第五章__化学毒物的一般毒性作用

1、第五章第五章 化学毒物的一般毒性化学毒物的一般毒性作用作用General Toxic Effects of Chemical Toxicants主要内容急性毒性急性毒性蓄积作用慢性、亚慢性毒性慢性、亚慢性毒性目标1.掌握急性毒性的概念、分级，亚慢性和掌握急性毒性的概念、分级，亚慢性和慢性毒性作用的概念慢性毒性作用的概念2.熟悉急性、亚慢性和慢性毒性作用的目熟悉急性、亚慢性和慢性毒性作用的目的和方法的和方法3.了解蓄积作用的概念及方法了解蓄积作用的概念及方法 外源化学物质在一定的剂量、一定的外源化学物质在一定的剂量、一定的接触时间和一定的接触方式下对实验动接触时间和一定的接触方式下对实验动物产生

2、物产生综合毒效应的能力综合毒效应的能力称为化学毒物称为化学毒物的的一般毒性一般毒性( (general toxicity)general toxicity)，又称又称为化学毒物的基础毒性为化学毒物的基础毒性( (basic toxicity)basic toxicity)或或一般毒性作用一般毒性作用( (general toxic general toxic effects)effects)。 根据对化学毒物的根据对化学毒物的接触时间接触时间长短所产生长短所产生的毒性效应，的毒性效应，可划分为可划分为急性毒性、亚慢急性毒性、亚慢性毒性和慢性毒性性毒性和慢性毒性。试验可分为急性毒。试验可分为急性

3、毒性试验、亚慢性毒性试验和慢性毒性试性试验、亚慢性毒性试验和慢性毒性试验。验。对化学毒物的毒性进行评价称为一对化学毒物的毒性进行评价称为一般毒性评价般毒性评价( (evaluation for general evaluation for general toxicity)toxicity)。第一节第一节 急性毒性作用及其评价急性毒性作用及其评价 一、基本概念一、基本概念 急性毒性急性毒性( (acute toxicity)acute toxicity)是指机体是指机体( (人或人或实验动物实验动物) )一次接触或一次接触或2424小时内多次小时内多次接触化学物接触化学物后在后在短期短期( (

4、最长到最长到1414天天) )内所发生的毒性效应，包内所发生的毒性效应，包括一般行为、外观改变、大体形态变化以及括一般行为、外观改变、大体形态变化以及死亡死亡效应效应。 凡凡经口经口接触和各种方式的接触和各种方式的注射注射接触，接触，“一次一次”是指在瞬间将受试化合物输入实验动物的体内。是指在瞬间将受试化合物输入实验动物的体内。而而经呼吸道吸入与经皮肤接触经呼吸道吸入与经皮肤接触，“一次一次”是指是指在一个特定的期间内实验动物持续地接触受试在一个特定的期间内实验动物持续地接触受试化合物的过程，所以化合物的过程，所以“一次一次”含有时间因素。含有时间因素。 如果一种化学毒物的急性毒性很大，对人如

5、果一种化学毒物的急性毒性很大，对人类可能产生极大的危险和威胁，或对生态环境类可能产生极大的危险和威胁，或对生态环境造成潜在的危害。造成潜在的危害。 二、急性毒性实验目的与常用参数二、急性毒性实验目的与常用参数 实验目的：实验目的： 1.1.求出受试化合物对一种或几种实验动物的求出受试化合物对一种或几种实验动物的致致死剂量死剂量( (通常以通常以LDLD5050为主要参数为主要参数) )，并且对化学物，并且对化学物进行毒性分级。进行毒性分级。 2.2.通过观察动物中毒作用的表现、毒作通过观察动物中毒作用的表现、毒作用强度和死亡情况，初步评价毒物对机用强度和死亡情况，初步评价毒物对机体的毒效应特征

6、、靶器官、剂量反应关体的毒效应特征、靶器官、剂量反应关系和对人体产生损害的危险性系和对人体产生损害的危险性3.为后续的重复剂量实验、亚慢性和慢性实验为后续的重复剂量实验、亚慢性和慢性实验及其他实验研究提供接触剂量和观察指标的依及其他实验研究提供接触剂量和观察指标的依据据 4.4.利用急性毒性试验方法研究化合物在机体内利用急性毒性试验方法研究化合物在机体内的生物转运和生物转化过程及其动力学变化。的生物转运和生物转化过程及其动力学变化。也可用于研究急救治疗措施。也可用于研究急救治疗措施。 常用参数：常用参数： 1.1.最常用的是半数致死量最常用的是半数致死量( (LDLD5050) )和急性毒作用

