自发性高血压大鼠心肌细胞凋亡的变化及其意义

1、    自发性高血压大鼠心肌细胞凋亡的变化及其意义        【摘要】目的探讨心肌细胞凋亡在自发性高血压大鼠(SHR)心脏重塑中的作用及其意义。方法采用末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的带荧光的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)和透射电子显微镜技术,观察不同年龄SHR心肌细胞凋亡的变化及其规律。结果(1)1月龄SHR组无左室肥厚组(NLVH组)和1820月龄SHR组充血性心力衰竭组(CHF组)凋亡的心肌细胞核数目和凋亡指数显著增加（P均0.01)，10月龄SHR组左室肥厚组

2、(LVH组)则显著减少(P均0.01)。(2)有LVH的SHR中,心肌细胞凋亡与LVH呈显著负相关(P0.01)。(3)透射电子显微镜检查发现NLVH组和CHF组SHR左心室心肌组织中可见具有凋亡形态学特征的凋亡心肌细胞(胞质浓缩、胞核染色质浓聚边集)，LVH组和CHF组可见心肌细胞肥大、肌浆网扩张和线粒体增生等改变。结论(1)SHR LVH发生前和出现CHF后其心肌细胞凋亡显著增加；SHR伴显著LVH时其心肌细胞凋亡显著减少。提示心肌细胞凋亡在SHR心脏重塑中起重要作用，心肌细胞凋亡减少可能与LVH有关，而心肌细胞凋亡增多可能与CHF有关。(2)在SHR高血压LVH心力衰竭演进过程中存在心肌

3、细胞凋亡的动态变化，可根据这一过程中心肌细胞凋亡的时间窗选用刺激或抑制心肌细胞凋亡的策略来改善高血压心脏重塑。【关键词】高血压心肌细胞 Changes and significance of cardiac myocyte apoptosis in spontaneously hypertensive ratLI Faqi, CHEN Yunzhen. Department of Cardiology, First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400016【Abstract】ObjectiveTo s

4、tudy the effects and significance of cardiomyocyte apoptosis participating in the cardiac remodeling of spontaneously hypertensive rats (SHR). MethodsWe investigated the dynamic changes of cardiac myocyte apoptosis in left ventricle of SHR and Wistar-Kyoto rats (WKY) using in situ TdT-mediated dUTP

5、nick end labeling (TUNEL) and transmission electron microscope.Results(1)Apoptotic myocyte nuclei and apoptotic index (calculated by dividing the number of apoptotic myocyte nuclei by the total number of myocyte nuclei and multiplying that value by 100) were higher in 1-month-old SHR group no left v

6、entricular hypertrophy (NLVH) group and 18-20-month-old SHR group congestive heart failure (CHF) group than those in age -matched WKY group respectively (all P values less than 0.01). Apoptotic myocyte nuclei and apoptotic index were lower in 10-month-old SHR left ventricular hypertrophy (LVH) group

7、 than those in age-matched WKY group, NLVH group and CHF group (all P values less than 0.01). (2) Apoptotic index was inversely correlated with left ventricular hypertrophic index in SHR with LVH and CHF (n=6, r=-0.90, P<0.01, y=3.24-0.09x; n=5, r=-0.87, P<0.01, y=4.76-0.02x). (3) Electron mic

8、roscopic features of cardiocyte apoptosis (including intact sarcolemma in the presence of cytoplasm compaction and segregation of nuclear chromatin into small sharply delineated electron dense masses that abut the nuclear envelope) were identified in left ventricular tissue obtained from SHR with NL

9、VH group and CHF group but in none of the tissue specimens obtained from the left ventricles of the others. The ultramicrostructural changes, such as cardiac cellular hypertrophy, sarcoplasmic reticulum expansion, mitochondrion hyperplasia, occurred in left ventricular tissue obtained from SHR with

10、LVH group and CHF group.Conclusion(1) Cardiac myocyte apoptosis increases significantly in the left ventricle of SHR with CHF and without LVH. However, cardiomyocyte apoptosis decreases markedly in the left ventricle of SHR with LVH. These findings suggest that cardiac myocyte apoptosis may play a k

