生物化学实验总摘

1、生物化学实验总摘实验一 蛋白质的沉淀反应2实验二 考马斯亮蓝G-250比色法测蛋白质含量4实验三 3,5-二硝基水杨酸比色法测糖含量6实验四 淀粉酶活力测定及专一性实验8实验五 RNA提取与颜色反应10实验六 脂肪碘价的测定13实验七 脂肪酸价的测定15实验八 碘量法测维生素C含量16实验九 醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白质18实验十 纸层析研究植物转氨基作用221 / 26实验一 蛋白质的沉淀反应一、目的和要求通过实验加深对蛋白质溶液的溶胶特性及其稳定因素的认识。了解各种沉淀试剂使蛋白质沉淀的实质和区分可逆的盐析沉淀及不可逆的沉淀作用。二、原理在水溶液中，蛋白质分子表面结合大量的水分子，形

2、成水化膜，同时蛋白质分子本身带有电荷，与溶液的反离子作用，形成双电层，因而每个蛋白质分子可形成一个稳定的胶粒。整个蛋白质溶液就形成稳定的亲水溶胶体系。与其它溶胶相同，这种稳定性是有条件的，相对的。当某些物理化学因素导致蛋白质分子失去水化膜或失去电荷，甚至变性时，它就丧失了稳定因素，以固态形式从溶液中析出，这就是蛋白质的沉淀作用。根据沉淀作用的结果，可将蛋白质的沉淀作用分为两类：1.可逆沉淀作用：在发生沉淀作用时，虽然蛋白质已经沉淀析出，然而其分子内部结构并没发生明显的改变，仍保持原有的结构和性质。如除去沉淀因素，蛋白质可重新溶解在原来的溶剂中。因此，这种沉淀作用称为可逆沉淀作用。属于此类的有盐

3、析作用，低温下丙酮、乙醇使蛋白质沉淀的作用，以及利用等电点的沉淀。（1）盐析作用：用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程。在高浓度的中性盐影响下，蛋白质水分子的水化膜被剥夺。同时蛋白质分子所带的电荷被中和，因而破坏了蛋白质溶胶的稳定因素，使蛋白质沉淀析出，但中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，若除去中性盐或减低盐的浓度，蛋白质就重新溶解。（2）有机溶剂沉淀蛋白质：在低温下，在蛋白质溶液中加入适量丙酮或乙醇，蛋白质分子的水化膜被破坏而沉淀。若及时将蛋白质沉淀与丙酮或乙醇分离，蛋白质沉淀则可重新溶解于水中。2.不可逆沉淀作用：一些物理化学因素往往会导致蛋白质分子结构，尤其是空间结构破坏，因

4、而失去其原来的性质，这种蛋白质沉淀不能再溶解于原来的溶剂中。重金属盐，生物碱试剂、过酸、过碱、震荡、超声波和有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀。重金属盐类Cu、Ag、Pb和Hg等均能与蛋白质分子中的巯基等基团结合，生成不溶物而沉淀。生物碱试剂与蛋白质结合形成不溶物，使蛋白质沉淀。植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物称为生物碱 (或植物碱)。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。生物碱试剂与蛋白质的碱性基团反应。过酸、过碱、加热、震荡和超声波等均能使蛋白质的空间结构破坏，改变其原有性质。从而形成沉淀。三、试剂和器材1.试剂（1）卵清蛋白液：将鸡(鸭)

5、蛋清用蒸馏水稀释2040倍、8层纱布过滤，冷藏备用。（2）饱和硫酸铵溶液（3）1%醋酸铅溶液（4）硫酸铵粉末（5）1%硫酸铜溶液（6）10%三氯乙酸溶液（7）0.5%磺基水杨酸溶液（8）1%醋酸溶液（9）5%鞣酸溶液（10）饱和苦味酸溶液（11）晶体氯化钠（12）95%乙醇2.器材（1）试管及试管架（2）量筒（3）牛角勺（4）刻度吸管（5）滤纸（6）漏斗四、操作步骤1.蛋白质的盐析作用（1）取蛋白质溶液5mL，加入等量的饱和硫酸铵溶液，微微摇动试管，使溶液混合后静置数分钟，球蛋白即析出(如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵)。（2）将上述混合液过滤(或离心)、取滤液(或离心上清液)加硫酸铵粉末，至不再

