人骨肉瘤耐阿霉素细胞模型的建立及其生物学特性

1、中国组织工程研究与临床康复 第 15卷 第 37期 2011 09 10出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research September 10, 2011 Vol.15, No.37 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 6913 1Department of Orthopedics, Ninth Peoples Hospital of Chongqing,Chongqing 400700, China; 2Department of Orthopedics,Sec

2、ond Affiliated Hospital ofChongqing Medical University,Chongqing 40010, ChinaChen Yu , Doctor, Attending physician, Department of Orthopedics, Ninth Peoples Hospital of Chongqing,Chongqing 400700, Chinachenyu Correspondence to: Deng Zhong-liang, Doctor, Professor, Department of Orthopedics, Second A

3、ffiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 40010, Chinadeng7586gmail. comSupported by: the National NaturalScience Foundation of China, No.30772211*Received: 2011-06-10 Accepted: 2011-07-30人骨肉瘤耐阿霉素细胞模型的建立及其生物学特性 *陈 渝 1,王大勇 1,翁 政 1,邓忠良 2Establishment of adriamycin-resistant human os

4、teosarcoma cell line and research on its biological characteristicsChen Yu1, Wang Da-yong1, Weng Zheng1, Deng Zhong-liang2AbstractBACKGROUND: Multidrug resistance is a major factor leading to the failure of chemotherapy for human osteosarcoma. However,the precise mechanism remains poorly understood.

5、OBJECTIVE: To establish adriamycin-resistant human osteosarcoma cell line 143B/ADM and to analyze its biological characteristics.METHODS: Increasing concentrations of adriamycin (ADM were applied for 45 days to establish 143B/ADM resistant strain. Thehalf of inhibiting concentrations (IC50 and resis

6、tance indexs (RI of different antitumor drugs were measured by CCK assay, andthe cell cycle was analyzed by flow cytometry. The cellular efflux capacity was estimated by rhodamine test. After the cell lineswere treated by ADM, intracellular ADM concentration was detected by fluorospectrophotometer,

7、and the apoptosis wasobserved by laser scanning confocal microscope and flow cytometry. Meanwhile, the expression of multidrug resistance 1(MDR-1, multidrug resistance-associated protein 1 (MRP-1 and lung resistance protein (LRP were detected by western blotanalysis.RESULTS AND CONCLUSION: After ind

8、uction for 45 days, the RI of 143B/ADM cells to ADM was 15.7, and the 143B/ADM cellsshowed various resistances to cisplatin, methotrexate, isophosphamide, vincristine and taxinol. Compared with 143B/WT cell line,there were less cells in G2/M phase and more cells in G1 and S phases, markedly decrease

9、d intracellular rho123 and ADM in143B/ADM cell line (P 0.01. Flow cytometry and confocal laser microscopy analysis showed that at 72 hours after treatmentwith ADM (10 mg/L, cell apoptosis in 143B/ADM cells was less than that in 143B/WT cells. Furthermore, compared with143B/WT, the MDR-1 expression o

10、f 143B/ADM was increased significantly with no difference of MRP-1 and LRP expressionamong both cell lines. Multidrug resistance of 143B/ADM cells is related to MDR-1, and has no relationship with MRP-1 and LRP.Chen Y, Wang DY, Weng Z, Deng ZL.Establishment of adriamycin-resistant human osteosarcoma

11、 cell line and research on itsbiological characteristics. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(37: 6913-6918. 摘要背景:多药耐药是骨肉瘤化疗失败的重要原因,目前其耐药机制不明。目的:诱导建立耐阿霉素的人骨肉瘤细胞株并观察多药耐药蛋白 1、多药耐药相关蛋白 1和肺耐药蛋白的表达。方法:采用逐步递增阿霉素浓度间歇作用的方法诱导 143B/WT细胞株建立 143B/阿霉素耐药细胞株。结果与结论:经阿霉素诱导 45 d建立了 143B/阿霉素细胞