11、ey role in the heart remodeling of SHR, and that cardiomyocyte apoptosis decreasing may be bound up with LVH and cardiac myocyte apoptosis increasing may be related with CHF of SHR. (2) The dynamic changes of cardiac cell apoptosis occur in the hypertensionLVHheart failure volving process. It is pos

12、sible that the heart remodeling is ameliorated by the therapeutic strategies of stimulating or suppressing cardiomycoyte apoptosis according to the time window of cardiac cell apoptosis in the above process. 【Key words】hypertensionmyocardiumcells细胞凋亡,又称程序性细胞死亡，是一种与细胞坏死截然不同的由基因调控的主动性非炎症性细胞死亡形式，在许多疾病的

13、发生发展中起重要作用。目前心血管疾病细胞凋亡的研究主要集中在冠心病、心律失常、心肌炎及心肌病方面1，至于细胞凋亡与高血压病及其靶器官损害的研究尚少报道。本研究采用自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHR)为实验模型，观察不同年龄SHR左室肥厚(LVH)前、LVH时和心力衰竭后心肌细胞凋亡的变化情况，揭示心肌细胞凋亡在SHR LVH和心力衰竭发病中的作用、规律及其意义。材料与方法1.实验动物:SHR购自中国医学科学院心血管病研究所实验动物中心；正常Wistar大鼠(Wistar-Kyoto rats, WKY)购自重庆医科大学实验动物中心。2.实

14、验动物分组:(1) 1月龄SHR组(6只，雄性、雌性各3只)， 体重47.452.4 g，无LVH组(NLVH组)。(2) 10月龄SHR组(6只，雄性、雌性各3只)，体重206.7340.0 g，有明显LVH组(LVH组)。(3) 1820月龄SHR组(5只，雄性3只，雌性2只)，体重352.8389.3 g，有显著LVH伴心动过速，呼吸急促，腹腔积液，胸膜心包积液，心房血栓和右室肥厚等充血性心力衰竭(CHF)表现(CHF组)。按年龄和性别配对分别配以WKY组。3.心肌肥厚指数计算:取上述各组大鼠，腹腔内注射10水合氯醛(0.4 ml/100 g)麻醉，直接开胸切取心脏，去除心房，大血管和心

15、包组织(同时注意观察胸腔积液，心包积液和心房血栓)，沿室间隔分离左心室(包括室间隔)和右心室，冰冷生理盐水冲洗干净，清洁滤纸吸干水份后称左心室(含室间隔)湿重和右心室湿重,计算左心室湿重/体重(LVW/BW，mg/g)和右心室湿重/体重(RVW/BW，mg/g),即为左心室心肌肥厚指数和右心室心肌肥厚指数。4.心肌细胞原位末端标记与半定量分析:取左心室游离壁中部心室肌，立即置于4多聚甲醛(pH 7.4)中固定24小时(4 )，常规石蜡包埋，并作心脏横断切片(5 m)。应用改良的末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的带荧光的dUTP缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end l

16、abeling,TUNEL)2原位标记心肌凋亡细胞核中的DNA片断3-OH末端(In Situ Cell Death Detection Kit,POD 购自德国宝灵曼公司)，以DAB显色，苏木素复染，封片后显微观察、摄影。步骤中不加TdT酶者作为阴性对照；正常的心肌组织以DNase(10g/ml)消化诱导DNA链断裂后再按TUNEL法操作者作为阳性对照。光镜下，正常心肌细胞核呈蓝色，而凋亡阳性心肌细胞核呈棕黄色。半定量分析：每只大鼠观察5张切片，每张切片计数5个高倍视野(high power field,HPF,400×)中凋亡阳性心肌细胞核数目及其占总细胞核数目的比例，求其均值。

