第四章发酵工业的无菌技术

1、第四章第四章 发酵工业的无菌技术发酵工业的无菌技术本章内容一、一、染菌的防治染菌的防治二、发酵工业的无菌技术二、发酵工业的无菌技术三、培养基及设备灭菌三、培养基及设备灭菌 四、空气除菌四、空气除菌发酵过程中除了生产菌以外，还有其发酵过程中除了生产菌以外，还有其它菌生长繁殖它菌生长繁殖.什么是染菌？什么是染菌？一、染菌的影响一、染菌的影响4.影响产品外观及内在质量。影响产品外观及内在质量。发酵过程污染杂菌，会严重的影响生产，是发酵过程污染杂菌，会严重的影响生产，是发酵工业的致命伤。发酵工业的致命伤。 造成大量原材料的浪费，在经济上造成巨大损失造成大量原材料的浪费，在经济上造成巨大损失2.扰乱生产

2、秩序，破坏生产计划。扰乱生产秩序，破坏生产计划。3.遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往会影遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往会影响人们的情绪和生产积极性。响人们的情绪和生产积极性。（一）染菌对发酵的影响（一）染菌对发酵的影响生产不同的品种，可污染不同种类和性质的生产不同的品种，可污染不同种类和性质的微生物。微生物。不同污染时间，不同污染途径，污染不同菌量，不同污染时间，不同污染途径，污染不同菌量，不同培养基和培养条件又可产生不同后果不同培养基和培养条件又可产生不同后果 。A细菌细菌谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大。染

3、杂菌，但噬菌体威胁大。1 1、发酵染菌对不同品种的影响、发酵染菌对不同品种的影响不同种类菌种不同种类菌种n肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢产物。成代谢产物。B. 霉菌霉菌PenG：青霉素水解酶上升，：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，发迅速破坏，发酵一无所获。酵一无所获。柠檬酸：柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染菌。，不易染菌，主要防止前期染菌。C. 酵母菌酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌易污染细菌以及野生酵母菌 D. 疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内

4、外毒疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，都应全部废弃。素，都应全部废弃。不同产品青霉素发酵染菌青霉素发酵染菌，绝大多数杂菌都能直接或诱，绝大多数杂菌都能直接或诱导产生青霉素酶，不论在发酵前期、中期或后导产生青霉素酶，不论在发酵前期、中期或后期，染有能产生青霉素酶的杂菌，都能使青霉期，染有能产生青霉素酶的杂菌，都能使青霉素迅速破坏。素迅速破坏。链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等虽不等虽不象青霉素发酵染菌那样一无所得，但也会造象青霉素发酵染菌那样一无所得，但也会造成不同程度的危害。如杂菌大量消耗营养干成不同程度的危害。如杂菌大量消耗营养干扰生产菌的正常代谢、改变

5、扰生产菌的正常代谢、改变pH，降低产量。，降低产量。 不同产品灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制等抗生素抑制霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。疫苗生产疫苗生产危害很大。危害很大。疫苗是一类不加提纯而直接使用的产品，疫苗是一类不加提纯而直接使用的产品，一旦污染杂菌，不论死菌、活菌或内外毒一旦污染杂菌，不论死菌、活菌或内外毒素，都应全部废弃。素，都应全部废弃。2 2、污染不同种类和性质的微生物的影响、污染不同种类和性质的微生物的影响噬菌体的感染力很强，传播蔓延迅速，也较防治，噬菌体的感染力很强，传播蔓延迅速，也较防治，故故危害

6、极大危害极大。污染噬菌体后，可使发酵产量大幅。污染噬菌体后，可使发酵产量大幅度下降，严重的造成断种，被迫停产度下降，严重的造成断种，被迫停产。（1）污染噬菌体）污染噬菌体有些杂菌会使生产菌有些杂菌会使生产菌自溶自溶产生大量泡沫，即使添加产生大量泡沫，即使添加消泡剂也无法控制逃液，影响发酵过程的通气搅拌。消泡剂也无法控制逃液，影响发酵过程的通气搅拌。（2）污染其它杂菌）污染其它杂菌有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使pH下降下降，使不，使不耐酸的产品破坏。特别是染芽孢杆菌，由于芽孢耐热，耐酸的产品破坏。特别是染芽孢杆菌，由于芽孢耐热，不易杀死，往往一次染菌后会反复

7、染菌。不易杀死，往往一次染菌后会反复染菌。 3、不同时间染菌对发酵的影响不同时间染菌对发酵的影响污染时间污染时间是指用无菌检测方法确准的污染是指用无菌检测方法确准的污染时间，不是杂菌窜入培养液的时间。时间，不是杂菌窜入培养液的时间。杂菌进入培养液后，需有足够的生长、繁殖的杂菌进入培养液后，需有足够的生长、繁殖的时间才能显现出来，显现的时间又与污染菌量时间才能显现出来，显现的时间又与污染菌量有关。污染的菌量多，显现染菌所需的时间就有关。污染的菌量多，显现染菌所需的时间就短，污染菌量少，显现染菌的时间就长。短，污染菌量少，显现染菌的时间就长。（1）种子培养期染菌）种子培养期染菌在发酵初期，生产菌生

