膜多相层流分离技术。与常规分离技术相比，微流控芯片分离技术由于具有较大的比界面面积和较短的扩散距离，因而系统具有较高的分离效率和较快的分析速度。1.微流控芯片的多相层流无膜扩散分离1.1多相层流扩散芯片构型利用多层流不但可以实现小分子、离子与大分子、微粒之间的分离，若采用适当的检测方式，还可以在分离的同时直接进行检测。Yager5等提出了H-过滤系统和T-传感器两种系统，前者用于试样的进化、提取，后者在试样的进化、提取同时进行反应及测定。另外还有“Y”型12,以及

4、复杂的网络型13-15、二维通道16-17、三维通道18等。图1为H-过滤系统，由试样流和接受流组成，在重力或微注射泵的推动下，接受液和试样液分别从各自的进样口进入并会合于主通道，以肩并肩生物方式平行流过主通道。由于小分子扩散快，大分子和微粒扩散慢，因此，在一定时间内只有小分子物质可以扩散进入接受液（被接受液提取），最后可分别在流出口处收集含提取物的接受液和除去提取物后的试样液。图1. H-过滤系统如图2（a）所示，在T-传感器5中，试样液和试剂溶液(如酸碱指示剂19、荧光标记试剂20、抗体21-25等)在重力或微注射泵的推动下，从各自的进样口进入并会合于主通道，以肩并肩生物方式平行流过主通道

5、。由于小分子扩散快，大分子和微粒扩散慢，试样中的待测组分如H离子，钠离子等小分子，快速进入试剂相并在界面发生反应，利用两相界面间试剂颜色的变化等，可定量测定待测组分的含量。（a） （b）图2.（a）T-传感器;（b）用于细胞裂解和胞内成分分析的芯片1.2多相层流无膜分离技术的特点（1）利用多相层流内物质间扩散速度的差异，实现小分子、离子与大分子、微粒的分离，因此对于混浊液和复杂试样如血，可不必进行离心、过滤等预分离而直接进行检测;（2）检测反应可在扩散的界面进行，也可在多相层流分离的下游通道内进行;（3）多相层流间的扩散可给出关于流速、试样粘度、试样浓度、分子量等信息，据此可建立测定试样中待测

6、组分的浓度、扩散系数、分子量和流体粘度的分析方法;（4）可实现多相层流操作的多路并行分离分析，在单一通道中分离分析两个或两个以上的不同试样。也用参比液与试样液平行地在同一通道中流过，实现实时自参比，消除由于流体、几何形状、温度、检测器光源等变化而引起的误差。（5）层流扩散主通道既是分离通道又是检测通道，在流体流动方向的不同位置测得的信号强度可提供有关反应动力学的信息.。2.微流控芯片中的液-液萃取分离液一液萃取又称溶剂萃取，是利用物质在互不相溶的两相中分配比不同而达到分离的目的。在宏观体系中，液一液萃取通常是将有机溶剂(即萃取剂)和含有待分离组分的试样水溶液振荡混合，使两相充分接触，试样中的分

7、析物就会在两相之间进行分配。分配达到平衡后，利用两相密度差异将有机相与水相分层分离。通常把物质从水相进入有机相的过程称为萃取，而相反的过程称为反萃取。萃取分离法的优点是分离效果好;通过多次萃取，可以达到很高的回收率;萃取所需设备简单，操作简便，适用范围广。它不仅适用于常量组分的分离，也适用于微量组分的分离浓集;不仅适用于实验室少量试样的分离，而且适用于工业生产中大量物质的分离和纯化。萃取分离法的缺点是采用手工操作时，工作量较大;试剂用量大;所采用的溶剂往往是易燃、易挥发和有一定毒性的物质，这对操作者和实验室的安全是不利的;且通常有机溶剂价格较高，因此在应用上受到一定限制。另外，经过剧烈振荡易导

8、致乳化现象，使分相困难。一般需采用增大有机溶剂的用量，加入电解质，改变溶液酸度，避免剧烈振荡等方法，来降低或消除乳化现象。Kitamaori7等在Yager等多相层流无膜扩散分离技术的基础上建立了芯片上的微流控液液萃取分离系统。虽然微流控液液萃取分离也是通过层流条件下的分子扩散实现组分的相间转移，但两者的分离原理不同。多相层流无膜扩散分离技术是基于物质扩散速度的不同，实现小分子、离子与大分子、微粒间的分离，液液萃取则是基于物质在互不相溶的两相间分配比的不同而控制溶液中组分的传质。在微流控液液萃取系统中通过对两种互不相溶的溶剂流动相流量的调节，可以在微通道中形成超薄的有机膜，在分离的选择性、速度