7、和急性毒作用带带( (Z Zacac) )。 实际工作中进行急性毒性评价时还实际工作中进行急性毒性评价时还常用急性常用急性毒作用带毒作用带( (Z Zacac=LD=LD5050LimLimacac) )来表示来表示。Z Zacac值的大值的大小可反映急性阈剂量距离小可反映急性阈剂量距离LDLD5050的宽窄，即表示的宽窄，即表示引起实验动物的死亡剂量与最低毒作用剂量之引起实验动物的死亡剂量与最低毒作用剂量之间剂量范围的宽窄。间剂量范围的宽窄。Z Zacac值越大，表明化学物引值越大，表明化学物引起急性死亡的危险性越小，反之表明引起急性起急性死亡的危险性越小，反之表明引起急性死亡的危险性越大。

8、死亡的危险性越大。 2.2.目前备受主张的是目前备受主张的是LDLD8484LDLD1616( (或或LCLC8484LCLC1616) )的比值。的比值。它是代替它是代替Z Zacac是一种灵敏性是一种灵敏性好、重复性强而且容易求出的参数，可好、重复性强而且容易求出的参数，可以较好地反映急性毒性特征。以较好地反映急性毒性特征。 3.3.当比较两种当比较两种( (或以上或以上) )LDLD5050相同或近似的化学毒相同或近似的化学毒物的致死毒性时，还可使用该化学毒物的物的致死毒性时，还可使用该化学毒物的剂量剂量- -反反应曲线斜率应曲线斜率( (即剂量即剂量- -死亡曲线的概率单位直线的死亡曲

9、线的概率单位直线的斜率斜率) )表示。表示。用以评价化学毒物急性毒性会更为合用以评价化学毒物急性毒性会更为合理。理。 4.皮肤皮肤-皮下系数皮下系数 皮肤LDLD5050/ /皮下LDLD5050 反映化合物反映化合物经皮经皮吸收的危险性吸收的危险性5.经口-腹腔注射系数 经口LDLD5050/ /腹腔注射LDLD5050 反映化合物反映化合物经口经口吸收的危险性吸收的危险性三、急性毒性分级.国内外有关化学品急性毒性分级标准.doc四、急性毒性试验设计四、急性毒性试验设计 实验动物实验动物 染毒途径染毒途径 染毒剂量染毒剂量 观察周期观察周期 观察指标的选择观察指标的选择 计算方法和评价计算方

10、法和评价 ( (一一) )实验动物实验动物 急性毒性试验要求选择急性毒性试验要求选择对化学毒物的代谢对化学毒物的代谢和毒效应表现与人的反应尽可能一致和毒效应表现与人的反应尽可能一致的实验动的实验动物。然而，在注重选择对化学物毒性反应敏感物。然而，在注重选择对化学物毒性反应敏感的动物物种的同时，还得考虑动物的动物物种的同时，还得考虑动物易于获得易于获得、品系纯化品系纯化、价格较低价格较低和和易于饲养易于饲养等条件。等条件。 1.1.实验动物的实验动物的种属种属 不同种属的动物对化学物的反应可不同种属的动物对化学物的反应可能有很大的差别，能有很大的差别，最好用两种种属的动最好用两种种属的动物物，包

11、括，包括啮齿类啮齿类( (rodent species)rodent species)和和非非啮齿类啮齿类( (nonrodent species)nonrodent species)。 2.2.实验动物的实验动物的性别性别 急性毒性试验的主要内容是求急性毒性试验的主要内容是求LDLD5050，除特殊要求外，一般急性毒性试验对动除特殊要求外，一般急性毒性试验对动物性别要求为物性别要求为雌雄各半雌雄各半。 3.3.动物数量与随机分组动物数量与随机分组 急性毒性试验要求大鼠、小鼠等急性毒性试验要求大鼠、小鼠等小动物小动物数数量为量为每组每组1010只只，狗等，狗等大动物大动物也应每组也应每组6 6