8、长不占优势，抵抗杂菌能在发酵初期，生产菌生长不占优势，抵抗杂菌能力低，容易污染杂菌。力低，容易污染杂菌。如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。（2）发酵前期染菌）发酵前期染菌原因原因 发酵前期菌量不很多，发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；与杂菌没有竞争优势；且且还未合成产物（抗生素）或产生很少，还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌能力弱。抵御杂菌能力弱。发酵前期最易染菌，且危害最大。发酵前期最易染菌，且危害最大。染菌措施染菌措施 降低温度，调整补料量，调降低温度，调整补料量，调pH值，缩短培值，缩短培养周期等养周期等要特别警惕以制止染菌的发生。要特

9、别警惕以制止染菌的发生。若培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营若培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。养，重新接种再用。（3）发酵中期染菌）发酵中期染菌 严重干扰产生菌的代谢。严重干扰产生菌的代谢。措施措施 降温培养，减少补料，密切注意代谢降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提变化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发前放罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑制杂菌。酵液输送一部分到染菌罐，抑制杂菌。（4）发酵后期染菌）发酵后期染菌发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特

10、别是抗生发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响不大。如果染菌严重，又破坏菌不多，对生产影响不大。如果染菌严重，又破坏性较大，可以提前放罐。性较大，可以提前放罐。实际生产中发酵染菌率比较高，造成染菌的因素很实际生产中发酵染菌率比较高，造成染菌的因素很多。多。例如，灭菌的蒸汽压不足不能灭菌；例如，灭菌的蒸汽压不足不能灭菌； 设备有渗漏不能进罐等等；设备有渗漏不能进罐等等； 操作不规范等等。操作不规范等等。 （二）染菌原因（二）染菌原因染菌主要原因染菌主要原因1 1、设备渗漏或、设备渗漏或

11、“死角死角”设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等。所以说加强设备本身及和其它设备漏等。所以说加强设备本身及附属零部件的严密度检查，对制服染菌是附属零部件的严密度检查，对制服染菌是极其主要的，也是重要的。极其主要的，也是重要的。发酵设备及附件由于化学腐蚀、电化学腐蚀，发酵设备及附件由于化学腐蚀、电化学腐蚀，物料与设备摩擦造成机械磨损以及加工制作不物料与设备摩擦造成机械磨损以及加工制作不良等原因会导致设备及附件渗漏。良等原因会导致设备及附件渗漏。 “死角死角” 发酵罐的发酵罐的

12、“死角死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件。撑件。 口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口进料管口 发酵罐罐底脓疱状积垢造成发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角死角” 消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀放汽边阀管道安装不当或配置不合理管道安装不当或配置不合理形成的形成的“死角死角” 由于操作、设备结构或人为因素造成的屏障等原

13、因，由于操作、设备结构或人为因素造成的屏障等原因，使蒸汽不能到达预定的灭菌部位或该部位的冷空气不使蒸汽不能到达预定的灭菌部位或该部位的冷空气不易在加热过程中排净，不能达到彻底灭菌的部位。易在加热过程中排净，不能达到彻底灭菌的部位。污水脓疱罐底 发酵罐罐底脓疱状积垢造成发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角死角” 灭菌时蒸汽不易通达的灭菌时蒸汽不易通达的“死角死角”及其消除方及其消除方法法法兰连接不当造成的法兰连接不当造成的“死角死角” 2 2、空气带菌、空气带菌因为空气除菌系统较为复杂，环节多，偶遇不因为空气除菌系统较为复杂，环节多，偶遇不慎便会导致空气除菌失败。慎便会导致空气除菌失败。3、种子带菌、

14、种子带菌加强种子管理，严格无菌操作，种子本身带菌加强种子管理，严格无菌操作，种子本身带菌是可以克服的。种子培养过程染菌与发酵一样是可以克服的。种子培养过程染菌与发酵一样有许多因素造成。有许多因素造成。分为种子本身带菌和种子培养过程中染菌。分为种子本身带菌和种子培养过程中染菌。4 4、灭菌不彻底、灭菌不彻底灭菌技术的好坏与灭菌质量很有关系灭菌技术的好坏与灭菌质量很有关系l蒸汽通入培养基，蒸汽通入培养基，升温快慢、保温时间升温快慢、保温时间产生过产生过多泡沫多泡沫l蒸汽总压是否达到要求标准蒸汽总压是否达到要求标准l环境中的环境中的杂菌数量因季节而有很大差别杂菌数量因季节而有很大差别。故染菌率。故染

15、菌率因季节不同而发生明显变化。因季节不同而发生明显变化。l原材料储存原材料储存和保管，如液胨、玉米浆、母和保管，如液胨、玉米浆、母液糖等有机原料液糖等有机原料杂菌的数量杂菌的数量l发酵罐、培养基配制罐等设备的清洗质发酵罐、培养基配制罐等设备的清洗质量量有无灭菌的死角有无灭菌的死角对减少或避免染菌仍然是十分必要的。对减少或避免染菌仍然是十分必要的。 5 5、技术管理不善、技术管理不善技术管理就是要对发酵每个环节严格控制，技术管理就是要对发酵每个环节严格控制，发酵中稍有不慎就可能染菌，所以不能有侥发酵中稍有不慎就可能染菌，所以不能有侥幸心理而放松管理幸心理而放松管理1 1、染菌的检查、染菌的检查（

