医学分子生物学实验技术(共32页)

1、精选优质文档-倾情为你奉上1、基因：是遗传的物质基础，是DNA 或者RNA分子中携带遗传信息的特定核苷酸序列。2、基因组：是指单倍体细胞核、细胞器或病毒粒子所含的全部DNA或RNA分子，每个生物的基因组携带者构成和维持该生物体生物形式所必需的所有生物信息。3、逆转录：以RNA为模板，由反转录酶催化四种dNTP聚合，产生DNA的过程。4、聚合酶链反应：是一种由引物介导利用DNA聚合酶在体外扩增目的基因的方法，也叫基因扩增技术。5、限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子中的某些特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。6引物：是一种与DNA模板链互补的线性核苷酸变短，其3末端为游离的

2、-OH，细胞内复制所需的引物是一小段RNA。催化游离dNTP之间相互聚合。7、TaqDNA聚合酶：从一种嗜热菌株中分离得到的耐热的DNA聚合酶。8、退火: 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程成为退火。9、启动子：是位于转录起始点附近，且为转录所必需的序列元件。10、DNA变性：当DNA收到某些理化因素作用时，DNA双链互补碱基对之间的氢键和相邻碱基之间的堆积力受到破坏，DNA分子被解开成单链，逐步形成为无规则线团的构象，不涉及核苷酸间共价键的断裂。1、RT-PCR的基本原理将RNA反转录与PCR过程结合的一种PCR技术，在反转录酶的作用下，以mRNA为模板，反转录生成DNA，再以cD

3、NA为模板进行PCR扩增。2、DNA电泳的基本原理，按照支持物不同可以分为几类基本原理：核酸是两性电解质，在中性或偏碱性的pH溶液中均带负电，在电场中向正极泳动，不同的核酸在相对分子质量、分子形状等方面各有不同，在凝胶的空隙中泳动时电泳迁移率各不相同，因此借助电泳即可使其得到分离。分类：1琼脂糖凝胶电泳AGE 2聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE 3 毛细管电泳3、总RNA提取后，如何鉴定RNA的纯度（1）紫外分光光度法：先通过A260与A280的比值判断核算的纯度，纯RNA的A260与A280的比值等于2.0，比值升高或降低均表示样品不纯。(2)琼脂糖凝胶电泳法：基因组DNA的分子量远远大于RNA，

4、两者之间电泳迁移率存在很大差别，用荧光染料EB为示踪剂的AGE即可观察到RNA分子中是否含有DNA，细胞RNA的琼脂糖凝胶电泳一般可见三条条带，条带模糊比例不合适及弥散明显说明RNA有严重降解。4、PCR的基本原理和基本步骤，知道几种PCR（1）基本原理是以待扩增的DNA分子为模板，以一对人工合成的、分别与模板的5端和3端互补的单链寡核苷酸作为引物，在耐热DNA聚合酶催化下，按照半保留复制的原则合成两个子代DNA；接着以子代DNA为模板再次合成，如此反复循环十数次，最终将原始模板放大数百万倍。（2）PCR的基本步骤1.反应体系：包括模板DNA，耐热DNA聚合酶，两种引物，4种dNTP和含有镁离

5、子的缓冲液。2.反应过程变性:将反应体系加热加热到9495度，持续30秒左右，使待扩增DNA完全解链成单链。退火：使温度迅速下降到适宜温度并维持30秒，使引物与模板DNA两条链的3端互补配对。退火温度由引物Tm决定，一般比引物的Tm低5度，其范围常在5568度。延伸：将反应体系温度升高到72度，此时DNA聚合酶将以单链DNA为模板，将单核甘酸逐个添加到引物的3端，使新链不断延长，直至合成结束。（3）PCR种类：反转录PCR，定量RT-PCR，实时荧光定量PCR，多重PCR,巢式PCR,反向PCR,原位PCR5、基因组DNA提取的原理（主要应用的试剂和作用）SDS蛋白酶法：主要用于提取动物组织细

