诺环素对衰老痴呆大鼠脑组织eNOS、iNOS表达的影响

1、诺环素对衰老痴呆大鼠脑组织eNOS、iNOS表达的影响    【摘要】     目的 观察米诺环素(minocycline)对衰老痴呆大鼠学习记忆和脑组织eNOS、iNOS表达的影响，探讨米诺环素对衰老痴呆脑保护作用机制。方法 Wistar大鼠随机分组：假手术组(S组)、痴呆模型组(M组)、米诺环素治疗组(MT组)。酶联免疫吸附法和免疫组织化学法检测大鼠脑组织eNOS、iNOS的含量，行为学检测大鼠记忆学习改变。结果 MT、M组与S组大鼠前后两次跳台实验、水迷宫实验的结果有显著性差异(P0.01)，MT组

2、与M组大鼠前后两次跳台实验、水迷宫实验的检测结果有显著性差异(P0.01)。MT组iNOS表达较M组降低(P0.01),MT组eNOS表达较M组增高(P0.01)；MT组eNOS、iNOS表达较S组增高(P0.01)；M组eNOS、iNOS表达较S组显著增高(P0.01)。结论 米诺环素能降低衰老痴呆大鼠脑组织iNOS、增强eNOS表达抑制氧化应激反应发挥脑保护作用。     【关键词】  痴呆；米诺环素；一氧化氮合酶    第一作者：赵宇(1973)，女，在读博士，主要从事脑血管疾病防治的研究。Effe

3、ct of minocycline on the expressions of eNOS and iNOS in brain of aged dementia ratZHAO Yü，CAI ZhiYou, YAN Yong,  et al.Neurology Department, the First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China    【Abstract】Objective  To investigate the

4、effect of minocycline on the expressions of eNOS and iNOS in brain of aged dementia rat，and study its neuroprotection mechanism for aged dementia. Methods  Wistar rats were randomly divided into sham, aged dementia model and minocycline treatment groups. eNOS and iNOS were measured by immunohis

5、tochemistry and ELISA. Learning memory was measured by praxiology. Results  Shuttle box and morris water maze tests in minocycline treatment and aged model groups were more significantly different than those of sham group (P0.01). Shuttle box and morris water maze tests in minocycline treatment

6、 group were more significantly different than those of  sham groups (P0.01). The expression of iNOS in minocycline treatment group was lower and the expression of eNOS was higher than that of model group (P0.05). The expressions of eNOS, iNOS in minocycline treatment and model groups were highe

7、r than those of sham group (all P0.01). Conclusions  Minocycline can decrease the expression of iNOS and increase the expression of eNOS in aged dementia. Minocycline can play such a neuroprotection role in aged dementia rats by restraining oxidative stress action.    【Key words】

8、Dementia; Minocycline; Nitricoxide synthas一氧化氮合酶(NOS)是催化一氧化氮(NO)生物合成的酶，广泛存在于各种类型的细胞中。内皮源性一氧化氮合酶(eNOS) 可以激活血管平滑肌细胞中的可溶性鸟苷酸环化酶，使胞内cAMP浓度升高，从而起到扩张血管、抑制血小板和白细胞黏附、聚集的作用，发挥神经保护功能1。诱导性一氧化氮合酶(iNOS) 主要分布于巨噬细胞、炎性中性粒细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞、小胶质细胞和星型细胞等，一旦合成就不断地产生NO，直至底物耗尽，过量产生的NO可通过活性氮、氧化应激效应对脑组织造成损害2。米诺环素作为四环素类药物中一种有效

9、的神经细胞保护剂，在抑制神经炎症3、抑制小胶质细胞激活4、抑制基质金属蛋白酶表达5，6、抑制活性氧产物和氧化应激的发生7，8、抑制细胞调亡9过程等发挥脑保护作用。本研究通过观察衰老痴呆大鼠动物模型脑组织eNOS和iNOS的表达，探索NOS在衰老痴呆中的发病机制，并采用米诺环素对衰老痴呆大鼠进行干预，探讨米诺环素对衰老痴呆脑保护作用的机制。1 材料与方法1.1 材料 10 w龄Wistar大鼠48只(雌性，体质量200250 mg，第三军医大学野战外科研究所提供,动物中心许可证号：渝实动设施准第260号)。米诺环素胶囊(100 mg/粒)：中国惠式制药有限公司，生产日期：2006年6月

10、8日，生产批号：06060874。eNOS、iNOS化学检测试剂盒：福建迈新生物技术有限公司；D半乳糖(Dgal)：上海试剂二厂；大鼠跳台和大鼠穿梭箱程序自动控制仪均由重庆市神经病学重点实验室提供。1.2 方法参照文献10，11颈后皮下注射Dgal 120 mg·kg1·d1连续6 w制作衰老痴呆动物模型，分别选取造模2、4、8 w作为观察点(造模成功后大鼠平均生存时间为8 w)。随机原则分为：假手术组(S组，等量生理盐水颈部皮下注射)，2 w(M2)、4 w(M4)、8 w(M8)、米诺环素治疗2 w(MT2)、4 w(MT4)、8 w(MT8)，每组6只。将米诺环素用生