9、、富集倍率等方面较单纯水溶液的多相层流无膜扩散分离有明显的优势。在液一液萃取中待测物由其中一相转入另一相总是穿过两相间界面完成的。在传统的手工间歇操作中通过激烈振荡形成两相间的高度分散，以尽量扩大两相间的界面面积来提高转移效率。在微米级通道中，两相间有很大的比表面，因此无需机械振荡就可取得很高的萃取效率。Kitamaori5等通过实验研究表明，在微流控芯片中，萃取时间受制于分子扩散速率。影响层流萃取效率的主要因素有: 流速、比表面大小、扩散距离、反应速度等。与常规流动萃取法相比，微流控层流萃取分离因为萃取操作在微米尺度的微通道中进行，因此具有如下独特的优点:1.在微米级通道中两互不相溶的溶剂处

10、于平稳的层流状态，无需相分隔即可保持两相连续的接触，实现相转移，也无需相分离器，即可在线检测；2.微米通道中短距扩散和大的界面/体积比缩短了萃取时间。萃取效率高。在微通道中形成超薄有机膜，溶质扩散时间仅需数秒至数十秒；3.溶剂和试样用量小(l00nL)；4.在同一芯片中可集成萃取、反萃取等多个化学操作单元。如图3所示的芯片中集成了八个化学操作单元，包括:两相的形成、混合和反应、萃取、相分离、三相的形成、共存物的分解、金属离子的除去、鳌合剂的除去等。图3.利用微流控芯片分离检测钴离子的示意图263.微流控芯片中的渗析分离渗析也称透析，主要是用于诸如蛋白质，激素及酶这一类物质的浓缩，脱盐和纯化。分

11、离的基础是离子或小分子从半透膜的一侧液相（供体相）转入另一侧液相（受体相）的迁移率之差。起到区分作用的是选择性薄膜，想转移的推动力是膜两侧中组分的浓度梯度。渗析是一种较缓慢的过程。而在微流控芯片中，渗析所需要的时间会大大减小。除此以外，在微流控芯片中的渗析还有试样消耗量少、污染小、可直接与各类分析仪器联用27-29、在复杂生物试样分析时，有利于减小干扰等优点。图4为“三明治”结构的微流控渗析系统。试样由小管通入，渗析液由大管通入，可以实现小分子和大分子的快速高效分离。图4.“三明治”结构的微流控渗析系统4.微流控芯片中的固相萃取分离富集4.1微流控固相萃取技术的优点和操作过程固相萃取利用选择性

12、吸附与选择性洗脱的分离原理,可实现样品的分离、纯化和富集。利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附,与样品的基体和干扰化合物分离,再选用适当的溶剂冲去杂质,然后用少量溶剂迅速洗脱,从而达到快速分离和富集目标化合物的目的。与宏观体系中固相萃取不同的是,在微流控芯片系统中,由于微体系的缩微化,大大减小了样品及试剂的用量,缩短了萃取所需要的时间,提高了萃取效率。在微流控芯片系统中实现固相萃取,操作过程一般分为4步:(1)活化吸附剂:在萃取样品之前用适当的缓冲液流过吸附剂,使其保持湿润或恢复活性,以便吸附目标化合物;(2)进样:样品通过电驱动或压力驱动等形式流过吸附剂;(3)缓冲液平衡吸附剂: 利用

13、缓冲液将残留在微通道中的试样逐出分析系统;(4)洗脱待测物:用少量溶剂迅速将待测物从吸附剂上洗脱下来,进行后续的分析操作。固相萃取的效能从本质上讲取决于吸附剂的结构和性能。体现为对复杂样品体系分离能力的高低以及获得的富集倍数的大小。4.2微流控芯片系统固相萃取的分类在微流控芯片系统中,按照存在形式的不同,固相萃取可分为开口管吸附剂30、填充柱31和整体柱3种类型。基于开管式吸附剂的制备通常是将固定相以液体状态充入芯片微通道中,含有所需功能团的固定相通过涂渍、键合等方法结合到微通道内壁从而形成开管式固相萃取吸附剂。为了获得性能优异的通道表面以实现对目标分析物高选择性的分离富集, 对各种表面修饰材

14、料的研究成为一个重点。聚硅烷31-34、聚酰胺35、树脂等被广泛用作修饰的材料;将蛋白质36-39、酶等生物分子固定在微通道表面作为固相萃取的吸附剂也是一种新的方法。图5为微流控血液蛋白分离分析系统40。其基本原理就是将一抗固定在微通道表面,当蛋白质通过侧通道进入，就与特异性的蛋白结合，并于通道中的标记有荧光基团的二抗结合。通过成像即可判断血液中蛋白的成分。该方法检测所需血液量只要一滴，并大大缩短了检测时间。图5.微流控血液蛋白分离分析系统利用填充式吸附剂进行分离富集的操作过程为:首先通过微加工技术直接在芯片通道中形成围堰、栅栏、坝等微结构以作为固定相填充床,再将硅胶、微珠等颗粒通过电驱动或压