16、1 1）显微镜检查法（最简单、最直接、最经常）显微镜检查法（最简单、最直接、最经常）（2 2）平板划线培养或斜面培养检查法；）平板划线培养或斜面培养检查法； 平板制好后，应先保温平板制好后，应先保温2424小时，确定无菌小时，确定无菌（3 3）肉汤培养基检查法（酚红变色）肉汤培养基检查法（酚红变色pH6.8-8.4pH6.8-8.4）三、染菌的检查与判断三、染菌的检查与判断2 2、以上、以上3 3种检查法的不足种检查法的不足 以上以上3种检查法未发现染菌，还不能肯定未被种检查法未发现染菌，还不能肯定未被染菌；染菌； 原因是以上检查法只能检查杂菌浓度较大的染原因是以上检查法只能检查杂菌浓度较大的

17、染菌情况（菌情况（1个个/ml）(四四)染菌情况分析染菌情况分析1 1、单罐染菌、单罐染菌不是系统问题，而是该罐本身的问题。如种子不是系统问题，而是该罐本身的问题。如种子带菌、培养基灭菌不彻底、罐有渗漏、分过滤带菌、培养基灭菌不彻底、罐有渗漏、分过滤器失效器失效2、多罐染菌、多罐染菌系统问题，如空气过滤系统有问题，特别是总过滤器系统问题，如空气过滤系统有问题，特别是总过滤器长期没有检查，可能受潮失效；移种或补料的分配站长期没有检查，可能受潮失效；移种或补料的分配站有渗漏或灭菌不彻底。有渗漏或灭菌不彻底。3、前期染菌、前期染菌种子带菌、培养基灭菌不彻底种子带菌、培养基灭菌不彻底4 4、中后期染菌

18、、中后期染菌补料的料液灭菌不彻底或补料管道、阀门补料的料液灭菌不彻底或补料管道、阀门渗漏，一般不会是种子问题。渗漏，一般不会是种子问题。五、染菌的防止五、染菌的防止1 1、防止种子带菌、防止种子带菌l制备种子时对沙土管及摇瓶严格加以控制。制备种子时对沙土管及摇瓶严格加以控制。l沙土制备时要多次间歇灭菌沙土制备时要多次间歇灭菌l注意接种时的无菌操作注意接种时的无菌操作l子瓶、母瓶的移种和培养子瓶、母瓶的移种和培养l无菌室和摇床间都要保持清洁。无菌室和摇床间都要保持清洁。2 2、防止设备渗漏、防止设备渗漏设备上一旦渗漏，就会造成染菌，如盘管、夹套穿孔设备上一旦渗漏，就会造成染菌，如盘管、夹套穿孔渗

19、漏，未灭菌冷却水便会通过漏孔而进入发酵罐中招渗漏，未灭菌冷却水便会通过漏孔而进入发酵罐中招致染菌。致染菌。阀门渗漏也会使带菌的空气或水进入发酵罐而造成染阀门渗漏也会使带菌的空气或水进入发酵罐而造成染菌。菌。设备上的漏隙如果肉眼能看见，容易发现；但有的微设备上的漏隙如果肉眼能看见，容易发现；但有的微小泄漏，肉眼看不见，必须通过一定的试漏方法才能小泄漏，肉眼看不见，必须通过一定的试漏方法才能发现发现 。3 3、防止培养基灭菌不彻底、防止培养基灭菌不彻底培养基灭菌方法培养基灭菌方法高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌分批灭菌分批灭菌 1210C，30分钟分钟连续灭菌连续灭菌 罐温罐温1251300C，3045分

20、钟分钟5 5、发酵染菌后的措施、发酵染菌后的措施l染菌后的培养基必须灭菌后才可放下水道。染菌后的培养基必须灭菌后才可放下水道。l凡染菌的罐要找染菌的原因凡染菌的罐要找染菌的原因，对症下药，该罐也，对症下药，该罐也要彻底清洗，进行空罐消毒，才可进罐。要彻底清洗，进行空罐消毒，才可进罐。l染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒，空气用甲，空气用甲醛熏蒸。特别，若染噬菌体，空气必须用甲醛蒸汽醛熏蒸。特别，若染噬菌体，空气必须用甲醛蒸汽消毒。消毒。四、染噬菌体的防治四、染噬菌体的防治（一）染噬菌体对发酵的影响（一）染噬菌体对发酵的影响若受噬菌体侵染，会出现发酵迟缓或停止。若受