11、理盐水稀释成0.5 mg/ml浓度备用。正常组、M组每天给予等量生理盐水处理；在M组的基础上， MT组于缺血后给予米诺环素50 mg·kg1·d1灌胃。美满霉素的剂量选择参考Stirling等12和Hewlett13的米诺环素神经保护作用机制研究。穿梭箱底部铺以不锈钢电栅，大小为60 cm×16 cm×25 cm，箱顶部装有蜂鸣器。训练时，将大鼠放在箱内任一侧，20 s后出现蜂鸣音，持续15 s，蜂呜5 s后由底部电栅给以电刺激(电流强度1.5 mA)，大鼠受到电刺激后逃到另一端，电击蜂鸣自动停止。记录动物在单独蜂鸣期间逃避的时间(主动逃避时间)和遭受电

12、刺激的时间以及电击的次数。全部动物每天测试1次，每次20个循环，全程训练。Morris水迷宫作为检测实验动物学习记忆水平的重要工具，其测试程序主要包括定位航行实验和空间探索实验两个部分。(1) 定位航行实验：用于测量大鼠获取经验(学习)的能力。实验前1 d下午将大鼠放入水中自由游泳2 min，观察其游泳姿势并使其熟悉实验环境。实验历时4 d，每天上、下午两个时间段，每个时间段训练4次，每次训练随机选择一个入水点，将大鼠面向池壁放入水池，同一次训练所有大鼠入水点相同。记录大鼠找到平台的时间，即潜伏期。(2) 空间探索实验：用于测量大鼠保存经验(记忆)的能力，即大鼠学会寻找平台后，对平台空间位置记

13、忆的能力。在训练的最后时段撤除平台，然后在B象限任选一个入水点将大鼠面向池壁放入水中，观测其在120 s内在各象限的游泳距离及其占总距离的百分比，以及120 s内穿越各象限平台相应位置(即平台在D象限所在的位置)的次数。记录大鼠找到平台的时间(学习潜伏期)，及120s内穿越各象限平台相应位置的次数(记忆潜伏期)，比较各组潜伏期，评价大鼠学习记忆功能。大鼠麻醉后固定于手术台上，快速心脏抽血约5 ml注入试管中，室温下静置2 h后，4离心，3 000 r/min，10 min，取血清。在冰台上迅速分离大鼠一侧的海马，按2.5 ml/g脑质量加入相当体积的冰生理盐水，用匀浆器将组织研磨，然后冰浴下超

14、声波粉碎制成匀浆，4，10 000 r/min离心10 min，取上清液。实验严格按照eNOS、iNOS酶联免疫吸附法说明书步骤进行。用水合氯醛麻醉大鼠，打开胸腔，右心室内取血，分离血清保存，待检备用。取血后立即经升主动脉快速灌注生理盐水，直至右心房流出液清亮为止。然后用4多聚甲醛灌注固定，断头取脑。冠状切取海马及其周围部位脑组织，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片脱蜡、水化，3H2O2室温10 min灭活内源性酶，蒸馏水洗涤3次；滴加正常血清封闭液，室温20 min，甩去余液；不同的切片分别适量加入即用型羊抗大鼠eNOS、iNOS抗体，4湿盒内过夜。滴加生物素化山羊抗鼠IgG，37

15、 20 min；然后滴加链霉亲合素生物素过氧化氢酶复合物37 20 min。除加入正常血清封闭液外，以上各步间均用0.01 mol PBS(pH7.4)充分洗涤。最后用DAB显色，常规脱水、透明、封片。用已知阳性切片作为阳性对照，PBS替代一抗作为阴性对照。实验严格按照eNOS、iNOS说明书步骤进行。1.3 统计学处理 所有数据以x±s表示，全部数据采用SPSS11.0软件包进行统计学处理，同一组内不同时相点的比较采用方差分析，两组之间同一时相点的比较采用t检验。2 结果2.1 水迷宫、穿梭箱实验结果 穿梭箱实验检测显示M组大鼠的电击次数与S组比较显著增加(P0

16、.01)，主动逃避次数显著降低(P0.01)；M组大鼠的学习潜伏期和记忆潜伏期时间显著延长(P0.01)；MT组与M组同时相点比较电击次数显著降低(P0.01)，主动逃避次数显著增高(P0.01)，MT组大鼠的学习潜伏期和记忆潜伏期时间显著延长(P0.01)，M组各组间大鼠行为学的检测结果间差异无显著性(P0.05)，MT组各组间大鼠行为学的检测结果差异也无显著性(P0.05) (表1)。表1  水迷宫、穿梭箱实验结果(略)2.2 iNOS的表达与分析 ELISA法检测iNOS显示M组脑组织内iNOS水平明显增高 (P0.01),经过米诺环素治疗后，iNOS水平显著降低 (

