分子试验设计

1、分子实验设计绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达张评瑜 2021141241157 田晓震 2021141241097绿色荧光蛋白(gree n fluoresce nt protein，GFP) 是一类存在于 包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。EGFP (Enhanced GFP即增强 型绿色荧光蛋白，它的27k Da的单体由238个氨基酸构成，本身就 是一个生物发光系统，附带有激发后能发射生物荧光的发光色基。其 发光过程不同于其它生物发光组织， 是不需荧光素酶参与的。在紫外 光激发下可发绿色荧光，常用作信号蛋白或报告基因。将目的基因

2、与 EGFP基因插入载体重组表达后，可形成融合蛋白。通过荧光显微镜、 共聚焦显微镜或紫外灯观察，可直接在活细胞中检测其荧光信号，简 易方便地定性检测目的基因的表达，以及进一步研究目的蛋白的定位 与动态过程。实验步骤：目的基因的获取基因表达载体的构建转化一目的基因筛选与鉴定1、质粒DNA的提取及琼脂糖电泳检测1.1质粒DNA的提取方法：碱裂解法原理：pEGFP-N3质粒是一个用于在哺乳动物细胞系中表达EGFP融合蛋白的质粒，它编码了 EGFP蛋白，是野生型绿色荧光蛋白wtGFP经技术改造而成的遗传突变体；pet原核表达质粒是 最有效的原核表达系统之一。目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T

3、7强转录及翻译信号控制；表达由宿主细胞提供的T7RNA 聚合酶诱导。宿主菌带有受lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因，可 以通过IPTG来启动表达。充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于 表达目的蛋白；诱导表达后仅几小时，目的蛋白通常可以占到细胞总 蛋白的50%以上。别离质粒DNA的方法一般包括三个根本步骤：培养细菌使质 粒扩增、收集和裂解细菌、别离和纯化质粒DNA。50mmol/L葡萄糖、 10mmol/ EDTA-Na、25mmol/L Tris-HCl pH8.0分散细胞，其中螯合 金属离子使酶失活，防止 DNA的降解；0.4mol/L NaOH和2% SDS 临用前1:1配制，使细胞裂

4、解，蛋白质与染色体 DNA发生变性； 60ml 5mol/L 醋酸钾、11.5ml冰醋酸、28.5ml双蒸水 使DNA在酸性条件下复性，留 在上清液，大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀。实验用品：仪器：恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台，10、 100、1000 Z微量移液器各一支，台式高速离心机，制冰机，混合漩 涡器。1.1.4.2 材料： 含质粒 pET-28a 和 pEGFP-N3 菌液、.5ml 塑 料离心管、EP管架、微量取液器和取液器吸头、常用玻璃器皿如 三角瓶、量筒、试剂瓶等1.143试剂：LB培养液：胰蛋白胨(Tryptone ) 10g,酵母 提取物(Yeast e

5、xtract ) 5 g , NaCI 5g,琼脂(固体培养基)15g, 用 1N NaOH调 pH 7.5。溶液 I: 50mmol/L 葡萄糖，10mmol/ EDTA-Na 25mmol/L Tris-HCI (pH8.0);溶液 II: 0.4moI/L NaOH , 2% SDS，临用前 1: 1 配制; 溶液皿：5moI/L醋酸钾60ml，冰醋酸11.5ml，双蒸水28.5ml ;卡纳霉素(50mg/mL);抽提液(饱和酚：氯仿：异戊醇=25: 24: 1 );无水乙醇；70%L醇；TE缓冲液或ddH2O步骤：将含pET- 28a质粒的大肠杆菌，含pEGFP-N；质粒的大肠杆菌 分

6、别接种在液体培养基中(加卡那霉素 50卩g/mL), 37C培养过夜。1.1.5.2 取培养菌液1.5mL置Eppendof小管中，10000rpm离心 2min,弃上清液。1.1.5.3 参加100卩L溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置 10 mi n。参加200卩L新配制的溶液I,轻轻翻转 23次，使之混匀， 冰上放置5 min。参加150卩L冰冷的溶液皿，盖紧后，温和颠倒 3-5次使混 匀，产生白色絮状物，冰上放置 15 min 。1.1.5.610000rpm 离心5 min，取上清液于另一干净的离心管中向上清液中参加等体积约400卩L酚：氯仿/异戊醇25:24:1 , v/v ,

7、振荡混匀，lOOOOrpm离心10 min，将上清液转移至新 的离心管中。参加等体积约370卩L氯仿/异戊醇24:1 ,混匀，离心 2min ,取上清液于新离心管中。1.1.5.9 向上清液参加2倍体积无水乙醇，混匀，-20 C放置1h。1.1.5.10 12000rpm离心5 min,倒去上清液，把离心管倒扣在吸水 纸上，吸干液体。力口 800卩L70临醇，12000rpm离心1 min，倒尽上清液， 室温自然枯燥30min。1.1.5.12 力口 30 卩 L ddH20 , -20 C保存备用。考前须知：饱和酚取下层单独吸200 uL氯仿：异戊醇24: 1 吸 200 uL制备质粒过程中