21、噬菌体侵染，会出现发酵迟缓或停止。且受噬菌体感染后，往往会反复连续感染，且受噬菌体感染后，往往会反复连续感染，使生产无法进行，甚至使种子全部丧失。使生产无法进行，甚至使种子全部丧失。染噬菌体表现为：染噬菌体表现为：（1）镜检可发现菌体数量明显减少，菌体不规则，）镜检可发现菌体数量明显减少，菌体不规则，严重时完全看不到菌体，且是在短时间内菌体自严重时完全看不到菌体，且是在短时间内菌体自溶。溶。（2）发酵）发酵pH值逐渐上升，值逐渐上升，48小时之内可达小时之内可达8.0以以上，不再下降。上，不再下降。（3）发酵液残糖高，有刺激臭味，粘度大，泡沫）发酵液残糖高，有刺激臭味，粘度大，泡沫多。多。（4

22、）生产量甚少或增长缓慢或停止）生产量甚少或增长缓慢或停止有无染噬菌体，根本的要做噬菌斑检验有无染噬菌体，根本的要做噬菌斑检验（二）产生噬菌体的原因（二）产生噬菌体的原因主要是由于生产和试验过程中不断不加注意地把主要是由于生产和试验过程中不断不加注意地把许多活菌体排放到环境中去，造成了自然界中噬许多活菌体排放到环境中去，造成了自然界中噬菌体增殖的好机会。菌体增殖的好机会。这些噬菌体有可能潜入生产的各个环节，尤其是这些噬菌体有可能潜入生产的各个环节，尤其是通过空气系统进入种子室、种子罐、发酵罐通过空气系统进入种子室、种子罐、发酵罐（三）噬菌体的防治（三）噬菌体的防治 1、建立工厂环境清洁卫生制度，

23、定期检查、定期、建立工厂环境清洁卫生制度，定期检查、定期清扫，车间四周有严重污染噬菌体的地方应及时撒清扫，车间四周有严重污染噬菌体的地方应及时撒石灰或漂白粉。石灰或漂白粉。 2、车间地面和通往车间的道路尽量采取水泥地面。、车间地面和通往车间的道路尽量采取水泥地面。 3、种子和发酵工段的操作人员要严格执行无菌操、种子和发酵工段的操作人员要严格执行无菌操作规程，不使用本身带有噬菌体的菌种。作规程，不使用本身带有噬菌体的菌种。 （ 4）认真进行发酵罐、补料系统的灭菌。）认真进行发酵罐、补料系统的灭菌。 （5）选育抗噬菌体的菌种，或轮换使用菌）选育抗噬菌体的菌种，或轮换使用菌种。种。 （ 6）发现噬菌

24、体停搅拌、小通风，将发酵）发现噬菌体停搅拌、小通风，将发酵液加热到液加热到70800C杀死噬菌体，才可排放。杀死噬菌体，才可排放。发酵罐周围的管道也必须彻底灭菌。发酵罐周围的管道也必须彻底灭菌。第二节第二节发酵工业的无菌技术发酵工业的无菌技术灭菌方法灭菌方法干热灭菌法干热灭菌法 湿热灭菌法湿热灭菌法 射线灭菌法射线灭菌法 化学药剂灭菌法化学药剂灭菌法过滤除菌法过滤除菌法火焰灭菌法火焰灭菌法 第三节第三节 培养基及设备灭菌培养基及设备灭菌 一、湿热灭菌原理一、湿热灭菌原理 二、分批灭菌（实罐灭菌）二、分批灭菌（实罐灭菌） 三、连续灭菌（连消）三、连续灭菌（连消）四、分批灭菌与连续灭菌的比较四、分

25、批灭菌与连续灭菌的比较 1. 1. 热阻热阻2. 2. 微生物热死定律：对数残留定律微生物热死定律：对数残留定律3.3.灭菌温度和时间的选择灭菌温度和时间的选择 4. 4. 影响培养基灭菌的其它因素影响培养基灭菌的其它因素 一、湿热灭菌原理一、湿热灭菌原理1. 热阻热阻 定义：定义：微生物对热的抵抗力称为热阻，可用比死微生物对热的抵抗力称为热阻，可用比死亡速率常数亡速率常数k的倒数来表示的倒数来表示 。 k，热阻热阻, tkNdtdNktNNt0ln当温度当温度T一定时，一定时，k随微生物不同而不同，具体计随微生物不同而不同，具体计算时，可取细菌芽孢的算时，可取细菌芽孢的k值为标准。值为标准。

26、当当 T 变化时，变化时，k有很大变化，其变化遵从阿累尼有很大变化，其变化遵从阿累尼乌斯定律乌斯定律 k=Aexp(- E/RT) k与微生物活化能及与微生物活化能及T有关有关 大肠杆菌在不同温度下大肠杆菌在不同温度下的残留曲线的残留曲线嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同温度下的死亡曲线温度下的死亡曲线 2.2.对数残留定律对数残留定律在一定温度下，微生物在一定温度下，微生物受热致死受热致死遵循分子反应速度理论遵循分子反应速度理论，微生物受热死亡的速率，微生物受热死亡的速率-dN/dt与任何瞬间残留的活菌数与任何瞬间残留的活菌数N成正比，即成正比，即 当当Nt=0时，时， t