17、5.心肌细胞超微结构观察:取上述各组大鼠左心室游离壁中部心室心肌标本(约1 mm3大小),立即置于冰冷的4戊二醛(pH 7.2)固定1小时，常规制样用日本产H-600型透射电子显微镜观察(放大倍数50017 000倍)。每只大鼠观察5张切片。6.统计学分析:多组间比较用F检验，多组间两两比较用Newman-Keuls检验，不同变量的相互关系用直线回归分析。实验数据用±s表示。结果1.SHR体重、收缩压、心率、心肌肥厚指数和CHF病理改变情况(表1):1月龄SHR组未见左、右心室肥厚征象，10月龄SHR组有明显的LVH，但不存在右室肥厚的特征，1820月龄SHR组均存在明显的左、右心室

18、肥厚，且同时伴有腹腔、胸腔和心包积液及心房血栓等CHF的特征。另外，10月龄SHR组的收缩压(SBP)显著增高，1820月龄SHR组的SBP和心率(HR)均显著增高。2.不同年龄SHR和WKY心肌细胞凋亡的变化(表2):1月龄SHR组(NLVH组)心肌细胞凋亡显著增加，其凋亡阳性心肌细胞核数目及其占总细胞核数目的百分率(心肌细胞凋亡指数)均显著高于正常对照组（1月龄WKY组，P均0.01）。当SHR发生明显LVH后(10月龄SHR组,LVH组)，心肌细胞凋亡显著减少,其凋亡阳性的心肌细胞核数目和心肌细胞凋亡指数与10月龄WKY组比较,有非常显著的统计学差异(P均0.01)。SHR存在明显的CH

19、F时(1820月龄SHR组,CHF组),心肌细胞凋亡又显著增加，其凋亡阳性心肌细胞核数目和心肌细胞凋亡指数与1820月龄WKY组比较均显著增加(P均0.01)。对不同年龄SHR组间心肌细胞凋亡进行比较，结果显示:1月龄SHR组和1820月龄SHR组凋亡阳性心肌细胞核数目和心肌细胞凋亡指数均显著高于10月龄SHR组(P均0.01)，但1月龄SHR组和1820月龄SHR组间差异无显著性(P均0.05)。对不同年龄WKY组间心肌细胞凋亡进行比较分析，结果显示不同年龄WKY组凋亡阳性心肌细胞核数目和心肌细胞凋亡指数差异均无显著性(1)。1不同月龄组SHR和WKY左心室心肌TUNEL染色,中呈棕黄色染色

20、的心肌细胞核为凋亡阳性的心肌细胞核(×400)注:A:1月龄SHR(NLVH)组,Ac:1月龄WKY组;B:10月龄SHR(LVH)组,Bc:10月龄WHY组;C:1820月龄SHR（CHF）组，Cc：1820月龄WKY组表1实验动物体重、心室肥厚和CHF病理特征(±s)组别动物数BW(g)SBP(mm Hg)HR(beats/min)LVW/BW(mg/g)RVW/BW(mg/g)浆膜腔积液心房血栓WKY组1月龄649.60±4.97-1.59±0.080.40±0.030/60/610月龄6315.73±62.49133.20&#

21、177;4.37352.70±24.291.53±0.280.43±0.080/60/61820月龄5395.12±66.21139.22±7.82380.80±34.881.71±0.270.44±0.060/50/5SHR组1月龄(NLVH)649.93±2.00-1.72±0.080.43±0.030/60/610月龄(LVH)6269.21±63.70206.25±18.54?360.88±34.223.13±0.27*0.68±

22、;0.080/60/61820月龄(CHF)5362.28±23.97165.40±13.50+452.40±69.17*4.07±0.21*1.38±0.035/55/5注：与10月龄WKY组比较，?P<0.01;与10月龄SHR组和1820月龄WKY组比较，*P<0.05；与1820月龄WKY组比较，+P<0.01；与1月龄SHR组比较，P<0.01；与1月龄SHR组和10月龄SHR组比较，P<0.01。1 mm Hg=0.133 kPa 表2不同年龄SHR和WKY心肌细胞凋亡的变化(±s)组别动物数