6、溶解，析出的即为清蛋白。再加水稀释，观察沉淀是否溶解。2.酒精沉淀蛋白质取蛋白质溶液1mL，加晶体NaCl少许(加速沉淀并使沉淀完全)待溶解后再加入95%乙醇2mL混匀。观察有无沉淀析出。3.有机酸沉淀蛋白质取2支试管，各加入蛋白质溶液约0.5mL，然后分别滴加10%三氯乙酸和0.5%磺基水杨酸数滴，观察蛋白质沉淀。4.生物碱试剂沉淀蛋白质取2支试管各加入2mL蛋白质溶液及1%醋酸45滴。其中一管加5%鞣酸溶液数滴，另一管中加入饱和的苦味酸溶液数滴，观察沉淀的形成。5.重金属盐沉淀蛋白质取试管两支各加蛋白质溶液2mL，一管内滴加1%醋酸铅溶液，另一管内滴加1%硫酸铜溶液，至有沉淀生成。五、思考

7、题1.为什么鸡蛋清可用作铅、汞中毒的解毒剂?2.蛋白质分子中的哪些基团可以与（1）重金属离子作用，而使蛋白质沉淀?（2）有机酸、无机酸作用，而使蛋白质沉淀?（3）生物碱试剂作用，而使蛋白质沉淀?实验二 考马斯亮蓝G-250比色法测蛋白质含量一、目的学习和掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理和方法。二、原理考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量属于一种染料结合法。考马斯亮蓝G-250是一种蛋白染料，其结构如下图。它在游离状态下最大吸收波长为464nm。由于它所含的疏水基团与蛋白质的疏水微区具有亲和力，通过疏水作用与蛋白质相结合。当它与蛋白质结合后形成蓝色的蛋白质-染料复合物，其最大吸收波

8、长变为595nm。这种结合在2分钟左右达到平衡，生成的复合物在1小时内保持稳定。在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，所以可用于蛋白质含量的测定。该方法非常灵敏，蛋白质最低检测量为5mg，而且此法操作简便、快速，干扰物质少，是实验室常用的蛋白质定量方法。但染料易吸附在比色杯上而造成误差，每次更换检测样液时，应及时用乙醇洗涤比色皿，再用蒸馏水冲洗残留的乙醇。三、实验材料及设备1.材料：包心菜2.仪器：分光光度计，离心机，电子天平3.器材：刻度试管：25mL9刻度试管：10mL1移液管：1mL3、20mL1烧杯：250mL2、50mL1离心管：10m

9、L1滴管：2洗耳球：2坐标纸、研钵、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1四、试剂的配制1.牛血清白蛋白(BSA)标准液（100mg/mL）精确称取10mg牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解后定容至100mL。2.考马斯亮蓝G-250染色液取0.10g考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 95%的乙醇中，加入100mL 85%的正磷酸，再用蒸馏水定容到1000mL。过滤待用。该试剂于常温下可保存1个月。五、操作步骤1.样品液的制备（1）取材：称包心菜叶片1.0g左右，准确记录其质量。（2）研磨：将样品置于研钵中，研磨成匀浆后，准确加20mL蒸馏水。（3）提取：将上述匀浆液在研钵内浸提10分钟，不断搅拌，使蛋

10、白质充分溶解在水中（注意，已定容，所以在没搅匀之前不能损失样液）。（4）离心：将部分浸提液转移到10mL离心管里，以10000转/分钟离心10分钟。（5）分离：将上清液倒入至干净的小试管里，备用。（对于含水量比较多的样品，在计算定容体积时，还应考虑到样品本身的水份。因此，另取1g左右的包心菜叶片，准确称重，在微波炉里高温失水，冷却后准确称重，计算包心菜叶片的含水量，然后再计算出所称样品中含有多少毫升水，加上20mL水的体积，就是本实验样品的准确定容体积。）2.标准曲线制作及样品测定取9支试管，按下表所示顺序操作。六、结果处理1.由05号管的数据，以蛋白质含量(mg)为横坐标，A595为纵坐标，

11、在坐标纸上绘制标准曲线；2.求样品管A595的平均值A595；3.由平均值A595从标准曲线中求样品管中蛋白质的含量(mg)；4.计算你所取生物材料中蛋白质的含量（单位用mg/g鲜重）。七、思考题1.用本实验方法所得的测定值与样品的实际值之间若有误差，主要是由什么原因引起的？2.常见的测定蛋白质的方法还有哪些？比较几种测定蛋白质常用方法的优缺点？实验三 3,5-二硝基水杨酸比色法测糖含量一、 目的了解3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖的原理掌握总糖定量测定的操作方法二、原理还原糖是指含自由醛基或酮基的单糖（如葡萄糖）和某些具有还原性的双糖（如麦芽糖）。它们在碱性条件下，可变成非常活泼的烯二醇。遇

12、氧化剂时，具有还原能力，烯二醇本身则被氧化成糖酸及其他产物。黄色的3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂与还原糖在碱性条件下共热后，自身被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，反应液里棕红色的深浅与还原糖的含量成正比，在波长为540nm处测定溶液的吸光度，查对标准曲线并计算，便可求得样品中还原糖的含量。对于非还原性的双糖（如蔗糖）以及还原性很小的多糖（如淀粉），应先用酸水解法将它们彻底水解成单糖。再借助于测定还原糖的方法，可推算出总糖的含量。由于多糖水解时，在每个单糖残基上加了一分子水，因而在计算时，须扣除加入的水量，当样品里多糖含量远大于单糖含量时，则比色测定所得总糖含量应乘以折