12、只只。在。在动物分组中应严格遵循随机化的原则。动物分组中应严格遵循随机化的原则。 一般一般4-64-6组组 4.4.禁食禁食 经口染毒的试验，要求动物实验前经口染毒的试验，要求动物实验前禁食，以免胃内残留食物对化学毒物毒禁食，以免胃内残留食物对化学毒物毒性产生干扰。性产生干扰。大鼠、小鼠大鼠、小鼠 隔夜禁食隔夜禁食大动物染毒前部喂食，染毒后继续禁食大动物染毒前部喂食，染毒后继续禁食3-43-4小时小时四、急性毒性试验设计四、急性毒性试验设计 ( (二二) )染毒途径的选择染毒途径的选择 进行化学毒物急性毒性测试时应考虑人在生进行化学毒物急性毒性测试时应考虑人在生产和生活环境中接触该化学毒物的情

13、况，通常产和生活环境中接触该化学毒物的情况，通常根据实验目的、化学毒物的性质和用途、根据实验目的、化学毒物的性质和用途、人类人类实际接触途径和方式来选择染毒途径实际接触途径和方式来选择染毒途径( (exposure exposure routes)routes)。有时可根据具体情况，选用腹腔、静有时可根据具体情况，选用腹腔、静脉、肌内、皮下和皮内等注射途径。脉、肌内、皮下和皮内等注射途径。 以人实际接触的方式来染毒以人实际接触的方式来染毒 1.1.经口经口( (胃肠道胃肠道) )染毒染毒( (oral exposure)oral exposure) 生产和生活环境中许多化学毒物，可以通生产和生

14、活环境中许多化学毒物，可以通过污染饮水和食物经胃肠道进入机体。经口过污染饮水和食物经胃肠道进入机体。经口( (胃肠道胃肠道) )是急性毒性试验中是急性毒性试验中最常用最常用的染毒途径，的染毒途径，具体的染毒方式有：具体的染毒方式有：灌胃、喂饲和吞咽胶囊等灌胃、喂饲和吞咽胶囊等方法。方法。 2.2.经呼吸道经呼吸道染毒染毒( (inhalation)inhalation) 以气体、蒸气、粉尘、烟、雾等形以气体、蒸气、粉尘、烟、雾等形式存在于车间空气中的化学毒物和评价式存在于车间空气中的化学毒物和评价环境环境空气污染物空气污染物时，常采用时，常采用经呼吸道染经呼吸道染毒毒的途径。呼吸道染毒方式分为

15、两种：的途径。呼吸道染毒方式分为两种：一种是静式吸入，另一种是动式吸入。一种是静式吸入，另一种是动式吸入。 3.3.经皮肤经皮肤染毒染毒( (dermal exposure)dermal exposure) 液态、气态甚至粉尘状态的化学毒物液态、气态甚至粉尘状态的化学毒物均可能通过皮肤接触而吸收，尤以职业均可能通过皮肤接触而吸收，尤以职业接触为多见。接触为多见。 4.4.经注射经注射途径染毒途径染毒( (ingestion)ingestion) 采用注射途径进行外来化合物的急性采用注射途径进行外来化合物的急性毒性试验，主要用于毒性试验，主要用于比较毒性研究比较毒性研究，以及化，以及化合物的代谢

16、、毒物动力学和急救药物筛选等合物的代谢、毒物动力学和急救药物筛选等研究。注射途径可选择腹腔注射、静脉注射、研究。注射途径可选择腹腔注射、静脉注射、肌内注射皮下注射等。静脉注射方式包括肌内注射皮下注射等。静脉注射方式包括大大鼠和小鼠尾静脉、兔耳静脉鼠和小鼠尾静脉、兔耳静脉。四、急性毒性试验设计四、急性毒性试验设计 ( (三三) )染毒剂量与分组染毒剂量与分组 首先了解化学毒物的结构式、分子量、常温常压首先了解化学毒物的结构式、分子量、常温常压下的状态、熔点、沸点、比密、闪点、挥发度、蒸气下的状态、熔点、沸点、比密、闪点、挥发度、蒸气压、水溶性和脂溶性等压、水溶性和脂溶性等理化特性理化特性，生产批