6、胞的基因组DNA。（1）首先利用含有SDS、蛋白酶K等成分的DNA抽提缓冲液作用于组织匀浆液，以充分裂解细胞，破坏染色体结构，并使组蛋白及其他胞内蛋白质变性、降解，释放出游离的DNA；（2）用酚/氯仿、氯仿/异戊醇等有机溶剂依此抽提，除去水相中的蛋白质、酚等杂质；（3）最后以乙醇或异丙醇沉淀水相即可得到较纯的基因组 DNA。抽提缓冲液中的RNA酶可降解胞内RNA，乙二胺四乙酸（EDTA）则能有效抑制DNA酶的活性，防止DNA的降解。CTAB法与SDS蛋白酶法提取DNA的过程相似。6、RT-PCR反应体系中包括哪些试剂？他们的作用如何？1.RNA提取试剂：迅速破碎细胞并抑制细胞内RNase的同时

7、，使核蛋白复合物变性，释放RNA。2.反转录酶：以mRNA为模板合成cDNA。3.第一链合成试剂盒：合成cDNA。4.RT-PCR引物：催化游离dNTP之间相互聚合。5.dNTP：为扩增DNA的原料。 6.Taq ：在高热条件下，催化聚合反应。生物化学与分子生物学实习指导（中文版）生物化学与分子生物学实习指导实验一 蛋白质含量测定(比色分析法和分光光度法)实验二 从小鼠肝脏中提取DNA实验三 DNA酶解及DNA片段琼脂糖凝胶电泳实验四 现代PCR技术 实验五 人血清抗胰蛋白酶（1AT）的分离及鉴定 内容一 盐析法，凝胶过滤法 内容二 纤维素离子交换层析，蛋白含量测定，酶活性测定 内容

8、三 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 内容四 总结实验六 酶的特异性、激动剂、抑制剂实验七 温度、pH对酶促反应速度的影响实验八 运动对尿中乳酸含量的影响实验九 肝糖原实验实验十 肝脂质的提取及薄层层析 实验一 蛋白质含量测定(比色分析法和分光光度法)【目的要求】1. 掌握比色分析法和分光光度法基本原理、标准曲线的制作及使用，标准管法结果计算2. 熟悉蛋白质含量测定常用方法、原理及应用3. 了解常用可见光、紫外分光光度计的测定原理及使用【教学内容】1. 酚试剂法蛋白质含量测定Lambert-Beer定律，比色分析法和分光光度法基本原理, 722型分光光度计使用，常用蛋白质含量测定方法及应用，酚试剂法

9、测定蛋白质含量原理、操作, 标准曲线的制备及使用2. 双缩脲法蛋白质含量测定自学和独立完成实验并与酚试剂法比较，结果计算3. 紫外分光光度法蛋白质含量测定紫外分光光度法测定蛋白质含量原理，方法，优缺点，注意事项；国产752型紫外分光光度计使用，UV260分光光度计使用，注意事项，波长扫描，标准曲线制作【实验原理】一、比色分析法许多物质本身具有一定的颜色，也有许多物质本身无颜色，在加入适当的显色剂后生成有色物质。溶液浓度越大，颜色越深。因此可以利用比较溶液颜色深浅的方法来测定有色溶液的浓度。这种方法叫比色分析法。 1. 物质的颜色和波长： 可见光：波长（）400760nm紫外光：小于400nm红

10、外光：大于760nm 光的互补：将两种适当颜色的可见光按一定强度比例混合可得到白光，这两种光叫互补光，该现象叫光的互补。 单色光：白光通过棱镜后可分解成各种波长不同的色光，把具有一种波长，不能再分解的光叫单色光。2. 溶液的颜色和光吸收的关系：溶液的颜色，是由于不同的有色物质有选择地吸收某种颜色的光而引起的。溶液呈现的颜色是与它主要吸收的光相互补的光的颜色。溶液吸收的光越多，呈现的颜色越深。例如：一束白光通过核黄素溶液，溶液呈黄色，是因为蓝色光被吸收，而其它颜色的光均为两两互补，透过光只多余出黄色光，所以核黄素溶液呈黄色。光吸收曲线：测定同一物质对不同波长光线的吸收程度，以波长为横坐标，光密度