12、株,其对阿霉素高度耐药,对顺铂、甲氨蝶呤、异环磷酰胺、长春新碱和紫杉醇亦产生不同程度交叉耐药;流式细胞仪检测显示与 143B 野生型细胞相比, 143B/阿霉素细胞周期中 G 1和 S 期所占比例增加,而 G 2/M期所占比例明显减少;罗丹明外排实验显示, 143B/阿霉素细胞药物外排能力显著高于143B/WT细胞 (P 0.01;流式细胞仪和激光共聚焦显微镜观察发现, 143B/阿霉素细胞阿霉素相关性细胞凋亡率显著低于 143B/WT(P 0.01; Western blot检测显示 143B/阿霉素细胞多药耐药蛋白 1表达水平较 143B/WT显著升高 (P 0.05。提示 143B/阿霉

13、素细胞多药耐药的产生与多药耐药蛋白 1表达升高相关。关键词:骨肉瘤;阿霉素;多药耐药;多药耐药蛋白 1;细胞模型陈渝,王大勇,翁政,邓忠良 . 人骨肉瘤耐阿霉素细胞模型的建立及其生物学特性 J.中国组织工程研究与临床康复, 2011, 15(37:6913-6918. 0 引言多药耐药现象是由一种化疗药物诱发,肿 瘤组织对该药产生耐药的同时对其他结构和功 能无关的化疗药物产生交叉耐药的现象。多药 耐药的发生是影响肿瘤患者化疗效果、预后的 主 要 因 素 之 一 1-2。 多 药 耐 药 (multidrug resistance, MDR蛋白 1(MDR

14、-1、多药耐药相 关 蛋 白 1(multidrug resistance-associated protein 1, MRP-1和 肺 耐 药 蛋 白 (lung resistance protein, LRP是多药耐药基因编码 的主要产物。研究发现, MRP-1、 LRP 和 MDR-1在多种耐药性肿瘤中表达升高,其表达水平与 肿瘤耐药性密切相关 3-5。实验拟采取阿霉素 (doxorubicin, ADM为 诱导药物,以人骨肉瘤细胞株 143B 为研究对 象,采用逐步递增 ADM 浓度间歇作用方法建立 人骨肉瘤多药耐药细胞株,并初步探讨其耐药 机制。万方数据陈渝,等 . 人骨肉瘤耐阿霉素

15、细胞模型的建立及其生物学特性6914www. CRTER .org1重庆市第九人民 医院骨科,重庆市 400700; 2重庆医 科大学附属第二 医院骨科,重庆市 400010陈渝,男, 1977年生,四川省资阳 市人,汉族, 2011年重庆医科大学 毕业,博士,主治 医师,主要从事骨 肿瘤耐药机制的 研究。中图分类号 :R318 文献标识码 :B文章编号 :1673-8225 (201137-06913-06收稿日期:2011-06-10修回日期:2011-07-30 (20110610016/WLM S1 材料和方法设计:随机对照细胞学实验。时间和地点:于 2009-03/07在重庆医科大

16、学生物化学与分子药理学实验室完成。材料:细胞株:人骨肉瘤细胞株 143B 由芝加哥大学医学中心分子肿瘤实验室保存。主要试剂和仪器:方法:人骨肉瘤 143B/WT细胞的原代培养:人骨肉瘤143B/WT细胞在 37 、体积分数 5%CO2条件 下 , 培 养 于 含 体 积 分 数 10%胎 牛 血 清 、 1105U/L青霉素和 100 mg/L链霉素的 DMEM 培养液中。 1 g/L胰蛋白酶消化传代。耐药细胞的诱导:采用逐步递增 ADM 浓度、间歇作用的方法诱导肿瘤细胞耐药 6。取稳定 传代 20代的对数生长期 143B/WT细胞接种至 含 ADM 的 DMEM 培养液中,从 0.01 mg

17、/L ADM开始,作用 48 h后弃去含药培养液,加入新鲜 培养液,继续培养,待其恢复正常生长,消化 传代后复用 0.1 mg/L ADM处理 48 h,如此反复 换液、传代,逐步提高 ADM 浓度间歇诱导,得 到 能 耐 受 1 mg/L ADM的 细 胞 株 , 命 名 为 143B/ADM, 并 将 其 维 持 培 养 在 含 0.1 mg/L ADM 的完全培养液中。耐药诱导历时 45 d。 CCK-8法检测 143B/ADM细胞株对化疗药物的敏感性:将处于对数生长期的细胞经 1.25 g/L胰酶消化后离心,用 DMEM 培养液制备成浓度 5108L-1的单细胞悬液,分别接种于 96孔