17、号及纯度，生产批号及纯度，杂质成分与含量等。其次，确定使用哪一种计算方法杂质成分与含量等。其次，确定使用哪一种计算方法求求LDLD5050，然后再设计剂量分组。然后再设计剂量分组。LDLD5050的计算方法常用寇的计算方法常用寇氏法、概率单位法、霍恩法等。氏法、概率单位法、霍恩法等。 设计剂量时有设计剂量时有两种方式两种方式： 1.1.有有相关毒性资料可供参考者相关毒性资料可供参考者 查阅文献，找出与受试化学毒物结构与理化性质查阅文献，找出与受试化学毒物结构与理化性质近似近似的化学物的毒性资料，以文献资料中相同的动物的化学物的毒性资料，以文献资料中相同的动物种系和相同接触途径所测得的种系和相同

18、接触途径所测得的LDLD5050(LC(LC5050) )值作为受试化值作为受试化学物的预期毒性学物的预期毒性中值中值。以此预期值作为待测化学物的。以此预期值作为待测化学物的中间剂量组，并在该剂量的上下各设计中间剂量组，并在该剂量的上下各设计1-21-2个剂量组作个剂量组作为预试验剂量。每个剂量组间的组距可以大些，以便为预试验剂量。每个剂量组间的组距可以大些，以便寻找出受试物的致死剂量范围。寻找出受试物的致死剂量范围。 2.2.没有没有毒性资料可供查阅者毒性资料可供查阅者 在完全没有毒性资料参考的情况下，在完全没有毒性资料参考的情况下，一种一种备受推备受推荐的方法是进行最大耐受量试验荐的方法是

19、进行最大耐受量试验( (limit tests)limit tests)，该法该法多被用于食品、日用化学品等一些被视为毒性很低的多被用于食品、日用化学品等一些被视为毒性很低的化学物质的毒性鉴定。化学物质的毒性鉴定。 依据各类化学物质的急性毒性分级标准，依据各类化学物质的急性毒性分级标准，以最大以最大耐受量作为试验剂量耐受量作为试验剂量，如，如WHOWHO规定经口为规定经口为5 5 g gkgkg、经经皮肤接触为皮肤接触为2 2 g gkgkg、经呼吸道为经呼吸道为5 5 mgmgL L。 另一种另一种方法是设定方法是设定以以1 1 mgmgkgkg为最低剂量组为最低剂量组( (lg1=0)lg

20、1=0)，其它剂量组依次为对数值其它剂量组依次为对数值0.60.6、1.21.2、1.81.8、2.42.4，其实际，其实际剂量分别为剂量分别为4 4 mgmgkgkg、16 mg16 mgkgkg、64 mg64 mgkgkg和和128 128 mgmgkgkg，进行预试验。若预试验提示受试物的致死剂量范进行预试验。若预试验提示受试物的致死剂量范围较窄，也可将组距缩小为对数值围较窄，也可将组距缩小为对数值0.20.2，即剂量组间比值，即剂量组间比值为为1.61.6，即，即lg40=1.6lg40=1.6。 通过以上方法找出受试物的大致致死范围后通过以上方法找出受试物的大致致死范围后( (即死

21、亡即死亡率从率从0 0 10 10 至至90 90 100 100 ) )，即可设计正式试验，即可设计正式试验的剂量和分组。的剂量和分组。 一般来说，根据试验设计所选用的一般来说，根据试验设计所选用的LDLD5050计算计算方法来确定组数方法来确定组数。例如概率单位法、寇氏法一。例如概率单位法、寇氏法一般设般设6 61010个剂量组；霍恩法固定设个剂量组；霍恩法固定设4 4个剂量组。个剂量组。可根据以下公式计算出剂量分组：可根据以下公式计算出剂量分组： i=(lgLD i=(lgLD9090-lgLD-lgLD1010) )(n-1)(n-1) 或：或：i=(lgLDi=(lgLD100100

22、-lgLD-lgLD0 0) )(n-1)(n-1) 式中式中i i为组距为组距( (相邻的两个剂量组对数剂量之相邻的两个剂量组对数剂量之差差) )；n n为设计的剂量组数。为设计的剂量组数。 求得求得i i值后，以最低剂量组值后，以最低剂量组( (LDLD0 0或或LDLD1010) )的对数剂的对数剂量加上一个量加上一个i i值，即是第二个剂量组的对数剂值，即是第二个剂量组的对数剂量，依此类推直至最高剂量组，查各自的反对量，依此类推直至最高剂量组，查各自的反对数即得出各组剂量的真实值。数即得出各组剂量的真实值。四、急性毒性试验设计四、急性毒性试验设计 ( (四四) )试验周期与毒效应观察试