27、=， 无意义，也不可能。无意义，也不可能。 一般采用一般采用Nt=0.001，即即1000次灭菌中只有一次失败次灭菌中只有一次失败。kNdtdNktNNt0lntNNkt0log/303. 2非对数残留定律非对数残留定律 某些微生物受热死亡的速率不符合对数残留定律：如一些某些微生物受热死亡的速率不符合对数残留定律：如一些微生物芽孢。微生物芽孢。 kR ksNR Ns NDdNR/dt=-kR NR Nt/N0=KR/(kR-kS) ekst-ks/kR e-kRtdNs/dt =kR NR -ks Ns 式中式中NR：耐热性活芽孢数；耐热性活芽孢数；Ns：敏感性活芽孢数敏感性活芽孢数 ND：死

28、亡的芽孢数死亡的芽孢数；kR：耐热性芽孢的比死亡速率耐热性芽孢的比死亡速率； ks：敏感性芽孢的比死亡速率；敏感性芽孢的比死亡速率； N0：初始活芽孢数。初始活芽孢数。在在T相同时，对数与非对数定律的灭菌时间相同时，对数与非对数定律的灭菌时间t不同。不同。3. 灭菌温度和时间的选择灭菌温度和时间的选择 培养物质受热破坏也可看作一级反应：培养物质受热破坏也可看作一级反应：式中式中C：对热不稳定物质的浓度；对热不稳定物质的浓度；k：分解速度常数分解速度常数； k的变化也遵循阿累尼乌斯方程：的变化也遵循阿累尼乌斯方程： 都与相应的活化能及都与相应的活化能及T有关有关CkdtdC)exp(RTEAk)

29、exp(RTEAk当当T1 T2 (k2/k1)/(k2/k1)=E/E1 (EE) 随着随着T上升，菌死亡速率增加倍数大于培养基成分上升，菌死亡速率增加倍数大于培养基成分分解速率增加倍数，故一般选择高温快速灭菌分解速率增加倍数，故一般选择高温快速灭菌 。 4. 4. 影响培养基灭菌的其它因素影响培养基灭菌的其它因素 （1）培养基成分）培养基成分油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机物等增油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机物等增加微生物的耐热性加微生物的耐热性低浓度（低浓度（1%-2%）NaCl对微生物有保护作用，随着对微生物有保护作用，随着浓度增加，保护作用减弱，当浓度达浓度增加，保

30、护作用减弱，当浓度达8%-10%以上，以上，则减弱微生物的耐热性。则减弱微生物的耐热性。（4）泡沫泡沫：泡沫中的空气形成隔热层，对灭菌：泡沫中的空气形成隔热层，对灭菌极为不利，可加入少量消泡剂极为不利，可加入少量消泡剂 。（2）pH：pH6.0-8.0，微生物最耐热，微生物最耐热，pH6.0，H+易渗入微生物细胞内，改变细胞的生理反应促使其易渗入微生物细胞内，改变细胞的生理反应促使其死亡。死亡。培养基培养基pH愈低，灭菌所需时间愈短。愈低，灭菌所需时间愈短。（5 5）培养基中的微生物数量）培养基中的微生物数量（3）培养基的物理状态）培养基的物理状态分空气过滤器灭菌分空气过滤器灭菌并用空气吹干并

31、用空气吹干夹套或蛇管排冷水，开启排夹套或蛇管排冷水，开启排气管阀，空气管通蒸汽，也气管阀，空气管通蒸汽，也可夹套内通蒸汽可夹套内通蒸汽达达70左右左右取样管取样管放料管放料管通蒸汽通蒸汽120，1105pa保温保温保温阶段，凡液面以下各管保温阶段，凡液面以下各管道都应通蒸汽，液面上其余道都应通蒸汽，液面上其余各管道则应排蒸汽，不留死各管道则应排蒸汽，不留死角，维持压力、温度恒定角，维持压力、温度恒定罐压接近空气压力罐压接近空气压力向罐内通无菌空气向罐内通无菌空气保温结束，依次关闭保温结束，依次关闭各排汽、进汽阀门各排汽、进汽阀门夹套或蛇管中通冷水夹套或蛇管中通冷水 培养基降温到所需温度培养基降

32、温到所需温度二、分批灭菌（实罐灭菌）二、分批灭菌（实罐灭菌） 1.1.灭菌工艺过程灭菌工艺过程升温、冷却两阶段也有一定的灭菌效果，考虑到升温、冷却两阶段也有一定的灭菌效果，考虑到灭菌的可靠性主要在保温阶段进行，故可以简单灭菌的可靠性主要在保温阶段进行，故可以简单地利用式地利用式 (N/N0) =-kt 来粗略估算灭菌所需时间。来粗略估算灭菌所需时间。2. 灭菌时间的估算灭菌时间的估算例例1：有一发酵罐内装有一发酵罐内装40m3培养基，在培养基，在1210C温度下温度下实罐灭菌，原污染程度为每实罐灭菌，原污染程度为每1ml有有2105个耐热细个耐热细菌芽孢，已知菌芽孢，已知1210C时灭菌速度常