18、板, 200 L/孔。培养 72 h后分别加入不同质量浓度(0.01, 0.1, 1, 10, 100, 1 000 mg/L的化疗 药物 (ADM、顺铂、甲氨蝶呤、异环磷酰胺、紫 杉醇和长春新碱 ,并设 5个复孔, 37 ,体积 分数 5%CO2条件下培养 72 h。每孔加入 20 L的 CCK-8, 37 下继续培养 2 h ,酶标仪检测 波长 450 nm处每孔的吸光度 (A 450 值。以药物 浓度为横轴,抑制率 抑制率 =(1-实验孔 A 450/对 照孔 A 450100%为纵轴绘制浓度-效应曲线, 确定半数抑制浓度 (IC50 ,计算耐药指数。耐药 指数 =耐药细胞 IC 50/

19、亲代细胞 IC 50。荧光分光光度计检测细胞内 ADM 浓度:骨肉瘤细胞以 105/孔接种于 12孔板, 10 mg/L ADM 处 理 1 h 后弃培养基,以冰 PBS 洗涤 3次,加入无 ADM 培养基继续培养 2 h后弃培养基,冰 PBS 洗 涤 3次 , 加 含 体 积 分 数 1%Triton-X的 PBS 0.5 mL裂解细胞, BCA 法测细胞裂解液总蛋白 浓度 7。另取 200 L细胞裂解液,荧光分光光 度计检测荧光强度,激发波长 478 nm,发射波 长 594 nm,根据标准曲线计算细胞内 ADM 浓 度,并以总蛋白浓度标准化。流式细胞仪测定细胞周期分布及细胞凋亡:将对数生

20、长期细胞接种于 6孔板中常规培养 24 h使其同步化后,换含正常或含 10 mg/L ADM的 细胞培养液继续培养 72 h,消化收集细胞。离 心沉淀后用 0.3 mL含体积分数 5%小牛血清的 PBS 悬浮,移入 1.5 mL EP管中,加入 0.7 mL无水乙醇,置-20 固定 24 h。 3 000 r/min离 心 30 s,弃上清,用 1 mL PBS重悬细胞,再离 心 洗 涤 细 胞 1次 , 沉 淀 细 胞 用 100 L 1 g/LRNase A悬 浮 , 37 消化 30 min,再加入 400 L 50 mg/L碘化丙啶,置暗处 10 min检测。 以流式细胞仪检测细胞周期

21、及细胞凋亡率。激光共聚焦显微镜检测细胞凋亡:以 10 mg/L的 ADM 处理 143B/WT和 143B/ADM细 胞 72 h后, PBS 洗涤贴壁细胞 1次 , 并 消 化 细 胞 , 1 000 g 离心 5 min收集细胞, PBS 重悬细胞。 取 (510104个细胞重悬, 1 000 g 离心 5 min, 弃上清,加入 195 L Annexin V-FITC 结合液 (1重悬细胞。加入 5 L Annexin V-FITC ,轻 轻混匀。室温避光孵育 10 min。 1 000 g 离心 5 min,弃上清,加入 190 L Annexin V-FITC 结合液 (1重悬细胞

22、,再加入 10 L 碘化丙啶染 色液,轻轻混匀。于激光共聚焦显微镜下双色 滤光片观察细胞凋亡情况。Western blot检测 MDR-1, MRP-1和 LRP 的表 达:143B 或 143B/ADM细胞弃去培养基后, PBS洗 3次,加入预冷的 20 mmol/L的细胞裂解液,试剂及仪器 来源ADM(批号:73L017-E 甲氨喋啶 (批号:080607A 长春新碱 (批号:0803E1 紫杉醇 (批号:080509 罗丹明 123 细胞计数试剂盒 8 流式 AnnexinV-FITC/PI凋亡 检测试剂盒 MDR-1, MRP-1, LRP 和 -actin 单克隆抗体 激光共聚焦显微