23、验周期与毒效应观察 化学毒物的化学毒物的LDLD5050(LC(LC5050) )的测定一般要求计的测定一般要求计算实验动物接触受试物后算实验动物接触受试物后1414天内天内的总死亡数。的总死亡数。 值得注意的是：不同的化学物其中毒症状值得注意的是：不同的化学物其中毒症状出现的时间和特点各有不同，而且引起动物死出现的时间和特点各有不同，而且引起动物死亡的时间也存在很大的个体差异。亡的时间也存在很大的个体差异。 观察实验动物以化学毒物染毒后出现的观察实验动物以化学毒物染毒后出现的中毒中毒表现表现，对于了解化学毒物的急性毒作用特征非，对于了解化学毒物的急性毒作用特征非常重要，可以补充单纯以常重要，

24、可以补充单纯以LDLD5050(LC(LC5050) )表示急性表示急性毒性的不足。毒性的不足。 1.1.中毒症状中毒症状 试验过程应详细地观察和记录动物出现试验过程应详细地观察和记录动物出现的的中毒症状、发生的时间、症状发展的经过、中毒症状、发生的时间、症状发展的经过、死亡前的特征以及死亡时间死亡前的特征以及死亡时间等。等。 2.2.体重体重 在观察实验动物中毒症状的过程中，应同在观察实验动物中毒症状的过程中，应同时观察体重的变化。时观察体重的变化。 3.3.病理检查及其它指标病理检查及其它指标 急性毒性试验中，急性毒性试验中，对死亡的动物均对死亡的动物均应及时进行大体解剖和病理组织学检查，

25、应及时进行大体解剖和病理组织学检查，肉眼观察主要脏器的大体病理变化，肉眼观察主要脏器的大体病理变化，如如脏器大小、外观、色泽的变化，有无充脏器大小、外观、色泽的变化，有无充血、出血、水肿或其它改变，对有改变血、出血、水肿或其它改变，对有改变的脏器进行取材做组织病理学检查。的脏器进行取材做组织病理学检查。 4.4.死亡和死亡时间死亡和死亡时间 重点观察和记录每只动物死亡的时间，特重点观察和记录每只动物死亡的时间，特别是最早出现死亡的时间以及各个剂量组动物的别是最早出现死亡的时间以及各个剂量组动物的死亡数。死亡数。 急性毒性试验结束时，除了报告该化学毒物急性毒性试验结束时，除了报告该化学毒物的的L

26、DLD5050值和急性毒性定级外；还应对其它的毒值和急性毒性定级外；还应对其它的毒性参数和中毒特征加以报告。性参数和中毒特征加以报告。第二节第二节 蓄积毒性作用及其评价蓄积毒性作用及其评价一、基本概念一、基本概念 化学毒物进入机体后，经过生物转化以代化学毒物进入机体后，经过生物转化以代谢产物或化学物原型排出体外。但是，当化学谢产物或化学物原型排出体外。但是，当化学毒物反复多次给动物染毒，毒物反复多次给动物染毒，化学毒物进入机体化学毒物进入机体的速度的速度( (或总量或总量) )超过超过代谢转化的速度和排泄的代谢转化的速度和排泄的速度速度( (或总量或总量) )时时，化学毒物或其代谢产物就有，化

27、学毒物或其代谢产物就有可能在机体内逐渐增加并贮留，这种现象称为可能在机体内逐渐增加并贮留，这种现象称为化学毒物的化学毒物的蓄积作用蓄积作用( (accumulation)accumulation)。 化学毒物容易蓄积的组织和器官称为化学毒物容易蓄积的组织和器官称为储存储存库库( (depot)depot)。机体常见的储存库有血浆蛋白、机体常见的储存库有血浆蛋白、脂肪组织、肝脏、肾脏、骨骼等。脂肪组织、肝脏、肾脏、骨骼等。 蓄积是化学毒物分布的一种特殊方式。出蓄积是化学毒物分布的一种特殊方式。出现蓄积作用时，化学毒物在体内的分布常表现现蓄积作用时，化学毒物在体内的分布常表现为相对集中的形式。为相