33、数时灭菌速度常数k=1.8min-1，求，求灭菌失败机率为灭菌失败机率为0.001时所需时间。时所需时间。 解：N0=401062105=81012(个) Nt=0.001(个) k=1.8(min-1)(Nt/N0)=-kt t=2.303/klg(N0/Nt)=2.303/1.8lg(81015) =20.34(min)由于升温阶段就有部分菌被杀灭，特别是当培养基加由于升温阶段就有部分菌被杀灭，特别是当培养基加热至热至100C以上，这个作用较为显著，以上，这个作用较为显著， 故实际保温阶段故实际保温阶段时间比计算值要短。时间比计算值要短。三、连续灭菌（连消）三、连续灭菌（连消）工艺流程工艺

34、流程喷淋冷却连续灭菌流程喷淋冷却连续灭菌流程喷射加热连续灭菌流程喷射加热连续灭菌流程 薄板式换热器连续灭菌流程薄板式换热器连续灭菌流程 例例2某发酵罐内装某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌，培养基，采用连续灭菌，灭菌温度为灭菌温度为1310C，原污染程度为每，原污染程度为每1ml含有含有2105个杂菌，已知个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为时灭菌速度常数为15min-1，求灭菌所需的维持时间。，求灭菌所需的维持时间。解：解：C0=2105(个/ml) Ct=0.001/(40106)=2.510-11(个/ml) t=2.303/klg(C0/Ct)=2.303/15lg(2105)

35、/(2.510-11) =2.37 min 配料罐 连消泵 连消塔 维持罐 冷却罐 蒸汽 蒸汽 放汽 冷却水 无菌培养基 进发酵罐 喷淋冷却连续灭菌流程喷淋冷却连续灭菌流程分批灭菌与连续灭菌的比较分批灭菌与连续灭菌的比较 连续灭菌的优点：（适用于大型罐）连续灭菌的优点：（适用于大型罐） 可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有利于提可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率；高发酵产率；发酵罐利用率高；发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均衡；蒸汽负荷均衡； 采用板式换热器时，可节约大量能量；采用板式换热器时，可节约大量能量；适宜采用自动控制，劳动强度小；适宜采用自动控制，劳动强度小；可实现将

36、耐热性物料和不耐热性物料在不同温度下可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。分开灭菌，减少营养成分的破坏。缺点：缺点：对小型罐无优势，不方便，对设备要求高；对小型罐无优势，不方便，对设备要求高；蒸汽波动时灭菌不彻底；蒸汽波动时灭菌不彻底；当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时，当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时，以分批灭菌好，防止灭菌不彻底。以分批灭菌好，防止灭菌不彻底。 分批灭菌与连续灭菌的比较分批灭菌与连续灭菌的比较 第四节第四节 空气除菌空气除菌概述概述：无菌空气无菌空气 空气中微生物的分布空气中微生物的分布 发酵工业对空气无菌程度的要求发酵工业对空气无

37、菌程度的要求空气除菌的方法空气除菌的方法 介质过滤除菌的机理介质过滤除菌的机理 介质过滤除菌的工艺介质过滤除菌的工艺 发酵工业应用的发酵工业应用的“无菌空气无菌空气”是指通过除菌处理使是指通过除菌处理使空气中含菌量降低在一个极低的百分数，从而能控空气中含菌量降低在一个极低的百分数，从而能控制发酵污染至极小机会。此种空气称为制发酵污染至极小机会。此种空气称为“无菌空气无菌空气”。无菌空气的概念无菌空气的概念各地空气中所悬浮的微生物种类及比例各不相同各地空气中所悬浮的微生物种类及比例各不相同，数量也随条件的变化而异，一般设计时以含量，数量也随条件的变化而异，一般设计时以含量为为10103-3-10

38、104 4个个m m3 3进行计算。进行计算。空气中微生物的分布空气中微生物的分布空气中的含菌量随环境不同而有很大差异：空气中的含菌量随环境不同而有很大差异： 一般干燥寒冷的北方空气中的含菌量较少，而潮湿一般干燥寒冷的北方空气中的含菌量较少，而潮湿温暖的南方则含菌量较多；温暖的南方则含菌量较多； 人口稠密的城市比人口少的农村含菌量多；人口稠密的城市比人口少的农村含菌量多； 地面又比高空的空气含菌量多。地面又比高空的空气含菌量多。以一个以一个50m3的发酵罐为例，若装料系数为的发酵罐为例，若装料系数为0.7，要，要求每立方米发酵液每分钟通气求每立方米发酵液每分钟通气0.8m3，培养周期，培养周期

39、170h，那么每个周期需通气量，那么每个周期需通气量2.86105 m3(500.7 0.8 170 60)，而每，而每立方米大气立方米大气中约有中约有103-104个微生物。个微生物。空气除菌的必要性空气除菌的必要性 一般按染菌机率为一般按染菌机率为10-3。来计算，即。来计算，即1000次发酵周期所用的无菌空气只允许次发酵周期所用的无菌空气只允许12次染次染菌。菌。发酵对空气无菌程度的要求发酵对空气无菌程度的要求各种不同的发酵过程，对空气无菌程度的要求各种不同的发酵过程，对空气无菌程度的要求也不同。影响因素是比较复杂的，需要根据具也不同。影响因素是比较复杂的，需要根据具体情况而订出具体的工