23、阳性细胞核/HPF阳性细胞核/总细胞核(%)1月龄SHR(NLVH)组6269.70±42.49*38.43±10.73*1月龄WKY组632.83±21.094.12±2.0310月龄SHR(LVH)组616.07±10.83+2.16±1.29+10月龄WKY组641.13±22.855.51±2.251820月龄SHR(CHF)组5282.12±40.1943.93±11.511820月龄WKY组541.40±21.616.05±2.20注：与1月龄WKY组比较，?P&

24、lt;0.01；与1820月龄WKY组比较，P<0.01；与10月龄WKY组比较，+P<0.01；与10月龄SHR组比较，P<0.01 3.SHR心肌细胞凋亡与LVH的关系:对伴有显著LVH的SHR的心肌细胞凋亡指数与左心室心肌肥厚指数进行直线回归分析，结果显示二者间呈显著负相关(n6,r-0.90，P0.01；n5，r-0.87，P0.01)。4.心肌细胞超微结构检查:1月龄WKY、10月龄WKY和1820月龄WKY组心肌细胞的细胞膜、细胞浆、细胞器和细胞核结构均正常。1月龄SHR(NLVH)组和1820月龄SHR(CHF)组可见心肌细胞胞质变深(胞质浓缩)和胞核染色质浓聚

25、边集(核固缩)等心肌细胞凋亡的形态学特征。在凋亡的心肌细胞,可见线粒体明显肿胀且空泡化。 10月龄SHR（LVH）组和1820月龄SHR(CHF)组可见心肌细胞肥大、心肌肌浆网扩张和心肌线粒体增生等改变。10月龄SHR(LVH)组均未见心肌细胞凋亡的形态学特征和心肌细胞线粒体肿胀和空泡化(25)。讨论大鼠长期压力超负荷和增龄对心肌细胞的作用在许多方面与人类高血压病相似，对SHR心肌肥厚和心力衰竭发病机制及其防治的研究必将为探明人类高血压病心肌肥厚和心力衰竭的发病机制及其临床防治措施提供有益的实验依据。本研究以不同年龄SHR为研究对象，显示SHR心肌肥厚和心力衰竭的实验模型是可行的3。心脏是高血

26、压主要的靶器官之一。高血压长期慢性压力超负荷必将引起心脏结构和功能的改变(即心脏重塑)，心脏结构的改变主要为LVH，心脏功能的改变主要为心力衰竭。高血压心脏重塑的机制至今尚未完全阐明，有学者认为主要与心肌细胞机械应力增加和多种神经-体液因素及心血管组织旁分泌自分泌因子的参与有关4。然而,国外最近研究表明，高血压主要靶器官(心、脑、肾)中均存在细胞凋亡现象，推测心肌细胞凋亡可能在高血压心肌肥厚和心力衰竭发病中起重要作用5，为人们从全新的角度来认识高血压、心肌肥厚和心力衰竭的发病机制提供了新的思路。本实验采用TUNEL POD法2检测SHR LVH前、LVH时和CHF后左心室心肌组织石蜡切片中的心

27、肌细胞凋亡情况，结果显示，SHR组LVH前心肌细胞凋亡显著增加， 当发生明显LVH后心肌细胞凋亡显著减少，而在存在明显CHF时心肌细胞凋亡又显著增加。电镜下心肌细胞超微结构检查也证实SHR LVH前和发生CHF后左心室心肌标本中存在心肌细胞胞质变深(胞质浓缩)和胞核染色质浓聚边集(核固缩)等心肌细胞凋亡的形态学特征，而SHR LVH时则未见上述心肌细胞凋亡的形态学特征，但可见心肌细胞肥大、心肌肌浆网扩张和心肌线粒体增生等超微结构改变。我们将伴显著LVH的SHR的心肌细胞凋亡指数与左心室心肌肥厚指数进行直线回归分析， 结果显示二者间呈显著负相关， 进一步证实心肌细胞凋亡不足与SHR的LVH有关。