11、为纵坐标作图，所得曲线为光吸收曲线。3. 物质浓度，液层厚度与光吸收的关系（Lambert-Beer定律）：当一束单色光通过溶液后，光被溶液吸收的程度（D）与溶液的浓度（C），液层的厚（L）以及入射光的强度（I0）有关。溶液浓度越大，液层越厚，吸光越多，这就是物质（均匀透明固体，液体，气体）对光的吸收定律。lg I0 / I 意义：当I = I0 时，lg I0 / I=0，表示溶液完全不吸收光线；当II0时，lg I0 / I值较大，表示溶液对光吸收较多；当I0 时，lg I0 / I值无穷大，表示光线几乎被溶液完全吸收（溶液不透光）。由此可见，lg I0 / I表示了溶液对光的吸收程度。表

12、示方法： 光密度OD或D（opticaldensity） 吸光度A（Absorbance） 消光度E（Extinction）于是，(3)式可写成：D = KCL公式中K为消光系数，K = D/CL，表示有色溶液在单位浓度和单位厚度时的吸光度。同一溶质，K值相同。百分消光系数：C = 1%，L = 1cm克分子消光系数：C = 1克分子浓度，L=1cmD=KCL意义：物质对光吸收程度与该物质的消光系数K，溶液浓度C，液层厚度L成正比。4. 待测溶液浓度的计算：（1）标准管法：在同样条件下，测得标准液和待测液的光密度（D）值，然后计算：标准液：Ds = KsCsLs待测液：Du = KuCuLu其

13、中，Ls = Lu，Ks = Lu， Ds/Du = Cs/CuCu =（Du/Ds）×Cs（2）标准曲线法：分析大批待测样品时，采用此法较方便。先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，测出它们的光密度（D）值。在一定浓度范围内，溶液浓度（C）与其光密度（D）之间呈直线关系。以各管D为纵坐标，C为横坐标，绘制标准曲线。待测溶液D值测出后，在曲线上查出C。（3）标准系数法：多次测定标准溶液的光密度后求出平均值，标准系数 = 标准液浓度/标准液平均光密度，同法测出待测液的光密度代入下式：C = 待测溶液光密度×标准系数（4）消光系数法：1%浓度，1cm厚度溶液中测得：K = E1c

14、m1%或克分子浓度，cm厚度溶液中测得：K = C = D/E1cm%, 或 C = D/ 常用于紫外吸收法测定蛋白质，核酸含量，二者分别在280nm和260nm处有最大吸收，其消光系数可查到，在同样条件下，测定待测溶液的光密度, 带入上式即可求得C。优点：可直接测定，不需呈色，不损失样品, 操作简便注意：选择1cm石英比色杯（玻璃杯在紫外光区强烈吸收紫外光，不能使用）二、比色分析的测定方法1. 比色分析法： 原理：白光透过滤光板后，可得到近似的单色光，让单色光透过有色溶液，然后射到光电池上，光电池受光放出电子，所产生的电流与光的强度成正比关系。利用滤光板可获得近似的单色光，波长范围30-50

15、nm。滤光板最易透过的光是有色溶液最易吸收的光。一般说来，选择滤光板的颜色应与被测溶液的颜色为互补色。2. 分光光度法：分光光度法使用分光光度计，利用棱镜或光栅获得单色光，波长范围3-5nm，所以比比色分析法的灵敏度，准确度和选择性都要高。三、比色分析条件的选择1. 波长的选择：原则“吸收最大，干扰最小”例：A，B两种物质，A物质最大吸收峰在a处，B物质在a处也有吸收，对A物质的测定有干扰，故选b处波长进行比色测定以满足以上原则。2. 光密度的选择：D值读数在检流计标尺中部时，准确度较高，相对误差最小。一般D = 0.0513. 显色条件的选择：比色分析中，常需要利用空白溶液调节仪器的透光率为