40、艺要求。体情况而订出具体的工艺要求。培养法：微生物学中已介绍过培养法：微生物学中已介绍过空气含菌量的测定空气含菌量的测定光学法光学法 ：用粒子计数器通过微粒对光线的散射：用粒子计数器通过微粒对光线的散射作用来测量粒子的大小和含量。作用来测量粒子的大小和含量。空气除菌的方法空气除菌的方法辐射灭菌辐射灭菌 加热灭菌加热灭菌 静电除菌静电除菌 介质过滤介质过滤 射线、射线、X射线、射线、射线、射线、射线、紫外线、射线、紫外线、超声波等从理论上讲都能破坏蛋白质，破坏超声波等从理论上讲都能破坏蛋白质，破坏生物活性物质，从而起到杀菌作用。生物活性物质，从而起到杀菌作用。辐射灭菌辐射灭菌原理原理应用范围应用

41、范围: :通常用于无菌室和医院手术室。缺点缺点杀菌效率较低，杀菌时间较长。一般要结合甲醛杀菌效率较低，杀菌时间较长。一般要结合甲醛蒸汽等来保证无菌室的无菌程度。蒸汽等来保证无菌室的无菌程度。加热灭菌加热灭菌利用压缩热进行空气灭菌的流程图空气进口21C，出口187198C，压力为0.7MPa。阻力小，除水、除油的效果好 耗电少 静电除菌静电除菌原原理理利用静电引力来吸附带电粒利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘、除菌的目的。子而达到除尘、除菌的目的。优优点点设备庞大 、一次性投资较大 、捕集率尚嫌不够，需要采取其它措施。常用于洁净工作台、洁净工作室所常用于洁净工作台、洁净工作室所需无菌无尘空气的

42、第一次除尘，配需无菌无尘空气的第一次除尘，配合高效过滤器使用。合高效过滤器使用。 缺缺点点适适用用范范围围过滤除菌过滤除菌采用定期灭菌的介质来阻截流过的空气所含的微采用定期灭菌的介质来阻截流过的空气所含的微生物而取得无菌空气。生物而取得无菌空气。常用的过滤介质有棉花、活性炭、玻璃纤维、有机常用的过滤介质有棉花、活性炭、玻璃纤维、有机合成纤维、合成纤维、超细玻璃纤维纸、烧结材料过滤介质超细玻璃纤维纸、烧结材料过滤介质 、有机和无机烧结材料、有机和无机烧结材料、新型过滤介质新型过滤介质等等。等等。绝对过滤、深层过滤绝对过滤、深层过滤滤材滤材孔孔利用有孔介质从气体中除去微生物利用有孔介质从气体中除去

43、微生物洁净气体洁净气体含微生物的气体含微生物的气体深层过滤机理深层过滤机理惯性撞击截留作用惯性撞击截留作用布朗扩散拦截作用布朗扩散拦截作用（直接拦截作用）（直接拦截作用）拦截截留作用拦截截留作用重力沉降重力沉降静电吸引静电吸引惯性撞击惯性撞击尺寸小于滤材孔径的颗粒的辅助拦截方式流体携带的颗粒由于质量和线速度而具有直线 运动的惯性颗粒离开流体主流而撞击到滤材上当流体改变运动方向时，惯性使颗粒撞击到滤材当流体改变运动方向时，惯性使颗粒撞击到滤材表面并由于吸附力而停留表面并由于吸附力而停留 惯性撞击惯性撞击4颗粒被机械拦截或被吸附拦截4在气体中比在液体中更有效.4对大于 0.5 - 1.0 微米的颗

44、粒很有效.布朗扩散拦截布朗扩散拦截4气体过滤器能够去除尺寸远小于液体精度 的污染物。4对小-细颗粒 (0.1 - 0.3微米)非常有效。4如果一个气体过滤器在湿润环境中运行， 它的去除能力即变为液体精度。空气过滤除菌流程空气过滤除菌流程 而一般的深层通气发酵，除要求无菌空气具有必而一般的深层通气发酵，除要求无菌空气具有必要的无菌程度外，还要具有一定的压力，这就需要的无菌程度外，还要具有一定的压力，这就需要比较复杂的空气除菌流程。要比较复杂的空气除菌流程。空气过滤除菌流程是按生产对无菌空气要求具备的参空气过滤除菌流程是按生产对无菌空气要求具备的参数，根据空气的性质而制订的，同时还要结合吸气环数，

45、根据空气的性质而制订的，同时还要结合吸气环境的空气条件和所用设备的特性进行考虑。境的空气条件和所用设备的特性进行考虑。对于一般要求的低压无菌空气，可直接采用一般鼓风对于一般要求的低压无菌空气，可直接采用一般鼓风机增压后进入过滤器，经一、二次过滤除菌而制得。机增压后进入过滤器，经一、二次过滤除菌而制得。流程的设备：流程的设备：主设备：空气压缩机主设备：空气压缩机附属设备：要求尽量采用新技术，提高效率，减少设附属设备：要求尽量采用新技术，提高效率，减少设备，精简设备流程，降低设备投资、运转费用和动力备，精简设备流程，降低设备投资、运转费用和动力捎耗，简便操作。捎耗，简便操作。流程的制订应考虑：地理