23、镜 流式细胞仪 Model 550酶标仪 Lumat LB 9507荧光分光光度计 意大利法玛西亚制药厂上海华联制药厂 深圳万乐药业有限公司 南京德宝生化公司美国 Sigma 公司江苏南京碧云天公司 江苏南京凯基生物 美国 Chemicon 公司德国 LEICA 公司 美国 BD 公司 美国 Bio-Rad 公司德国 EG&GBERTHOLD 公司万方数据陈渝,等 . 人骨肉瘤耐阿霉素细胞模型的建立及其生物学特性 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH6915www. CRTER.org冰上孵育 30 min后,用细胞刮刮起细胞并转移至 EP 管 中

24、,超声破碎, 4 , 12 000 g 离心 10 min,收集上清。 取上清, BCA 法蛋白定量,把样品调成相同浓度备用。 取蛋白样品行 SDS-PAGE 电泳,电转移至硝酸纤维素膜 上。 5%脱脂奶粉封闭 2 h,按 1 200的浓度加入一抗, 37 孵育 2 h,洗 3次,每次 5 min。 1 5 000的浓度加 入二抗, 37 孵育 1 h,洗膜 5次,每次 5 min。化学发 光试剂反应 2 min,凝胶成像系统摄像,采用 Quantity One 图像分析软件进行图像分析。以 MDR-1、 MRP-1和 LRP 吸光度值与 -actin 吸光度值比值表示蛋白表达 水平。比值越大

25、,则蛋白表达越高。细胞内罗丹明积蓄实验:罗丹明摄入实验:取 1109 L-1单细胞悬液加 Rh123至终浓度为 1 mg/L, 37 孵育 1 h,离心后 PBS 洗 3次, 4 ,流式细胞仪检测细胞内 Rh123荧光强度。罗丹明渗出实验:取 1109 L-1单细胞悬液加 Rh123至终浓度为 1 mg/L, 37 孵育 1 h,离心后 PBS 洗 3次, 重悬于不含 Rh123的培养基中 2 h, PBS 洗涤 3次, 4 , 流式细胞仪检测细胞内 Rh123荧光强度。主要观察指标:143B/ADM细胞的耐药性,细胞周 期的变化,药物的外排能力、凋亡情况及 MRP -1、 LRP 和 MDR

26、-1的表达。统计学分析:所有实验结果用 x _s 表示,采用 SPSS 12.0统 计 软 件 包 进 行 单 因 素 方 差 分 析 , 组 间 比 较 用 LSD-t 检验, P 0.05为差异有显著性意义。2 结果2.1 人骨肉瘤 143B/ADM细胞药物敏感性与多药耐药 特性 CCK-8检测结果表明, 143B/ADM细胞对 ADM 高 度耐药,对顺铂、甲氨蝶呤、异环磷酰胺、紫杉醇和长 春新碱亦存在不同程度交叉耐药,见表 1。2.2 荧 光 分 光 光 度 计 测 得 的 细 胞 内 ADM 浓 度 结 果 143B/WT细胞内 ADM 浓度为 (1 151.35125.77 mg/g

27、, 143B/ADM细胞内 ADM 浓度为 (317.0943.24 mg/g, 显著低于 143B/WT细胞 (P 0.05。2.3 ADM对细胞凋亡的影响 通过激光共聚焦显微镜 观察 ADM 对细胞凋亡的影响,用 Annexin V-FITC 和碘化 丙啶染色后,正常活细胞不会被 Annexin V-FITC 和碘化 丙啶染色;凋亡早期的细胞仅被 Annexin V-FITC 染色, 而碘化丙啶染色呈阴性;而死细胞和凋亡晚期的细胞可 同时被 Annexin V-FITC和碘化丙啶染色。 实验显示, ADM 处理 72 h后, 143B/WT细胞凋亡明显高于 143BADM 细 胞,见图 1

28、。流式细胞仪检测结果显示:143B/WT细胞凋亡率为 (79.810.6%, 143B/ADM细胞凋亡率为 (28.67.3%, 显著低于 143B/WT细胞 (P 0.01,见图 2。Green was Annexin V; red was PI; yellow was overlayFigure 1 Effect of adriamycin (ADM on cell apoptosismeasured by fluorescence microscope 图 1 荧光显微镜检测阿霉素对细胞凋亡的影响143B/WT143B/ADMFigure 2 Effect of adriamycin (