16、100%，此时D为0。空白溶液仅仅不含被测物质，而其它溶液，试剂和处理条件与被测溶液完全相同。因此，利用空白溶液可消除显色溶液中其它有色物质的干扰，抵消比色杯和试剂对入射光的影响。四、722型分光光度计的使用1. 选择波长 2比色杯：（1）液体3/42/3，不可过多或过少。（2）用擦镜纸擦干外表面液体。3. 灵敏度：调整后不再动。4. 将装有空白溶液的比色杯放入光路。原则：开盖调“D = 0”，关盖调“T = 100”。五、752型紫外可见分光光度计的使用1. 选择波长2比色杯：测蛋白、核酸时使用石英比色杯，专机专用，余同上。3. 灵敏度：调整后不再动。4. 注意：测蛋白、核酸时，开氘灯。六、

17、蛋白质的测定常用方法：1. 根据蛋白质含氮量进行测定的定氮法。2. 根据蛋白质结构或组成的紫外吸收特性进行测定的紫外分光光度法。3. 根据蛋白质与不同呈色试剂反应而进行测定的比色法。【实验内容】 一、酚试剂法（Folin Method）原理：蛋白质中肽键在碱性溶液中与铜离子形成络合物，此络合物能使酚试剂中的磷钼酸还原产生兰色化合物；同时，蛋白质中的酪氨酸、色氨酸也能与酚试剂的磷钼酸，磷钨酸作用产生兰色化合物，颜色深浅与蛋白质的含量成正比。试剂：1. 碱性铜液2. 酚试剂3. 0.9% NaCl4. 标准牛血清白蛋白溶液（1）操作步骤：1取上述牛血清白蛋白溶液1.0ml用0.9% NaCl稀释1

18、0倍后，按下表操作：温放置20分钟，每管加酚试剂0.5毫升，立即混匀3室温放置30分钟后，以第6管为空白管，选波长650nm比色，读取光密度。二、双缩脲法（Biuret Method）原理：凡具有两个以上肽键（CO-NH）的物质，在碱性溶液中与铜离子反应，形成紫红色络合物，称双缩脲反应。由于蛋白质含有肽键，也能发生双缩脲反应，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。试剂：1. 双缩脲试剂2. 0.9% NaCl3标准血清4待测血清步骤：1取3支干净的试管按下表操作：2混匀，30分钟后以第3管为空白管，用520nm波长比色，读取光密度。3计算： 蛋白质含量g% = （Du/Ds）×标准蛋白浓度【注

19、意事项】1 试管洗刷干净，刻度吸管专管专用2 双缩脲法和酚试剂法两个实验的波长分别为520nm和650nm，测定时注意转换波长3 比色测定时，勿触及比色杯光面 实验二 从小鼠肝脏中提取DNA【目的要求】1. 掌握DNA分离的原理、各试剂作用及操作过程2. 掌握肝匀浆制备及注意事项 3. 熟悉DNA浓度、纯度测定原理及方法, 仪器使用4. 了解分子生物学实验技术(录像)【教学内容】1. 从肝中提取DNA 小鼠处死方法, 试剂配制, 离心机使用, 肝匀浆制备, DNA分离纯化原理及注意事项2. DNA浓度、纯度测定原理及方法,仪器使用3. (录像带教学) 核酸分离纯化, DNA序列测定, 核酸探针