46、、气候环境、设备条件流程的制订应考虑：地理、气候环境、设备条件环境污染比较严重的地方，要考虑改变吸风的条件；环境污染比较严重的地方，要考虑改变吸风的条件；在温暖潮湿的南方，要加强除水设施在温暖潮湿的南方，要加强除水设施 ；压缩机耗油严重的设备流程中则要加强消除油雾的压缩机耗油严重的设备流程中则要加强消除油雾的污染污染 ，也可采用无油润滑的往复式压缩机；，也可采用无油润滑的往复式压缩机；往复式压缩机，要配备前置粗过滤器及空气贮罐。往复式压缩机，要配备前置粗过滤器及空气贮罐。空气过滤除菌流程的分析空气过滤除菌流程的分析具体的空气除菌流程，随气候条件及设备条件不同而具体的空气除菌流程，随气候条件及设

47、备条件不同而差别很大。差别很大。要保持过滤器有比较高的过滤效率，应维持一定的气要保持过滤器有比较高的过滤效率，应维持一定的气流速度和不受油、水的干扰。气流速度可由操作来控流速度和不受油、水的干扰。气流速度可由操作来控制；要保持不受油、水干扰则要有一系列冷却、分离制；要保持不受油、水干扰则要有一系列冷却、分离、加热的设备来保证空气的相对湿度在、加热的设备来保证空气的相对湿度在50605060的条的条件下过滤。件下过滤。流程主要设备：流程主要设备：空气压缩机空气压缩机 、空气过滤器空气过滤器 附属设备：粗过滤器、气液分离器、空气贮罐、空气附属设备：粗过滤器、气液分离器、空气贮罐、空气冷却器冷却器

48、除菌过滤器除菌过滤器形式以板框式、管式、折叠式为主 过滤介质：微过滤膜（聚偏氟乙烯膜、聚四氟乙烯膜、聚砜膜、聚酰胺膜等。）除菌过滤应具备的特点：除菌过滤应具备的特点：高的过滤精度; 大的通过量; 能耐反复的消毒操作; 强的亲水性或疏水性; 足够的使用强度。 消毒问题滤芯（器）消毒是一个日常操作工序。滤芯常见的消毒方法有蒸汽、热水和化学试剂消毒三种。蒸汽消毒要注意选择饱和蒸汽，一则是可以可靠杀死细菌，二则是可通过控制压力来调节温度。蒸汽消毒对于疏水滤芯来说相对是简单的，但对亲水滤芯特别是膜材料耐温度不高的滤芯来说，操作方法是至关重要的 1，粗过滤器作用：是捕集较大的灰尘颗粒，防止压缩机受磨损，同

49、时也可减轻总过滤器负荷。要求：过滤效率要高，阻力要小；否则会增加压缩空气的吸入负荷和降隐低压缩空气机的排气量。常用的粗过滤器有：布袋过滤填料过滤油浴洗涤水雾除尘2，空气贮罐 作用：是消除压缩机排出空气量的脉动，维持稳定的空气压力，同时也可以利用重力沉降作用分离部分油雾。 贮罐的大小可按下面的经验公式计算：3，气液分离器旋风式填料式4，空气冷却器立式列管式热交换器沉浸式热交换器喷淋式热交换器空气除菌流程的分析空气除菌流程的分析几种典型的设备流程几种典型的设备流程 两级冷却、加热除菌流程两级冷却、加热除菌流程 冷热空气直接混合式空气除菌流程冷热空气直接混合式空气除菌流程 高效前置过滤空气除菌流程高

50、效前置过滤空气除菌流程空气预处理空气预处理1. 原理：原理：除尘除尘(外源空气的前处理外源空气的前处理)：防塞，提高过滤效率和滤：防塞，提高过滤效率和滤器寿命；器寿命；降温：防烧伤介质及水分蒸发严重，对发酵不利降温：防烧伤介质及水分蒸发严重，对发酵不利除油、除水：防塞（因油膜堵），防止过滤器长菌堵除油、除水：防塞（因油膜堵），防止过滤器长菌堵塞（因水滴）塞（因水滴）加热：保持相对湿度加热：保持相对湿度稳压：防止压力波动，贮罐稳压：防止压力波动，贮罐 2. 预处理流程设计的简繁关键：去湿问题预处理流程设计的简繁关键：去湿问题措施：建吸风塔、粗过滤器措施：建吸风塔、粗过滤器（布袋过滤器、布袋过滤器、填料过滤器、油浴洗涤和水雾除尘装置等）、高填料过滤器、油浴洗涤和水雾除尘装置等）、高效前置过滤器效前置过滤器空气预处理流程设计空气预处理流程设计 两级冷却、加热除菌流程图两级冷却、加热除菌流程图1-粗过滤器；粗过滤器；2-空压机；空压机；3-贮罐；贮罐；4，6-冷却器；冷却器；5-旋风分离器；旋风分离器；7-丝网分离器；丝网