8、，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡特 别是参加溶液II和III ,以防止机械剪切力对DNA的断裂作用。在取各种试剂的过程中，一定注意移液器吸头的更换， 防止污染。1.2琼脂糖电泳检测方法：琼脂糖电泳原理：DNA的琼脂糖凝胶电泳可以别离长度为 200bp至近 50kb的DNA分子。DNA的迁移率U的对数与凝胶浓度T之间存在反平行线性关系。因此，要有效地别离不同大小的DNA片段, 选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA、闭环超螺旋DNA。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA泳动速 度：闭环超螺旋线状开环。但有时也有也会

9、出现相反情况，因为 与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核酸染料含量有关。123实验用品：123.1 材料和仪器电泳仪，电泳槽，样品槽模板梳子，有机玻璃内槽，微波炉，水 平仪，10、100、1000卩L微量取液器各一支，凝胶成像系统，提取 的pET- 28a和pEGFP-N3质粒，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲, 封口膜，剪刀，取液器吸头。试齐IGold view DNA染料；0.5 x TBE缓冲液：Tris 10.88g、硼酸 5.52g、 EDTA Na2- 2H2O 0.74g,定容至200ml，使用时稀释10倍；6x上 样缓冲液：溴酚蓝0.25 %、蔗糖40% DNA marker。

10、步骤：琼脂糖凝胶板的制备称取0.3g琼脂糖，置于锥形瓶中，参加30mL0.5X TBE缓冲液，微波 炉加热直至琼脂糖溶解。待胶液冷却到65C不烫手为宜，参加1卩L Gold view 混匀，排 除气泡,缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽插入样品槽模板梳 子内。静置30min左右，轻轻晃动拔出梳子。1.242力叶羊胶板放入电泳槽中样品孔位于负极，注入0.5 x TBE缓冲液淹没过 胶板5mm用取液器将提取的质粒 DNAW L与1卩L6X上样缓冲液混 匀，参加胶板的样品小槽内。1.2.4.3 电泳将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为 100 V左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约12cm处，

11、停止电泳。1.244观察和拍照将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为254nm的紫外灯下，观察凝胶中 DNA存在处显示出荧光条带。实验结果预测：正常情况下会出现两条条带闭环和开环 质粒。二、基因表达载体的构建1、DNA限制性内切酶酶切1.1方法：DNA限制性酶切1.2原理：生物体内能识别并切割特异的双链 DNA序列的一种内切 核酸酶。由于这种切割作用是在 DNA分子内部进行的，故名限制性SfTUOfl iRTlFlNnji9»jNv啊為I StfT.kjI 102Kho HlMi NDthlMIE-«g l(»Mf Hind mim taKim

12、klMiEnR耳即 BamH R1MiNM h»l i Nd* It時扣 Ndq IitMlXtH L：诡lSSgrA I皿Sph Mi酶切位点:BamHINotlEcaST I|ITF3；- pET«28a(+；53&9bplLAp*l|IXMffiMH 屮却BtsSlihfj：:BspLUU 咐厂、k-91»i Bdiinri TumaP耳沾 IljZZXJIApaL IAse IIB)S/iaB1341)£co01091(3B52)CMVMCS1531-465)4SVTK poly APEGFP-N34.7 kbBsrG I 113$SV&

13、#171;poly A=Not I 11390Xba I* )1408)内切酶简称限制酶。pet原核表达质粒是最有效的原核表达系统之 一。目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体 T7强转录及翻 译信号控制；表达由宿主细胞提供的 T7RNA聚合酶诱导。宿主菌带 有受lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因，可以通过IPTG来启动表达。 充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白； 诱导表达后 仅几小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的 50%以上。Stu II(2S75iAffll 116361Dra III 11S70)MSOItilHI削側叭帥曲 测icWG加脚CTCAih师脚血CT

14、K6 山 ItMGT淞 ffilMcSMCCCGIiklMTCG 池:崗 删脚III蹣II *1 :-Ml fill釧 伽l舰厂巾涮I市I無Ltai师1計刚"I X/ua帥奸kll血I1.3实验用品：材料：实验一提取的质粒 pEGFP-N3和pET-28a , 0.2mlEP管,取液器吸头，一次性手套试剂：Not I, Bam HI, ddHzO, 10>buffer，琼脂糖,Gold view设备：移液器，台式高速离心机，凝胶电泳系统，凝胶成像系统，恒温培养箱1.4步骤：分别去两支0.2mlEP管做上记号：如两个EP管中分别配置以下的30卩体系：号管号管BSA3 a l3 a

15、 l10xBuffer3 a l3 a lNot I2 a l2 a lBam HI2 a l2 a l质粒pET -28a 20 a lpEGFP-T1 20 a l将两只EP管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱 37°C酶切3h取5卩L EP管的酶切反响液，同时取5原质粒溶液作对照，进行电泳检测酶切结果。按照回收试剂盒步骤切胶回收所需酶切产物片段 2、连接重组2.1方法：DNA连接重组2.2原理:连接的DNA分子具备的条件：具有相同粘性末端同种酶切 的片段的DNA分子比拟容易连接在一起，因为相同的粘性末端容 易通过碱基配对氢键形成一个相对稳定的结构。连接反响温度：理论上讲，连接反响的