20、标记与分子杂交【实验原理】1生物组织中DNA是以DNA-蛋白质复合物的形式存在2在稀NaCl溶液中，DNA-蛋白质溶解度小，RNA-蛋白质溶解度大; 在浓NaCl溶液中，DNA-蛋白质溶解度大，RNA-蛋白质溶解度小（分开DNA和RNA）3SDS（十二烷基硫酸钠），使蛋白质变性（分开DNA和蛋白质）（1）SDS是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质的疏水部位;（2）SDS可引起蛋白质构象改变（3）SDS是一种良好的解离剂，可使蛋白质溶解，变性（4）形成SDS-蛋白质复合物，并使复合物带负电4氯仿-异丙醇可以将蛋白质除去5适量的冷无水乙醇可使DNA析出。6防止DNA

21、酶解的办法加入EDTA - 2Na（乙二胺四乙酸二钠）7检查DNA纯度：A260/A280（1） A260/A280 1.8，高纯度DNA（2） A260/A280 < 1.8，含蛋白质（3） A260/A280 > 1.8，含RNA【试剂】(1) 0.14M NaCl，0.1M EDTA(2) 5M NaCl (3) 30% SDS (4) 氯仿-异丙醇 (5) 0.015M NaCl-0.0015M柠檬酸钠(6) 冷无水乙醇【步骤】一提取脱氧核糖核蛋白1.杀鼠取肝3克（23只小鼠），15ml 0.14M NaCl，0.1M EDTA洗去血液2.肝匀浆制备（1）乳钵中剪碎（2）1

22、5ml 0.14M NaCl，0.1M EDTA（3）不要用力研磨3.离心3000rpm 10分钟，弃上清 沉淀加入0.14M NaCl，0.1M EDTA 15ml轻轻悬起 离心 3000rpm 10分钟，弃上清 沉淀加入0.14M NaCl，0.1M EDTA 10ml 使之溶解，转至50毫升三角烧瓶中 二除蛋白质1.加入30% SDS 1ml 混匀，60水浴轻摇15分钟，取出冷至室温2. 5M NaCl 2.75ml, 轻摇10分钟3.氯仿-异丙醇19ml（沉淀蛋白）,轻摇20分钟,离心 2500rpm 10分 三粗提DNA1. 吸上清（水相）转入玻璃离心管（含DNA）, 弃沉淀（剩余物

23、）2. 加入1.5倍体积冰乙醇（无水乙醇）轻摇至DNA析出四 检测1用镊子或玻璃棒取出置试管中，加入0.015M NaCl-0.0015M柠檬酸钠1毫升2稀释适当倍数：量取10-50l (用0.1ml刻度吸管吸取) 原液，用0.015M NaCl-0.0015 M柠檬酸钠稀释到5ml（稀释100-500倍）3测A260/A280（用0.015M NaCl-0.0015M柠檬酸钠做空白溶液）五计算1.DNA浓度：（g/ml）=A260×50×稀释倍数2.DNA纯度：A260/A280【注意事项】1. 研磨时上下用力，尽量避免DNA链断裂。2加入氯仿异丙醇后勿剧烈摇动，以免大分

24、子断裂。3有机溶剂对人体有害，操作时要注意。 实验三 DNA酶解及DNA片段琼脂糖凝胶电泳【目的要求】1. 掌握限制性核酸内切酶概念、特点及作用原理，DNA酶解技术的应用2. 掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段原理及其操作3. 熟悉电泳基本原理及其影响因素【教学内容】1限制性核酸内切酶概念、特点及作用原理，DNA酶解技术的应用2DNA片段琼脂糖凝胶电泳3电泳概念、分类、应用、基本原理及其影响因素, 琼脂糖凝胶制备、加样、电泳及结果分析【实验】一DNA酶解原理：1.限制性核酸内切酶：是一类能识别并水解双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。一般能识别4-6个碱基对，并在特定位点切割。如：Hind A