29、ADM on cell apoptosismeasured by flow cytometry图 2 流式细胞仪检测阿霉素对细胞凋亡的影响a: 143B/WT b: 143B/ADMc: 143B/WT+10 mol/L ADM d: 143B/ADM+10 mol/L ADMGreen Red Yellow万方数据陈渝,等 . 人骨肉瘤耐阿霉素细胞模型的建立及其生物学特性 6916www. CRTER .org2.4 143B/ADM细胞周期检测结果 与 143B/WT细胞 相比, 143B/ADM细胞中处于 G 1期的细胞比例增加, G 2/M期细胞比例减少 (P 0.05,见表 2,图

30、3。2.5 各 细 胞 株 中 MDR-1, MRP-1和 LRP 的 表 达 与 143B/WT细胞相比, 143B/ADM细胞 MDR-1表达显著升 高 (P 0.05,见图 4,表 3。2.6 ADM诱导耐药对细胞内罗丹明蓄积水平的影响 143B/ADM细胞 Rho123摄入量与 143B/WT细胞比较差 异无显著意义,但其渗出后细胞内残留 Rho123显著低 于 143B/WT细胞 (P 15,对其他化疗 药物如顺铂、甲氨蝶呤、异环磷酰胺、长春新碱和紫杉 醇等也产生了明显耐药,表明该耐药细胞株建立成功。 与 143B/WT野生型细胞相比, 143B/ADM细胞生长缓 慢 , 细胞群体倍

31、增时间延长, 细胞克隆形成率明显增加, 细胞周期中 G 1和 S 期所占比例增加,而 G 2/M期所占比例 明显减少,细胞存活率增加。该耐药细胞株的成功建立 为后续骨肉瘤耐药机制研究提供了理想的实验细胞模 型。人类 MDR 基因属于一组大的 ATP 结合盒式载体超 家族,主要包括 MDR-1及 MDR-2基因。 MDR-1基因定 位于染色体 7q21.1上,编码 P-gp 糖蛋白; MDR-2基因的 表达产物主要在肝胆小管内,发挥耐药作用的只有 P-gp 糖蛋白。该蛋白为典型的 ATP 结合盒转运蛋白超家族成 员,具有通道蛋白性质,可与多种药物结合,利用 ATP 水解释放的能量将疏水亲脂性药物

32、转运至细胞外,从而 使细胞内药物浓度降低而产生耐药性18-20。 MRP 蛋白也属于 ATP 结合超家族,其中研究较多的是 MRP -1,其编 码基因位于 16p13.1染色体上。与 MDR-1蛋白不同, MRP-1的作用机制主要与细胞内 MRP-1的药物泵作用 有关,它能识别和转运与谷胱甘肽耦合的底物,从而降 低细胞内药物浓度,因此又被称为谷胱甘肽-S 共轭物转运泵。此外, MRP-1蛋白还可通过改变细胞内药物的分 布引起耐药21-22。除以上两者外, LRP 在肿瘤耐药中的作用研究也越来越多,其编码基因定位于 16号染色体, 与 MRP 基因位置接近。 LRP 蛋白控制着多种底物的核质 转

33、运,可阻止以胞核为靶点的药物通过核孔进入胞核, 还可使胞质内药物进入囊泡,然后通过胞吐机制将其排 出细胞,从而产生耐药 23-24。以上 3种耐药相关蛋白在骨肉瘤中均有关于其过表达的报道6, 25-26, 再鉴于以上 3种常见耐药蛋白在肿瘤耐药中的重要性,为探求其是否在 143B/ADM耐药细胞株 耐药过程中也发挥着重要作用,实验中 Rho123外排实 验显示, 143B/ADM对 Rho123的蓄积比野生型细胞少; 荧光分光光度计检测不同 143B 细胞接受 ADM 处理后细 胞内 ADM 浓度,也发现 143B/WT细胞内 ADM 浓度明显 高于 143B/ADM细胞,以上实验提示很有可能