13、算系数（1-18/180 =0.9），即得比较接近实际的样品中总糖含量。三、实验材料及设备1.材料：面粉2.仪器：分光光度计、电子天平、沸水浴3.器材：刻度试管：25mL8容量瓶：100mL2锥形瓶：100mL1移液管：1mL2、2mL2、10mL2烧杯：250mL1、50mL1滴管：2洗耳球：2滤纸：11cm坐标纸、漏斗、洗瓶、白瓷板、试管架、移液管架、试管夹、玻棒：各1四、试剂的配制1.葡萄糖标准液（1mg/mL）预先将分析纯葡萄糖置80烘箱内约12小时。准确称取500mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至500mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4保存期约一星期）。若该溶液发生混浊和出现絮

14、状物现象，则应弃之，重新配制。2.3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）将5.0g3,5-二硝基水杨酸溶于200mL2NNaOH溶液中（不适宜用高温促溶），接着加入500mL含130g酒石酸钾钠的溶液，混匀。再加入5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解后，定容至1000mL。暗处保存备用。3.碘液称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL水中。4.酚酞指示剂称取0.1g酚酞，溶于250mL70%（V/V）的乙醇中。5.HCl溶液（6N）取500mL 12N HCl，用水稀释至1000mL。6.NaOH溶液（6N）取240g NaOH，加水溶解，定容至1000mL。五、操作步骤1.样品中总糖的提取（1

15、）取材：称取0.7g面粉，准确记录实际质量（W），放入100mL锥形瓶中。（2）溶解：先用几滴蒸馏水调成糊状；加入15mL蒸馏水；再加入10mL6NHCl，搅匀。（3）水解：置于沸水浴中水解30分钟。用玻璃棒取一滴水解液于白瓷板中，加1滴碘液，检查淀粉水解程度。如显蓝色，表明未水解完全，应继续水解。如已水解完全，则不显蓝色，可以取出沸水浴中的锥形瓶，冷却。（4）中和：加1滴酚酞指示剂，加入10mL6NNaOH中和至微红色。（5）定容：将溶液转移至100mL容量瓶（B1）中，定容。（6）过滤：用滤纸过滤。（注意，滤纸不能用蒸馏水湿润。）（7）稀释：精确吸取滤液10mL，移入另一个100mL容量瓶

16、（B2）中，定容。（B2）液作为总糖待测液备用。2.标准曲线制作及样品测定取8支25mL刻度试管，按下表所示顺序操作。六、结果处理1.由05号管的数据，以葡萄糖含量(mg)为横坐标，A540为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线；2.求两个样品管A540的平均值540；3.由540从标准曲线中求样品管中葡萄糖的含量(mg)；4.计算你所取的生物材料中总糖的百分含量。实验四 淀粉酶活力测定及专一性实验一、目的了解淀粉酶对不同底物的专一性掌握测定淀粉酶活力的原理和基本方法二、原理酶与一般催化剂最主要的区别之一是它具有高度的专一性。所谓专一性指的是一种酶只能对一种化合物或一类化合物（通常在这些化合物的结构

17、中具有相同的化学键）起一定的催化作用，而不能对别的物质发生催化反应。例如，淀粉酶只作用于淀粉中的-1,4葡萄糖苷键，而不能作用于蔗糖分子中-D-吡喃葡萄糖的C1和-D -呋喃果糖的C2之间的糖苷键。蔗糖无还原性，淀粉的还原性也极小，它们对3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）呈阴性反应，而唾液淀粉酶（主要含a-淀粉酶）水解淀粉后的产物则为还原性糖，与DNS试剂共热呈阳性反应，产生红棕色。据此可以检验蔗糖和淀粉有无被唾液淀粉酶水解，从而了解酶作用的专一性。酶活力也称酶活性，是以酶在最适温度、最适pH等条件下，催化一定的化学反应的初速度来表示。本实验是以一定量的唾液淀粉酶液，于37C、pH6.8的

18、条件下，在一定的初始作用时间里将淀粉转化为还原糖，然后通过与DNS试剂作用，比色测定，求得还原糖的生成量，从而计算出酶反应的初速度，即酶的活力。这里规定，一个淀粉酶活力单位定义为在37C、pH6.8的条件下，每分钟水解淀粉生成1mg还原糖所需的酶量。三、实验材料及设备1.材料：唾液2.仪器：分光光度计、恒温水浴、沸水浴3.器材：刻度试管：25mL10容量瓶：100mL1移液管：1mL42mL2烧杯：250mL1滴管：2洗耳球：2洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1四、试剂的配制1.淀粉溶液（0.5%）称取5g可溶性淀粉，溶于1000mL热水中。（临用前配制）2.蔗糖溶液（1%）3.3,5-二硝基