16、最正确温度是37°C，此时连接酶的活性最高。但37°C粘性末端分子形成的配对结构极不稳定， 因此，人们找到了一个最适温度，即1216°C。此时既可最大限度地 发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构的稳定。本实验选择16°C。2.3实验用品：材料：酶切后的EGFP和pET-28a，0.2mlEP管，取液器吸头,一次性手套2.3.2 试剂：T4DNA 连接酶，ddHzO, T4DNA 连接酶 buffer设备：移液器，台式高速离心机，PCR仪2.4步骤： 在EP管中分别配置以下的体系:0.2mlEP 管10xbuffer2卩l酶切后的pET -28aXa l

17、没切后的EGFP片段丫卩lT4DNA连接酶2 a lX : Y二1 : 310,用水补足20卩。24 EP管中液体混匀后瞬时离心，放入培养箱16°C反响过夜后，-200C下保存用于转化。3. 重组DNA的转化及重组子的鉴定3.1重组DNA分子的转化方法：热转化法原理：细菌处于容易吸收外源 DNA的生理状态叫感受态。 转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA分子导入细菌的 过程。其原理是细菌处于00C，在有CaCl2存在的低渗溶液中，菌细 胞膨胀成球形。转化混合物中的 DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸 复合物粘附于细胞外表，经42°C短时间热击处理，促进细胞吸收DNA

18、 复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过 程中获得的新的表型在本实验中为卡那霉素抗性得到表达。在含 Kana的选择性培养基上进行重组子的鉴定E.coli EH5 a是一种常用于质粒克隆的菌株，可以使质粒高拷贝数扩增，获得大量的质粒实验用品341 材料：重组质粒 pET-28a-EGFP, E.coli DH a 5用品：摇床，玻璃涂布器步骤取出感受态细胞DH5a让其在冰上自然解冻，每200 L 解冻的感受态细胞参加整管连接产物，混匀后冰浴30mi n3.1.5.2 420C热冲击60秒，立即置于冰浴5min。再在感受态细胞混合物中参加 0.8mL的LB培养基，于 37&

19、#176;C摇床中培养1h。3.1.5.4 1h 后，6000r/min 离心 3min，去掉上清约留 200 L 的培养液，摇匀菌块。用玻璃涂布器将溶液均匀涂布在含 Kana的LB固体培 养基上，正置培养皿半小时后，370C培养箱中倒置培养皿过夜。第二天早上观察结果。结果预测由于转入的pET-28a质粒含有卡那霉素的抗性基因，所以能够在含有Kana的培养基上面生长培养基上长出正常的菌落，表示质粒转入成功培养基上形成小菌落，转入的质粒只一直沿着单个细胞 遗传下去3.2重组子的鉴定由于质粒pET-28a和质粒pEGFP-N3相同的酶切位点为BamH I和NotI，两个酶切位点之间并无标记基因，所

20、以即使在选择培养基上表达为阳性，也可能说明转入的为pET-28a质粒，并不能完全确定 为重组质粒，所以需进行重组子的检测原理：利用PCR和双酶切的方法对重组子进行鉴定PCR是在生物体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反响，主要有变性一退火一延伸三个步骤组成：高温变性-94 C下DNA双链解旋为单链；低温退火-55 C左右时，引物与模板DNA单链的互补序列配 对结合温延伸-72 C时，Taq酶以4种dNTP为原料，引物为复制起点，按5'宀方向，复制模板的互补链。按此循环变性一复性一延伸，一般重2530次，短时间 内，使目的基因片段扩增2n n代表循环次数。实验材料3.2.1.2 材料DN

21、A模板，4XdNTP,T7正反引物，Taq酶，琼脂糖，MarkerDNA，吸头试齐I10 buffer, 15 mmol/L MgCI2PCR热循环仪， 琼脂糖凝胶电泳系统322双酶切原理：由于质粒的黏性末端是Not I, Bam HI,两种限制性内切酶切割产生的，载体和目的基因的粘性末端互补配对形成重 组质粒，所以在重组质粒上也存在Not I, Bam HI的酶切位点，在阳性克隆的细菌中提取质粒，双酶切过后对酶切后的产物检验，可以验证是重组质粒是否转化成功。实验材料3.2.2.1.1 试剂 Not I, Bam HI, lOWuffer,设备移液器，台式高速离心机，凝胶电泳系统， 凝胶成像系统322.2步骤3.2.2.2.1 取一只 0.2ml 的 EP 管管中配置以下的体系EP管BSA10 x bufferNot I3卩L2卩L2卩LBam HI重组质粒20卩L32223将EP管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱 37°C酶切3h。32224取5卩LEP管的酶切反响液，同时取5L目的基因溶液 作对照，进行电泳检测酶切结果。32223结果预测32223.1酶切产物中只出现一条带，证明重组质粒转入成功 32223.2酶切产物没有出现条带，证明转化失败3.3减小误差方案由于是直接从平板中挑去菌落，转化后的细菌 细胞壁外会附