17、P0.01) (表2)。免疫组织化学法OD值与ELISA值具有一致性，模型鼠脑组织内iNOS水平显著增高(P0.01)，经过米诺环素治疗后，iNOS水平显著降低(P0.01)；MT组与M组同时相点比较iNOS表达显著降低(P0.01)；M组各组间结果差异无显著性(P0.05)，MT组各组间检测结果差异无显著性(P0.05)。经过米诺环素治疗后iNOS脑内表达水平显著降低。2.3 各组大鼠脑组织eNOS的表达 ELISA法检测eNOS显示M组脑组织内eNOS水平明显增高 (P0.01)。和iNOS相反，经过米诺环素治疗后，eNOS水平显著增高 (P0.01)(表2)。免疫组织化学法OD

18、值与ELISA值具有一致性，模型鼠脑组织内eNOS水平显著增高 (P0.01)，经过米诺环素治疗后，eNOS水平显著增高 (P0.01)；MT组与M组同时相点比较eNOS表达显著降低(P0.01)；M组各组间结果间差异无显著性(P0.05)，MT组各组间检测结果间差异无显著性(P0.05)。经过米诺环素治疗后eNOS脑内表达水平显著增高。表2  各组iNOS、eNOS表达水平(略)3 讨论    根据衰老的代谢学说，衰老是机体新陈代谢障碍的结果，糖代谢紊乱必然引起心、肝、肾、脑等重要器官代谢异常，最终出现衰老。在一定时间内，连续给动物注射Dgal，使机体

19、细胞内半乳糖浓度增高，在醛糖还原酶的催化下还原成半乳糖醇，后者不能被细胞进一步代谢而堆积在细胞内，影响正常渗透压，导致细胞肿胀和功能障碍，最终引起衰老。另外，Dgal受半乳糖合成酶的作用，代谢过程中产生自由基也可导致机体衰老。Dgal致亚急性动物模型对自由基损伤和免疫指标的变化与人体衰老指标改变规律基本一致，其造成衰老的根本原因也是在代谢过程中形成过量的自由基过氧化反应，所以本实验选择Dgal复制衰老小鼠模型。本实验采用皮下注射Dgal方法建造衰老模型，Morris水迷宫实验和穿梭箱实验进行行为学检查，显示模型组大鼠明显的记忆和学习障碍，认知功能明显下降，表明建模达到衰老痴呆预期目的。通过米诺

20、环素治疗后，治疗组大鼠行为学症状有显著改善，表明米诺环素对衰老痴呆大鼠具有脑保护作用。和Sham组比较eNOS、iNOS表达显著增高，也表明了活性氮产物也参与了衰老痴呆进程。    活性氮介质NO参与了脑缺血后的病理损伤过程。而NOS是NO合成过程中的关键酶。目前已有3种特异的NOS被克隆，根据细胞或组织来源不同分别称为eNOS、nNOS、iNOS。这三种亚型的NOS从功能上可分为两大类。结构型NOS包括nNOS和iNOS，不同的NOS在脑缺血过程中起到不同甚至相反的作用。nNOS和eNOS分布于血管内皮细胞、神经组织和血小板中，在生理条件下，脑组织中eNOS合成

21、量很小，通过扩张血管抑制血小板和白细胞黏附、聚集，发挥神经保护功能1。而nNOS则是神经元和小胶质细胞在缺血急性期，NMDA受体激活Ca2+大量内流时产生的，具有神经毒性作用14。iNOS一旦合成就不断地产生NO，直至底物耗尽。这种过量产生的NO可对缺血组织造成损害2。通过米诺环素治疗后，模型组大鼠不仅行为学症状显著改善，而且iNOS的表达显著降低，eNOS的表达显著增高，表明米诺环素对衰老痴呆学习记忆的提高与抑制衰老痴呆大鼠脑内活性氮的产生、氧化应激途径有关。    本研究发现自由基慢性中毒衰老痴呆模型活性氮产物显著增高，表明了活性氮产物通过氧化应激途径参与了衰

22、老痴呆进程。经过米诺环素治疗后能有效改善痴呆症状，并且可以显著抑制iNOS表达，增强eNOS表达，证实了米诺环素通过抑制活性氮的产生，抑制氧化应激反应，增强自由基清除这一途径发挥脑保护作用。由于本组实验观察时间点少，观察时间短，对美满霉素脑保护作用机制未进行充分研究，其脑保护具体机制和临床应用有待进一步研究。    【参考文献】  1 Nanetti L,Taffi R,Vignini A,et al.Reactive oxygen species plasmatic levels in ischemic strokeJ.Mol Cell Bi

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