19、水杨酸试剂（DNS试剂）将5.0g3,5-二硝基水杨酸溶于200mL2NNaOH溶液中（不适宜用高温促溶），接着加入500mL含130g酒石酸钾钠的溶液，混匀。再加入5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解后，定容至1000mL。暗处保存备用。4.磷酸缓冲液（0.2mol/L，pH6.8）5.NaOH溶液（6mol/L）6.NaCl溶液（0.3%）五、操作步骤1.唾液淀粉酶的制备（1）提取：实验者先用水漱口清洁口腔，然后含一小口（约5mL）蒸馏水于口中轻嗽一、二分钟。（2）过滤：将口腔中的酶提取液用一层脱脂棉过滤。（3）稀释：取滤液1mL，用水定容至100mL。作为淀粉酶的样品液。（由于不同人或同一

20、人不同时间收集到的唾液淀粉酶的活性并不相同，稀释倍数可以是50300倍，甚至超过此范围）2.唾液淀粉酶的专一性实验取4支试管，按表一编号并操作，记录所观察到的颜色。3.唾液淀粉酶活力的测定取25mL刻度试管5支，按表二编号并操作，记录实验结果。表二六、结果处理1.解释表一的实验结果。2.根据表二的实验结果，并利用实验三“3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖的含量”中制作的标准曲线，计算每毫升新鲜唾液含有淀粉酶的活力单位。实验五 RNA提取与颜色反应一、目的学习用浓盐法从酵母中提取RNA掌握用等电点法沉淀RNA观察核酸的颜色反应，了解核酸定性与定量测定的原理熟练掌握普通离心机的使用方法二、原理酵母繁

21、殖快，生长周期短；其细胞质中的核酸大部分是RNA，而DNA很少；RNA提取液与菌体分离比较容易。因此，酵母是提取RNA的好材料。将RNA从细胞中释放出来在工业上主要有三种方法稀碱法、浓盐法和自溶法。本实验采用浓盐法，即利用高浓度的盐（10%NaCl）在90100C条件下改变了细胞膜通透性，并将核蛋白体解离成RNA和蛋白质而使RNA释放到盐溶液中。同时，90100C的高温可破坏磷酸单酯酶和磷酸二酯酶的活力，避免RNA的降解。注意，在3070C时这两种酯酶的作用活跃，提取时应避免在此温度范围内停留时间过长。由于核膜内的DNA分子量较大，穿越膜孔较困难，一般不易释放到菌体外面，所以采用离心技术，可使

22、RNA溶液与菌体残渣以及DNA分离。根据核酸在等电点溶解度最小的性质，将溶液在低温下调pH至2.02.5，RNA以白色絮状沉淀形式从盐溶液中析出。再次离心，固液分离，便可获得RNA粗产品。最后用乙醇洗涤沉淀，溶解和去除脂溶性杂质和色素以及盐分杂质。由于RNA不溶于乙醇，所以用乙醇洗涤还可以使RNA沉淀物脱水，变得疏松，便于干燥，提高了RNA产品的纯度。DNA和RNA的鉴别，较常用的方法是利用两类核酸中不同的戊糖各自具备的不同的颜色反应，而得以定性鉴别。其中鉴定DNA的方法称为二苯胺法，鉴定RNA的方法称为地衣酚（苔黑酚，3,5-二羟甲苯）法。具体反应式如下：三、实验材料及设备1.材料：干酵母2

23、.仪器：离心机、电子天平、沸水浴、烘箱、抽滤装置、冰浴3.器材：普通试管：20mL4（干燥）锥形瓶：100mL1量筒：50mL1移液管：1mL2烧杯：250mL1100mL150mL1离心管：100mL1温度计：501表面皿：9cm滴管：2洗耳球：2加样器pH试纸：pH0.55.0滤纸：7cm洗瓶、试管架、移液管架、试管夹、玻棒：各1四、试剂的配制1.NaCl溶液（C.P.）（10%）2.HCl溶液（6N）取500mL浓盐酸，用水稀释至1000mL。3.乙醇（C.P.）（95%）4.苔黑酚试剂（又称地衣酚试剂）将200mg苔黑酚溶于100mL浓盐酸中，再加入100mgFeCl36H2O。（低温