25、A G C T T EcoR GA A T T C Hpu CC G G2.酶单位数：在最适温度、PH条件下，1小时完全水解1gDNA所需的酶量为1个单位。试剂：(1)DNA（0.38g/l） (2) Hind (16u/l)(3) 酶解Buffer(Tris-HCl,NaCl,MgCl2,DTT )(4) 反应终止液（溴酚蓝1%，SDS 1%，EDTA 2%，甘油50%） 方法：1. 取两只EP管（1）DNA 10l，双蒸水 10l （2）DNA 10l，Hind 10l 充分混匀 2. 37水浴2小时。 3. 保温结束后加入终止液5l。二. 琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段（水平潜水式）原理：

26、1 DNA含有PO43-基团，在pH7.5 Buffer中带负电, 在电场中向正极移动。由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相同，自由电泳时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开2 选用适当浓度的凝胶作为支持物，使之具备一定的孔径，即可发挥分子筛效应（凝胶孔径对大小不同的分子有不同的阻力），使大小不同的核酸片段迁移率出现较大差异，达到分离的目的，同样条件对Maker电泳，对比观察DNA酶解效果3 DNA经溴乙锭（EB）染色，溴乙锭可以插入DNA双螺旋结构两个碱基之间，与核酸形成络合物，在紫外（300nm,360nm）激发下，产生桔黄色荧光（590 nm可见光）。标准Maker经溴乙锭（EB）

27、染色可以观察到6条带，分别为: 23Kb, 9.9Kb, 4.4Kb, 4.3Kb, 2.2Kb, 2.0Kb试剂：（1）1%琼脂糖（2）TAE液（3）Marker（4）EB 方法：1. 电泳仪接线：黑（负）黑，红（正）红2凝胶槽准备：用胶布固定胶槽两侧，调整梳子高度距离槽底2-3毫米，调好水平。3灌胶：(1) 称取0.8克琼脂糖,加入80毫升TAE中,热浴溶解至透明(2) 60左右加入EB100l(终浓度0.5g/ml), 倒入备好的凝胶槽中。应注意胶面平整,无气泡(3) 冷却后,拔去梳子4加样: (1) 去掉胶布，将灌好的胶板平放在电泳槽中 (2) 加入电极Buffer使之高出胶面(1-3

28、毫米) (3) 用进样器吸样品20l加入样品槽中5电泳: v = 100V, 1-1.5小时,至溴酚蓝移出2/36观察: (戴手套)紫外灯下（254-365nm）, 暗处观察, 记录。可见DNA橙红色区带【注意事项】1在EP管加入试剂时要用漩涡混合器混合后离心。2琼脂糖凝胶电泳时加样侧应位于负极端。3溴乙锭可引起基因突变，操作时要注意个人防护。4紫外光对人眼有害，观察时加盖玻璃罩，观察时间不宜太长。 实验四 PCR技术【目的要求】1掌握PCR技术概念、原理、方法及应用2熟悉PCR仪的使用及注意事项3了解TaqDNA聚合酶的来源和特点，引物的设计原则4了解现代PCR技术的扩展【教学内容】1PCR

29、技术概念、原理、方法、应用及技术扩展2TaqDNA聚合酶的来源和特点，引物的设计原则3PCR仪的使用及注意事项4模板的制备【实验】原理：以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5末端和3末端相互补的寡核苷酸片断为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制机制沿着模板链延伸至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片断得到扩增。PCR技术实际上是在摸板DNA，引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应。试剂：1.Taq DNA聚合酶2.dNTP3.引物4.模板5.缓冲液(50mmol/L,10mmol/L,Tris-HCl,1.5mmol/L MgCl2)步骤

30、：1将PCR反应组分放在冰上解冻，并进行短时间离心以使组分沉降管底2根据下列顺序在PCR反应管中加入各反应组分：3将反应组分混匀后，加入50l 石蜡油，离心数秒4根据下列参数进行PCR扩增：5. 将10l PCR扩增产物（含1×上样缓冲液）点样于1.5-2.0琼脂糖凝胶中，电泳后在紫外灯下观察DNA扩增产物。【PCR技术的应用】1. 在法医学上的应用：一根毛发,一滴血,少量精液,牙齿,口腔上皮细胞可进行DNA鉴定2. 遗传疾病的诊断和治疗：可在怀孕早期获得少量样品(羊水,绒毛)进行扩增, 发现异常的胎儿早期终止妊娠3. 在艾滋病检测中的应用:对于大多数AIDS患者，通过血清学方法检测