28、提示心肌细胞凋亡在SHR心脏重塑方面起重要作用，心肌细胞凋亡减少可能与LVH有关，而心肌细胞凋亡增多可能与CHF有关；在SHR高血压LVH心力衰竭演进过程中其心肌细胞增生与凋亡的程度不同，可能存在明显的心肌细胞增生与凋亡的时间窗。心肌细胞增生为主的时间窗可能为SHR出生后至1个月以内和5个月至17个月之间而心肌细胞凋亡为主的时间窗可能为1个月至4个月之间和18个月以后。SHR早期发生LVH之前出现短暂心肌细胞凋亡增多的机制目前尚不清楚,我们推测可能与心脏对心肌细胞增生过度的代偿性反应(即代偿性心肌细胞凋亡增多)有关5-9。此时的心肌细胞凋亡增多可能是继发性的心肌细胞凋亡增多。当代偿性心肌细胞凋

29、亡无法对抗SHR的心肌细胞增生时,心脏的适应性反应就会发生逆转而进入心肌细胞增生、肥大和原发性心肌细胞凋亡不足，出现LVH5,6。SHR长期慢性压力超负荷时心肌细胞凋亡再次被触发,造成过度代偿肥厚的心脏心肌细胞的逐渐丢失，最终导致心力衰竭的机制目前仍未完全阐明。结合国外新近报道，我们认为心力衰竭发生可能与过度代偿肥大的心肌细胞相对缺血缺氧和多种细胞凋亡相关基因表达失调有关。心脏过度肥厚时,其单位面积的毛细血管数目显著减少6,10,使心肌细胞处于相对缺氧状态，而缺氧肯定可以直接或通过刺激Fas抗原mRNA和其他多种细胞凋亡相关基因(如c-myc、c- fos、hsp70、p53和WAF-1等基因

30、)的表达诱导心肌细胞凋亡,造成原发性心肌细胞凋亡增多7,11，12。心肌细胞超微结构检查还发现，在SHR LVH前和发生CHF后的凋亡心肌细胞中存在线粒体明显变性、肿胀且空泡化，而SHR LVH时则无这种变化，提示线粒体功能障碍也可能是SHR心肌细胞凋亡的机制之一。心脏无肥厚时也出现线粒体上述改变的原因目前尚不清楚，有待进一步研究。由于高血压不同时期心肌细胞增生与凋亡的程度和心肌细胞凋亡的性质(原发性或继发性)不同，因此，在制定高血压治疗方案时，必须考虑细胞增生与凋亡时间窗的存在及细胞凋亡的性质，以便更为恰当地采用刺激或抑制细胞凋亡的方法来更为有效地改善高血压靶器官损害和心血管重塑。21月龄S

31、HR(NLVH)组和1820月龄SHR(CHF)组凋亡心肌细胞电镜超微像：核染色质浓聚边集(×12 000)31月龄SHR(NLVH)组和1820月龄SHR(CHF)组凋亡心肌细胞电镜超微像：胞膜完整，胞质浓缩，线粒体增生、&127;肿胀且空泡化(×5 000)410月龄SHR(LVH)组和1820月龄SHR(CHF)组肥大心肌细胞电镜超微像：心肌细胞肥大，肌浆网扩张，线粒体增生(×10 000)5年龄配对的WKY(对照)组正常心肌细胞电镜超微像(×12 000)作者单位：400016 重庆医科大学附属第一医院心内科(本文1见插页第1页)参考文献

32、1James TN. Normal and abnormal consequences of apoptosis in the human heart from postnatal morphogenesis to paroxysmal arrhythmias. Circulation, 1994,90:556-573.2Wijsman JH, Jonker RR, Keijzer R, et al. A new method to detect apoptosis in paraffin section: in situ end labeling of fragmented DNA. J H

33、istochem Cytochem, 1993,41:7-12.3Conrad CH, Brooks WW, Robinson KG, et al. Impaired myocardial function in spontaneously hypertensive rats with heart failure. Am J Physiol, 1991,260 (1 Pt 2):H136-H145.4龙超良，汪海，肖文彬. 高血压心血管重构及其药物治疗. 军事医学科学院院刊，1997,21:63-67.5Hamet P, Richard L, Dam TV, et al. Apoptosis in target organs of hypertension. Hypertension, 1995,26:642-648.6张艳. 高血压靶器官的细胞凋亡. 国外医