24、贮藏一周）5.二苯胺试剂将1g二苯胺溶于98mL冰醋酸中，再加入2mL浓硫酸（比重1.84）。（临用时配制，用前可加几滴乙醛。）五、操作步骤1.取材在天平上准确称取干酵母3.00g，转移至100mL锥形瓶中。2.浓盐浸提取27mL10%NaCl溶液，加入到含干酵母的锥形瓶中，搅拌均匀；置于90100C水浴中，浸提3060分钟；冷却。3.离心将锥形瓶中提取液和沉淀全部转移至100mL离心管中，取10mLH2O洗涤锥形瓶，并入离心管中；平衡后以4000转/分钟离心15分钟；将上清液（即RNA提取液）倾入50mL烧杯中，弃去沉淀（菌体残渣）。4.沉淀RNA（1）冷却：将50mL烧杯置于放有冰块的25

25、0mL烧杯中冷却；将温度计插入50mL烧杯中，待溶液冷至10C以下时，取出温度计。（2）调pI：缓慢滴加6N HCl于50mL烧杯中，用玻棒一边轻轻搅拌溶液，一边测量pH值，调节溶液pH至2.02.5范围，溶液中白色沉淀逐渐增多，到等电点时沉淀量最多；继续在冰浴中静止15分钟，使沉淀充分。（注意：严格控制pH；若搅拌过快核酸难以凝聚沉淀。）5.离心将小烧杯中溶液和沉淀移至离心管中，再次平衡、离心（4000转/分钟，15分钟）；弃去上清液，保留RNA沉淀。6.洗涤与抽滤（1）洗涤：取10mL95%乙醇加到含RNA沉淀的离心管中，悬浮沉淀，浸泡5分钟。（2）抽滤：取大小合适的滤纸，先在数字显示天平

26、上称重；然后放入布氏漏斗中，用少量乙醇湿润滤纸，开启真空泵，使滤纸贴紧漏斗，将沉淀及溶液全部转移至布氏漏斗内；再用15mL95%的乙醇洗涤离心管，淋洗滤渣。7.干燥用小镊子取出布氏漏斗中的沉淀物和滤纸，转移至表面皿上，置于80C烘箱内干燥。8.称重取出样品，在室温下冷却数分钟后，将沉淀物及滤纸置于数字显示天平上称重。9.颜色反应（1）溶解：取50mL水溶解RNA沉淀，同时加2滴NaOH助溶。（2）颜色反应：取4支洁净、干燥的试管，按下表所示顺序操作六. 结果处理1. 写出核酸产品的颜色和外形。2. 计算RNA的粗产品的得率。3. 由颜色反应的结果，说明产品中含有核酸的情况。实验六 脂肪碘价的测

27、定一、目的掌握碘价的测定原理和方法。二、原理在适当条件下，不饱和脂肪酸的不饱和键能与碘、溴或氯仿起加成反应。脂肪分子如含有不饱和脂酰基，即能吸收碘。100g脂肪所能吸收碘的克数称为碘价。碘价的高低表示脂肪不饱和度的大小。由于碘与脂肪的加成作用很漫，故于Hanus试剂中加入适量溴，使产生溴化碘，再与脂肪作用。将一定量的溴化钾与脂肪作用后，测定溴化钾剩余量，即可求得脂肪之碘价，本法的反应如下：三、实验仪器及试剂1.实验器材：蓖麻油或其它油、碘瓶、量筒、称量瓶、锥形瓶、吸管、滴定管、铁支架、电子分析天平2.实验试剂：Hanus试剂、15%碘化钾溶液、标准硫代硫酸钠溶液、1%淀粉液。四、实验内容及步骤

28、1.准确称取一定量的脂肪，置于碘瓶中，加10ml氯仿作溶剂，待脂肪溶解后，加入Hanus试剂20ml，塞好碘瓶，轻轻摇动，摇动时应避免溶液溅至瓶颈部及塞上，置暗处30min，于另一碘量瓶中置同量试剂，但不加脂肪，做空白试验。2. 30min后，先注少量15%碘化钾于碘碘瓶口边上，将玻塞稍稍打开，使碘化钾溶液流入瓶内，并继续由瓶口边缘加入碘化钾溶液，共加20ml，再加水100ml，混匀，随即用标准硫代硫酸钠溶液进行滴定。开始加硫代硫酸钠溶液时可较快。等瓶内液体呈淡黄色时，加1%淀粉液数滴，继续滴定，滴定将近终点时，可加塞振荡，使于溶于氯仿中之碘完全作用，继续滴定至蓝色恰恰消失为止，记录所用硫代硫

29、酸钠溶液的量，用同法测定空白管。按下式计算碘价：碘价=c（B-S）126.9/（m1000）100式中 B：滴定空白样时所消耗硫代硫酸钠溶液的体积（ml）；S：滴定样品所消耗硫代硫酸钠溶液的体积（ml）；126.9：碘的相对原子质量（g）；1000：毫克数转化为克数；100：碘价是100克脂肪所吸收的碘的克数；m；脂肪质量（g） ；c：硫代硫酸钠溶液物质的量浓度（mol/l）。 五、数据记录和处理平行测定三次，取其算术平均值。序号B（ml）S（ml）碘价123平均值六、实验注意事项1.应使滴定所用的体积数在10ml以上，从而减小读数误差。2.滴定时，一边滴要一边不停的摇动三角烧瓶。实验七 脂肪