15、力驱动引入填充床作为固相萃取吸附剂,然后对试样中目标物进行分离富集。与开管式固相萃取相比,填充式固相萃取能获得更大的比表面积,有利于提高对目标物的分离富集效率。Andersson41等提出了用于固定填充剂的微结构设计应满足的要求,即:对流动相有较小的流体阻力;能有效截留杂质微粒;体积应相对集中以便于检测。他们在微流控芯片系统中设计了如图6所示的3种不同形状的过滤器,对三者性能进行了比较后认为,c形填充结构能够获得较小的流体阻力,较高的吸附容量,而不影响检测灵敏度。图6.固定填充剂的微结构示意图整体柱吸附剂是近几年在微流控体系中发展起来的一种新型固相萃取吸附剂,它通过聚合物单体在微通道内发生原位

16、聚合反应而制得,具有结构均匀、可获得较大比表面积的吸附表面等优点(如图7所示)。另外它还具备优异的通透性、高空间利用率、制备过程简单等优点。原位聚合反应制备整体柱避免了在微通道中填充固定相的困难以及高精度的微结构加工技术的需要。图7.芯片上的整体固定相结构图在微流控芯片系统中进行非均相免疫分析是一种非常重要的分析方法。将抗体固定在固体表面,这是在微流控芯片系统中进行非均相免疫分析最关键的步骤。其中,通过在微珠表面固定抗体,再将其填充到芯片的通道中,对抗原进行吸附富集,是一种重要的分离富集方法。常用的微珠有聚苯乙烯微珠、琼脂凝胶微珠及磁性微珠等。图8为微流控蛋白aptamer筛选系统42。其大致

17、原理为先把目标蛋白固定在磁珠上，然后与DNA文库杂交。利用磁场将与蛋白结合的DNA与未结合的DNA分离。图8.微流控蛋白aptamer筛选系统5.微流控芯片中的电泳分离富集微芯片毛细管电泳分离分析的基本原理与常规毛细管电泳相似，但是在平面芯片的微细通道中进行高效、快速的电泳分离分析尤其特殊。毛细管电泳指以高压直流电场为驱动力，以20一200µm内径的毛细管为分离通道，依据样品中各组分的多种特性(电荷、大小、等电点、极性、亲和行为、相分配特性等)为依据的液相微分离技术。在一定的pH条件下，石英毛细管内壁的硅轻基发生电离，带负电荷，从而与电泳缓冲液形成了双电层。在分离过程中采用了高电压，

18、双电层的水和阳离子向着负极方向迁移，由于毛细管极细，在溶液毛细张力的作用下，水合阳离子的迁移会引起管内流体整体朝着负极方向移动，形成电渗流(EOF)。而待分离的离子则根据电荷情况的不同在缓冲液中产生电泳运动。在电泳分离中，还有芯片介电电泳分离和芯片自由流电泳分离两类。芯片介电电泳分离是利用任何材料都有都有一定的介电特性，在外加电场的作用下，会受到一定的极化，如果外加电场的空间分布不均匀，这些被极化了的微粒就会受到一定的进净力，即介电泳力4349，而造成不同程度的漂移运动，从而达到分离的目的。图9.介电泳的基本原理及微流控细胞分离富集系统自由流电泳(free-flow electrophores

19、is,FFE)是20世纪五六十年代提出的一种半制备型分离技术,因其分离条件温和、分离模式多样、连续分离以及无固体支持介质等特点,得到人们的广泛关注。自由流电泳的基本原理是:在上下两块平行板之间构成的一个薄的矩形分离腔室中,待分析样品通过载体电解质溶液向前流动,在流体垂直方向施加分离电压,随着时间的推移,带电荷样品根据其电荷不同,在分离腔室中形成数个分散区带,在装置出口处收集得以分离。6.微流控芯片中的其它分离富集方法6.1基于外场效应的分离近年来，基于场效应发展起来的微流控分离富集技术越来越多。图10（a）是利用场效应分离的基本原理示意图。如图所示，不同的粒子在电场49、磁场4244-46、声

20、场47-49、光场50-52等外加场的条件下，它们的受力等发生变化，使运动轨迹发生改变。从而达到分离的目的。（a）（b） （c）（d） （e）图10.基于场效应的微流控分析系统。（a）场效应分离总示意图（b）基于磁场分离不同的磁性微粒；（c）利用不同粒子在超声情况下的扩散不同实现粒子的分离；（d）基于光场分离不同的光敏性微粒；（d）基于电场分离不同的微粒总 结本文介绍了微流控芯片中的分离与富集的基本技术。这些技术的发展也为试样前处理的进一步发展提供了新的机遇。与常规分离技术相比，微流控芯片分离技术由于具有较大的比界面面积和较短的扩散距离，因而系统具有较高的分离效率和较快的分析速度。而最近一些基

21、于场效应的微流控分离富集分析系统的建立，更为微流控芯片中的分离与富集提供了新的理论基础和应用应用价值。参考文献1Manz,A.;Grbaer,N.;Widmer, M.Sens.Actuators B1990,1,244-2482Reyes,D.R.;Iossifidis,D.;Auroux,P.-A.;Manz,A. Anal.Chem. 2002,74 (12), 26232636.3Auroux,P.-A.;Iossifidis,D.;Reyes,D.R.;Manz,A. Anal.Chem. 2002, 74 (12), 26372652.4H.R.Hulett,W.A.Bonner,

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