31、其血清中HIV-1抗体可特异敏感地加以筛查和诊断，但对于疑似HIV-1感染的病例，早期机体内尚无HIV-1抗体产生，或携带病毒的母亲生产的婴儿是否已感染HIV-1（垂直传播，新生儿体内尚无抗体产生），直接检测病毒则十分必要4. 检测癌基因:可选择性地扩增ras基因百万倍，灵敏度为5-10%，即100个细胞含有5-10个具有ras基因点突变的细胞即可检测出来5. DNA克隆:只要知道目的基因的两侧序列，通过一对和模板DNA互补的引物，就可以十分有效地扩增出所需要的片段6. DNA序列的测定和基因定量7. 考古学的应用【PCR技术的扩展】1. RT-PCR2. 不对称PCR3. 巢式PCR4. 原

32、位PCR5. 反向PCR6. 重组PCR【注意事项】1. 加各试剂时，要注意准确操作2. PCR仪运行时勿随意改动3. 溴乙锭可引起基因突变，操作时要注意个人防护4. 紫外光对人眼有害，观察结果时加盖玻璃罩，观察时间不宜太长 实验五 人血清抗胰蛋白酶（1AT）的分离及鉴定【目的要求】1. 掌握1-AT分离纯化各步骤原理、操作及鉴定方法2. 掌握基本技术操作及仪器使用 3. 熟悉人血清蛋白质的分类方法,1-AT性质4. 了解生物大分子制备技术, 分离纯化类型5. 学会利用学过的分离纯化方法进行基本的科研设计 6练习研究论文基本写作 【教学内容一】分段盐析法，凝胶过滤法（盐析法概念及原理，分段盐析

33、概念，分子筛效应，柱层析基本技术） 【实验原理】1. 盐析法是一种利用蛋白质在高盐溶液中溶解度不同而分离的方法。通过将硫酸铵加入蛋白质溶液中，使蛋白质表面电荷被中和，水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。2. 通过分段改变盐类浓度达到分离目的的方法叫分段盐析法。3. 凝胶过滤又称分子筛层析。混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，分子量大的物质因不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙先被洗脱(阻力小,流程短,流速大),分子量小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞,流速缓慢,流程长而后被洗脱,由于流速不同可以把大小不同的分子分开.【仪器与试剂】1离心机2真空泵3饱和硫酸铵溶液

34、：称取767g固体硫酸铵，加入1000ml水中，加热使之溶解，室温冷却后4静置过夜，然后用氨水将pH调至中性。4固体（NH4）2SO45Sephadex G256奈氏试剂7. 双缩脲试剂8pH7.4, 0.05M PBS【步骤】一 分段盐析1观看人血清抗胰蛋白酶（1AT）的分离及鉴定教学录像2每组量取20ml血清，倒入一干净烧杯中，缓慢加入饱和硫酸铵20ml，边加边搅拌,放入4冰箱30分钟3从冰箱中取出烧杯，将血清倒入离心管，3000rpm，离心20分钟4将上清倒入一干净量筒中，记录体积后，倒入干净烧杯中，按17.6g/100ml量取固体硫酸铵，缓慢加入上清中，边加边搅拌。4冰箱放置30分钟5