30、酸价的测定一、目的掌握酸价的测定原理和方法。二、原理天然油脂长期暴露在空气中会产生臭味，这中现象称为酸败。酸败是由于油脂水解释放出游离的脂肪酸，在空气中被氧化成醛或酮，从而有一定的臭味。酸败的程度用酸价来表示。酸价是中和1g油脂的游离脂肪酸所需的KOH的毫克数。油脂中的游离脂肪酸与KOH发生中和反应，从KOH标准容易外消耗量可计算出游离脂肪酸的量。反应式如下：RCOOH+KOH RCOOK+H2O三、实验仪器及试剂1.实验器材：油脂、电子分析天平、碱式滴定管、三角烧评瓶、量筒、水浴锅。2.实验试剂：0.100mol/L KOH标准溶液，1%酚酞指示剂、中性醇醚混合液。四、实验内容及步骤1.称取

31、油脂12.00g于100mL三角烧瓶中，加入醇醚混合液50mL，振摇溶解或水浴中熔化至透明，溶液由红色变为无色，继续用0.100mol/L KOH溶液滴定至淡红色，1min不褪色为终点，记录KOH的用量V（mL）。2.计算脂肪的酸价=cV56.1/m式中 c：标准KOH物质的量浓度（mol/L）；V：样品消耗KOH的体积（mL）；56.1：每摩尔KOH的质量（g/mol）；m：样品质量（g）。五、数据记录和处理平行测定三次，取其算术平均值。序号V（ml）m（ml）酸价123平均值实验八 碘量法测维生素C含量一、目的掌握直接碘量法测定维生素C的原理和方法。了解间接碘量法的原理。二、原理维生素C又

32、称抗坏血酸Vc，分子式C6H8O6。Vc具有还原性，可被I2定量氧化，因而可用I2标准溶液直接测定。其滴定反应式：C6H8O6I2= C6H6O62HI用直接碘量法可测定药片，注射液，饮料，蔬菜，水果等的Vc含量。I2微溶于水而易溶于KI溶液，但在稀的KI溶液中溶解得很慢，所以配制I2溶液时不能过早加水稀释，应先将I2和KI混合，用少量水充分研磨，溶解完全后再加水稀释。I与KI间存在如下平衡：I2I =I3游离的I2容易挥发损失，这是影响碘溶液稳定性的原因之一。因此溶液中应维持适当过量的I离子，以减少I2的挥发。空气能氧化I离子，引起I2浓度增加：4IO24H =2I22H2O此氧化作用缓慢，

33、但能为光、热及酸的作用而加速，因此I2溶液应处于棕色瓶中置冷暗处保存。I2能缓慢腐蚀橡胶和其他有机物，所以I应避免与这类物质接触。I2溶液的标定用Na2S2O3标定。而Na2S2O3一般含有少量杂质，在pH在910间稳定，所以在Na2S2O3溶液中加入少量的Na2S2O3，Na2S2O3见光易分解可用棕色瓶储于暗处，经814天，用K2C2O7做基准物间接碘量法标定Na2S2O3溶液的浓度。其过程为：K2C2O7与KI先反应析出I2：析出的I2再用标准的Na2S2O3溶液滴定：从而求得Na2S2O3的浓度。这个标定Na2S2O3的方法为间接碘量法。碘量法的基本反应式：2S2O32I2=S4O62

34、2I标定Na2S2O3溶液时有：6ICr2O7214H=2Cr33I27H2O2S2O32I2=S4O622INa2S2O3标定时有:n(K2C2O7): 6n(Na2S2O3)=1:6由于Vc的还原性很强，较容易被溶液和空气中的氧氧化，在碱性介质中这种氧化作用更强，因此滴定宜在酸性介质中进行，以减少副反应的发生。考虑到I2在强酸性中也易被氧化，故一般选在pH为34的弱酸性溶液中进行滴定。三、试剂1. I2溶液（0.05mol/L）：3.3g I2和5g KI，置于研钵中加少量水，在通风橱中研磨。待I2全部溶解后，将溶液转入棕色试剂瓶，加水稀释至250mL，摇匀，放置暗处保存。2. Na2S2