34、是细胞转 运蛋白通过其药物泵作用将化疗药物排出,导致了耐 药。随后通过 Western blot的方法对以上 MDR 相关蛋白 的表达进行了检测,结果表明, 143B/ADM耐药细胞株 中 MDR-1蛋白表达显著增加, 但 MRP-1和 LRP 蛋白无明 显变化。这说明,实验中建立的 143B/ADM耐药模型产 生的耐药现象很可能是由过表达的 MDR-1蛋白外排药 物引起的。综上所述,实验模拟体外化疗间歇给药的方式, 以 ADM 为诱导剂成功构建了人骨肉瘤多药耐药体外细胞 系 143B/ADM细胞系。初步研究表明, 143B/ADM细胞 多药耐药性与 MDR1表达水平关系密切,与 MRP1和

35、LRP 表达无明确联系。4 参考文献1Ullah MF. Cancer multidrug resistance (MDR: a majorimpediment to effective chemotherapy. Asian Pac J Cancer Prev. 2008;9:1-6.2 Coburger C, Lage H, Molnar J, et al. Impact of novel MDRmodulators on human cancer cells: reversal activities and induction studies. Pharm Res. 2009;26:18

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37、cin-resistant MCF-7 cells. Cancer Chemother Pharmacol. 2011;67:823-828.5 Huang WT, Huang CC, Weng SW, et al. Expression of themultidrug resistance protein MRP and the lung-resistance protein LRP in nasal NK/T cell lymphoma: further exploring the role of P53 and WT1 gene. Pathology. 2009;41:127-132.6

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50、133 对骨骼肌卫星细胞增殖分化 的调控及机制研究。 作者贡献： 陈渝进行实验设计，实验实施为陈渝、翁政， 实验评估为王大勇，资料收集为陈渝，陈渝成文，邓忠良审 校，陈渝、邓忠良对文章负责。 利益冲突： 课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济 组织直接或间接的经济或利益的赞助。 本文创新性： 提供证据：检索 Pubmed 数据库，检索时间：建库至 2011 07 ， 检 索 式 ：“ osteosarcoma and 143B and adriamycin and MDR and MRP and LRP”，未见相同文章。 创新点说明：实验将阿霉素浓度递增法与间歇诱导法结 合，采用逐步递增阿霉素

51、浓度间歇作用的方法，来建立骨肉 瘤耐药细胞模型，具有一定的方法创新性；骨肉瘤耐药机制 不明，进行相关研究需要有效的实验模型，实验为此建立模 型，具有一定的理论创新性。 16 17 18 19 20 21 22 23 24 6918 P.O. Box 1200, Shenyang 110004 万方数据 人骨肉瘤耐阿霉素细胞模型的建立及其生物学特性 作者： 作者单位： 刊名： 英文刊名： 年，卷(期： 陈渝， 王大勇， 翁政， 邓忠良， Chen Yu， Wang Da-yong， Weng Zheng， Deng Zhong-liang 陈渝,王大勇,翁政,Chen Yu,Wang Da-yo

52、ng,Weng Zheng(重庆市第九人民医院骨科,重庆市,400700， 邓忠良 ,Deng Zhong-liang(重庆医科大学附属第二医院骨科,重庆市,400010 中国组织工程研究与临床康复 JOURNAL OF CLINICAL REHABILITATIVE TISSUE ENGINEERING RESEARCH 2011,15(37 参考文献(26条 1.Ullah MF Cancer multidrug resistance (MDR:a major impediment to effective chemotherapy 2008 2.Coburger C;Lage H;Mol

53、nar J Impact of novel MDR modulators on human cancer cells:reversal activities and induction studies外文期刊 2009(1 3.Hodges LM;Markova SM;Chinn LW Very important pharmacogene summary:ABCB1 (MDR1,P-glycoprotein外文期刊 2011 4.Donmez Y;Akhmetova L;Iseri OD Effect of MDR modulators verapamil and promethazine on gene expression levels of MDR1 and MRP1 in doxorubicin-resistant MCF-7 cells外文期刊 2011 5.Huang WT;Huang CC;Weng SW Expression of the multidrug resistance protein MRP and the lung-resistance protein LRP in nasal NK