28、对集中的形式。 蓄积作用实际上有蓄积作用实际上有二个含义二个含义： 当实验动物反复多次接触化学毒物一定时间当实验动物反复多次接触化学毒物一定时间之后，用化学分析方法能够测得机体内之后，用化学分析方法能够测得机体内( (或某些组或某些组织器官内织器官内) )存在该化学毒物的原型或其代谢产物时，存在该化学毒物的原型或其代谢产物时，称之为称之为物质蓄积物质蓄积( (material accumulation)material accumulation)， 如机体生物材料如机体生物材料( (血、尿等血、尿等) )检定重金属铅、镉、检定重金属铅、镉、锰、汞含量升高；锰、汞含量升高；有的化学毒物在机体内虽

29、不能被测出，有的化学毒物在机体内虽不能被测出，然而在长期接触的情况下机体可以出现然而在长期接触的情况下机体可以出现慢性中毒的现象，这种情况称为慢性中毒的现象，这种情况称为功能蓄功能蓄积积( (functional accumulation)functional accumulation)。二、蓄积毒性试验方法及其评价二、蓄积毒性试验方法及其评价 化学毒物的化学毒物的蓄积作用是发生慢性中毒的蓄积作用是发生慢性中毒的物质基础物质基础，因此研究化学毒物在机体内的蓄积，因此研究化学毒物在机体内的蓄积性是性是评价化学毒物能否引起潜在慢性毒性的依评价化学毒物能否引起潜在慢性毒性的依据之一据之一，也是卫生标

30、准制订过程选择安全系数，也是卫生标准制订过程选择安全系数的主要依据。的主要依据。 蓄积毒性试验蓄积毒性试验是研究化学毒物基础毒性的重要是研究化学毒物基础毒性的重要内容之一，内容之一，目的目的是通过试验是通过试验求出蓄积系数求出蓄积系数K K，了了解化学毒物蓄积毒性的强弱，并为慢性毒性试解化学毒物蓄积毒性的强弱，并为慢性毒性试验及其他有关毒性试验的剂量选择提供参考。验及其他有关毒性试验的剂量选择提供参考。 当大鼠经口当大鼠经口LDLD5050大于大于5000 5000 mgmgkgkg，或已作或已作过代谢试验有半减期过代谢试验有半减期( (t t1/21/2) )数据者，可不做蓄积数据者，可不做

31、蓄积毒性试验。毒性试验。 蓄积毒性的研究方法有多种，常用的方法是：蓄积毒性的研究方法有多种，常用的方法是： ( (一一) )蓄积系数法蓄积系数法 蓄积系数法是一种以生物效应为指标，用经蓄积系数法是一种以生物效应为指标，用经验系数验系数( (K)K)评价蓄积作用的方法，即将多次染毒与评价蓄积作用的方法，即将多次染毒与一次染毒所产生的毒性效应一次染毒所产生的毒性效应( (或死亡或死亡) )进行比较。进行比较。蓄积系数蓄积系数( (accumulation coefficient)accumulation coefficient)是是多次多次染染毒使半数动物出现效应毒使半数动物出现效应( (或死亡或

32、死亡) )的累积剂量的累积剂量 EDED5050(n)(n) 与与一次一次染毒使半数动物出现相同效应染毒使半数动物出现相同效应( (或或死亡死亡) )的剂量的剂量 EDED5050(1)(1) 的比值，的比值， K=ED50(n)/ED50(1) 在毒理学领域研究化学毒物的蓄积作用在毒理学领域研究化学毒物的蓄积作用时多选择小鼠或大鼠为实验动物，以动物死亡时多选择小鼠或大鼠为实验动物，以动物死亡一半为效应指标，那么上式可改写为：一半为效应指标，那么上式可改写为： K=LD50(n)/LD50(1) K K值越值越小小，表示化学毒物的蓄积性越，表示化学毒物的蓄积性越大大。 蓄积系数法常用的蓄积系数

33、法常用的实验方案实验方案主要有：主要有： 1 1. .固定剂量法固定剂量法 一般常选用大、小鼠灌胃或腹腔注射方法进行染毒。一般常选用大、小鼠灌胃或腹腔注射方法进行染毒。先求出先求出LDLD5050，然后选取相同条件的然后选取相同条件的4040只只( (或更多或更多) )实验动实验动物，分为两组，一为染毒组，一为对照组，每组至少物，分为两组，一为染毒组，一为对照组，每组至少2020只，雌雄各半。染毒组每日定时、定量给予受试化学物，只，雌雄各半。染毒组每日定时、定量给予受试化学物，每日染毒剂量固定，每日染毒剂量固定，剂量设计在剂量设计在1/20-1/51/20-1/5之间之间，且记录，且记录染毒动