35、O3标准溶液(0.01mol/L)3.淀粉溶液（5%）4. HAc(1+1)5.固体Vc样品（维生素片剂）6.重铬酸钾(A.R)四、步骤1. I2的标定：用移液管移取25.00 ml Na2S2O3标准溶液于250ml锥形瓶中，加50ml蒸馏水，5ml 0.5%淀粉溶液，然后用I2溶液滴定至溶液呈浅蓝色，30s内不褪色即为终点。平行三次，计算I2溶液的浓度。2.维生素C的测定：准确称取约0.2g研成粉末的维生素C药片，置于250ml锥形瓶中，加入100ml新煮沸过并冷却的蒸馏水，立即用I2标准溶液滴定至出现稳定的浅蓝色，30s 内不褪色即为终点，记下I2溶液体积。平行三次，计算式样中维生素C的

36、百分量。五、思考题1.溶样时为什么要用新煮沸并冷却的蒸馏水？2.加醋酸的目的是什么？实验九 醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白质一、目的学习醋酸纤维薄膜电泳的操作了解电泳技术的一般原理。二、原理醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法。带电颗粒在电场力作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。由于各种蛋白质都有特定的等电点，如将蛋白质置于pH值低于其等电点的溶液中，则蛋白质将带正电荷而向负极移动。反之，则向正极移动。因为蛋白质分子在电场中移动的速度与其带电量、分子的形状及大小有关，所以，可用电泳法将不同的蛋白质分离开来。血清中含有多种蛋白质，它们的等电点都在pH7.5以下。

37、将血清放于pH8.6的缓冲液电泳时，所有的血清蛋白都带有负电荷，在电场中将向正极移动。由于各种血清蛋白在相同pH时所带电荷数量不等，分子颗粒大小不一，因而泳动速度不同，经电泳被分离开来。血清蛋白质的等电点和分子量见下表。本实验以醋酸纤维素薄膜（简称CAM）为支持物分离血清中的不同蛋白质。它是一种良好的呈均一泡沫状疏松薄膜，厚约120m具有一定的吸水性。三、实验材料、仪器及试剂1.材料：健康人血清或鸡血清2.仪器：电泳仪电泳槽3.试剂：（1）醋酸纤维素薄膜；（2）pH8.6巴比妥缓冲液（离子强度0.060.07）：取巴比妥0.83克，巴比妥钠6.38克，加蒸馏水加热溶解后，定容至500ml。（3

38、）染色液：取氨基黑10B0.5克，溶于50ml甲醇中，再加冰醋酸10ml，蒸馏水40ml混匀。（4）漂洗液：95%乙醇4.5ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml混合。（5）透明液：95%乙醇80ml，冰醋酸20ml混合。四、实验方法1.电泳槽与薄膜的制备（1）醋酸纤维素薄膜的湿润与选择用钝头镊子取一片薄膜，在薄膜无光泽面上，距边2cm处用铅笔各划一条直线此线为点样标志区。小心地平放在盛有缓冲液的平皿中。若漂浮于液面的薄膜在15s30s内迅速湿润，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳；若薄膜湿润缓慢，色泽深浅不一或有条纹及斑点，则表示薄膜厚薄不均匀应舍去，以免影响电泳结果，将选好的薄膜用竹夹

39、子轻压，使其完全浸泡于缓冲液中约30min后方可用于电泳。（2）电泳槽的准备根据电泳槽的宽度，剪裁尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中，各倒等体积的电极缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部浸润后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素膜的桥梁，因而称为滤纸桥。2.点样仔细辩认薄膜的粗糙面与光滑面，在粗糙面距离薄膜一端1.5cm处，用铅笔轻轻划一条直线。用玻棒蘸上血清样品，涂于盖玻片边缘处（边缘长度应比膜条宽度窄），将此边缘按压在直线上。注意：样品应点在薄膜

40、的粗糙面一侧。待血清完全渗入薄膜后，将膜面翻转，点样面（粗糙面）朝下，置电泳槽中，薄膜点样端放于负极一侧。3.电泳用钝头镊子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。如下图所示，要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂，如一电泳槽同时安放几张薄膜，则薄膜之间应隔几毫米，盖上电泳槽盖使薄膜平衡10min。用导线将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接，注意不要接错。在室温下电泳，打开电源开关，调旋钮调到每厘米电流强度为0.3mA（8块薄膜则为4.8mA）。通电10min15min后，将电流调节到每厘米膜宽电流强度为0.5mA（8片共8mA），电泳时间

41、约50min60min。电泳后调节旋钮使电流为零，关闭电泳仪切断电源或自然风干。4.染色与漂洗用钝头镊子取出电泳后的薄膜，无光泽面向上，放在含有0.5氨基黑10B染色液的培养皿中，浸染5min。取出后用自来水冲去多余染料，然后放到盛有漂洗液的培养皿中，每隔10min换漂洗液一次，连续数次，直至背景蓝色脱尽。取出后放在滤纸上，用电吹风的冷风将薄膜吹干。5.透明将脱色吹干后的薄膜浸入透明甲液中2min，立即放入透明乙液中浸泡1min，取出后立即紧贴于干净玻璃板上，两者间不能有气泡。约23min薄膜完全透明。若透明太慢可用滴管取透明乙液少许在薄膜表面淋洗一次垂直放置待其自然干燥，或用吹风机冷风吹干且