35、将烧杯中液体倒入抽滤器中，负压抽滤6刮下滤纸上的粗提蛋白，用4ml缓冲液溶解，准备加样二 凝胶过滤层析1凝胶柱准备：（1）连接层析柱（2）夹住出口，加入1/3体积的0.05M pH6.4 PBS，灌胶，待凝胶自然沉降约1cm时，打开出口，控制流速，60滴/分（3）层析柱填装完成后，连接下口瓶，调节流速，使入口和出口流速相同。平衡至入口pH值与出口pH值相同（即pH试纸呈色相同），关闭出口，等待加样2加样：用吸管吸去胶面以上的缓冲液，立即加入蛋白粗提液（沿管壁缓慢加入）3打开出口，调流速15滴/分，待蛋白粗提液完全进入胶面，用少量缓冲液清洗管壁。连接下口瓶4检测：用双缩脲试剂检测洗脱液。待试剂变

36、红，开始收集，直到试剂不变色停止收集。测量并记录收集液的体积，留取1ml样品（标记为G25样品），放入一冷冻管中冰箱冻存；剩余的液体收集入一大试管中，作好标记，下次实验用5洗去铵盐：全速洗脱，用奈氏试剂检测洗脱液，直到橙色消失为止，回收凝胶【注意事项】1盐析所用器皿一定要干燥2盐析时，应将饱和硫酸铵或固体硫酸铵加入到血清中，且边加边搅拌3层析柱上方要留有少量液体，避免使凝胶暴露于空气中4凝胶过滤上样时，使样品沿管壁缓缓流下，勿冲破胶面 【教学内容二】DEAE-纤维素离子交换层析(离子交换层析概念, 交换剂的组成，分类, 交换剂的选择，离子交换层析基本原理, 分离1-AT原理及操作过程, 注意事

37、项, 洗脱方式及意义)。酶活性测定，蛋白质定量 【原理】1. DEAE-cellulose离子交换层析： DEAE-cellulose是应用最广的阴离子交换剂，本身带有正电荷，能不同程度的吸附溶液中的阴离子。层析时使用不同离子强度或不同pH值的缓冲溶液进行分段洗脱，含负电荷少的离子首先被洗脱下来，含负电荷多的蛋白质后被洗脱下来，于是不同蛋白质被分开。2. 1AT活力测定：1AT的活力是通过检测它对胰蛋白酶的抑制力而测定的。胰蛋白酶可以水解低分子底物苯甲酰精氨酰对硝基苯胺，产生黄色产物对硝基苯胺，颜色深浅与胰蛋白酶活力成正比。将各步纯化的1-AT样品与一定量的胰蛋白酶溶液反应，检测胰蛋白酶剩余活

38、力，该剩余活力与1-AT活力成负相关。【仪器】1722分光光度计2恒温水浴【试剂】1DEAE-纤维素2样品：由G-25除盐的1-AT粗提液30.05mol/L pH6.4磷酸缓冲液；0.12mol/L pH6.4磷酸缓冲液40.5mol/L NaCl50.5mol/L HCl6胰蛋白酶液：取3mg胰蛋白酶溶解于16.6ml pH3水中，浓度为180g/ml70.05mol/L pH8.2 Tris-HCl缓冲液，内含0.02mol/LCaCl28苯甲酰精氨酰对硝基苯胺（简称BAPNA）, 取18mg BAPNA溶解于10ml甲醇中, 加Tris-HCl缓冲液到50ml933 %乙酸【步骤】一

39、DEAE-cellulose离子交换层析1. 观看教学录像 2. 取出上次课的粗提样品，低温解冻3. 装柱（方法同凝胶过滤层析），用0.05mol/L pH6.4磷酸盐缓冲液平衡4. 加样及洗脱，流速15滴/分。5. 用双缩脲试剂检测洗脱液，出现红色，为第一蛋白峰，不收集，继续检测直至洗脱液无蛋白质 6. 换0.12mol/L pH6.4磷酸缓冲液继续洗脱，待第二次出现红色，为第二蛋白峰，收集，直至红色消失。量取体积，记录，放4冰箱待用（标记为DEAE样品）。二 1AT活力测定（1）取5支干净试管按下表操作： （2）410nm比色，记录数据。三 蛋白定量双缩脲法【注意事项】1上样前，层析柱要达到平衡2上