42、无酸味。再将玻璃板放在流动的自来水下冲洗，当薄膜完全润湿后用单面刀片撬开薄膜的一角，用手轻轻将透明的薄膜取下，用滤纸吸干所有的水分，最后将薄膜置液体石蜡中浸泡3min，再用滤纸吸干液体石蜡，压平。此薄膜透明，区带着色清晰，可用于光吸收计扫描。长期保存不褪色。6.定量（1）浸泡：将膜片上的各蛋白质分离区带分段剪下，分别置于相应的标有编号的试管内，然后各加入0.4mol/L的氢氧化钠溶液进行浸泡。浸泡淡色带所加入的0.4mol/L氢氧化钠溶液的量为4ml，深色带为8ml（此时的稀释倍数是淡色带的2倍）。室温下的浸泡时间为30min60min。若在37水浴中浸泡，则为10min15min。浸泡期间振

43、荡数次，使蛋白质区带浸出。另外再剪取与色带膜条大小相同的无色带膜条作为空白，以相同的方式浸泡在0.4mol/L氢氧化钠溶液中。（2）比色：浸泡完毕，将浸出的有色溶液在分光光度计上进行比色测定。测定波长为620nm，光径为1cm。若浸出液有混浊或沉淀，则以4000r/min的转速离心1020min除去，然后再取上清液进行比色测定。（3）计算：比色测定结束后，各组分的含量按下式计算：某蛋白质组分百分含量某蛋白质组分的光吸收值/样品中各蛋白质组分的光吸收值总和100上式中深色带蛋白质组分的光吸收值应乘以稀释倍数2，例如血清白蛋白组分的分离区带为深色带，浸泡时所加入的0.4mol/L氢氧化钠的量是其它

44、淡色带的2倍，所以应乘以2。五、注意事项1.醋酸纤维素薄膜的预处理市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的重要关键之一。将干膜片漂浮于电极缓冲液表面，其目的是选择膜片厚薄及均匀度，如漂浮15s30s时，膜片吸水不均匀，则有白斑点或条纹，这提示膜片厚薄不匀，应舍去不用，以免造成电泳后区带扭曲，界线不清，背景脱色困难，结果难以重复。由于醋酸纤维薄膜亲水性比纸小，浸泡30min以上是保证膜片上有一定量的缓冲液，并使其恢复到原来多孔的网状结构。最好是让漂浮于缓冲液的薄膜吸满缓冲液后自然下沉，这样可将膜片上聚集的小气泡赶着走。点样时，应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓冲液太多引

45、起样品扩散。但也不能吸得太干，太干则样品不易进入薄膜的网孔内，而造成电泳起始点参差不齐，影响分离效果。吸水量以不干不湿为宜。为防止指纹感染，取膜时，应戴指套或用镊子。2.缓冲液的选择醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥溶液，其浓度为0.05mol/L0.09mol/L。选择何种浓度与样品及薄膜的薄厚有关。选择时，先初步定下某一浓度，如电泳槽两极之间的膜长度为8cm10cm，则需电压25V/cm膜长，电流强度为0.4mA/cm0.5mA/cm膜宽。当电泳达不到或超过这个值时，则应增加缓冲液浓度或进行稀释。缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，并由于扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带

46、分布过于集中不易分辨。3.加样量加样品的多少与电泳条件、样品的性质、染色方法与检测手段灵敏度密切相关。作为一般原则，检测方法越灵敏，加样量则越少，对分离更有利。如加样量过大，则电泳后区带分离不清楚，甚至互相干扰，染色也较费时。如电泳后用洗脱法定量时，每厘米加样线上需加样品0.1l0.5l约相当于5g1000g蛋白。血清蛋白常规电泳分离时，每厘米加样线加样量不超过1l，相当于60g80g的蛋白质。但糖蛋白和脂蛋白电泳时，加样量则应多些。对每种样品加样量均应先作预实验加以选择。点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一，以印章法加样时，动作应轻、稳，用力不能太重，以免将薄膜弄坏或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。4.电量的选择电泳过程应选择合适的电流强度，一般电流强度为0.4mA/cm0.5mA/cm宽膜为宜。电流强度高，尤其在温度较高的环境中，可引起蛋白质变性或由于热效应引起缓冲液中水分蒸发，使缓冲液浓度增加，造成膜片干涸。电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散。5.染色液的选择对醋酸纤维素薄膜电泳后染色应根据样品的特点加以选择。其原则是染料对被分离样品有较强的着色力，背景易脱色；应尽量采用水溶性染料，不宜