34、物死亡数，染毒动物死亡数，至累计一半动物死亡时终止实验至累计一半动物死亡时终止实验，计，计算算K K值。若累计染毒剂量已达值。若累计染毒剂量已达5 LD5 LD5050 ，也可终止实验，也可终止实验，此时此时K K大于等于大于等于5 5 2.2.剂量递增法剂量递增法 试验方案同上，仅是实验开始时染毒组按试验方案同上，仅是实验开始时染毒组按0.10.1LDLD5050剂量给予化学毒物染毒，以剂量给予化学毒物染毒，以4 4天为一期天为一期，按一定比例（一般是按一定比例（一般是1.51.5倍倍）增加染毒剂量。）增加染毒剂量。 3.3.剂量固定的剂量固定的2020天蓄积法天蓄积法 该法为我国农药登记毒

35、理学试验方法该法为我国农药登记毒理学试验方法( (GB15670-1995)GB15670-1995)中关于蓄积毒性试验的方法之中关于蓄积毒性试验的方法之一，也是基于蓄积系数的原理而设计的。一，也是基于蓄积系数的原理而设计的。 ( (二二) )生物半减期法生物半减期法 生物半减期生物半减期( (biological half-lifebiological half-life，t t1/21/2) )法是用毒物动力学原理描述化学毒物在机体内法是用毒物动力学原理描述化学毒物在机体内的蓄积作用。的蓄积作用。外源化学物在体内消除一半所用外源化学物在体内消除一半所用的时间的时间。 化学毒物在体内蓄积的速

36、度和量与机体单位时间化学毒物在体内蓄积的速度和量与机体单位时间内吸收该物质的速度以及清除速度有关。当化学毒物内吸收该物质的速度以及清除速度有关。当化学毒物的吸收过程与代谢转化的吸收过程与代谢转化- -清除的过程达到平衡时，其蓄清除的过程达到平衡时，其蓄积量基本上不再增加。积量基本上不再增加。 一般来说，一般来说，t t1/21/2较短较短的化学毒物达到蓄积极限所需的化学毒物达到蓄积极限所需的时间也的时间也短短，t t1/21/2长长者达到蓄积极限的时间也者达到蓄积极限的时间也长长。化学。化学毒毒t t1/21/2与其在体内蓄积过程的典型曲线关系。与其在体内蓄积过程的典型曲线关系。 一种化学毒物

37、若一种化学毒物若以以t t1/21/2相等的时间间距染毒相等的时间间距染毒，其在体内经过其在体内经过6 6个个t t1 12 2的接触期就的接触期就可以基本上可以基本上达到蓄积的极限达到蓄积的极限，此时理论蓄积量达到极限值，此时理论蓄积量达到极限值的的98.4%98.4%。此后即使继续接触该物质，机体内。此后即使继续接触该物质，机体内的蓄积量基本上也不会再增加。的蓄积量基本上也不会再增加。 ( (三三) )蓄积率蓄积率 外来化学物的蓄积性试验也可通过蓄积外来化学物的蓄积性试验也可通过蓄积率测定来完成。蓄积率是指在一定时间内，外率测定来完成。蓄积率是指在一定时间内，外来化学物在体内的蓄积量与同一

38、期间进入机体来化学物在体内的蓄积量与同一期间进入机体总量的百分比。蓄积率越高，该化学物质蓄积总量的百分比。蓄积率越高，该化学物质蓄积可能性也大。可能性也大。第三节第三节 亚慢性、慢性毒性作用亚慢性、慢性毒性作用及其评价及其评价 一、基本概念及试验目的一、基本概念及试验目的 1. 1.亚慢性毒性亚慢性毒性( (subchronic toxicity)subchronic toxicity)是指人是指人或实验动物或实验动物连续接触较长时间、较大剂量连续接触较长时间、较大剂量的化的化学毒物所出现的中毒效应。学毒物所出现的中毒效应。接触时间接触时间通常指通常指介介于单次染毒和于单次染毒和10 10 动

39、物寿命动物寿命的范围（的范围（大、小鼠大、小鼠一般一般9090天天）。较大剂量是相对于低剂量而言，）。较大剂量是相对于低剂量而言，没有明确的剂量范围下限，剂量上限一般小于没有明确的剂量范围下限，剂量上限一般小于急性急性LDLD5050。 试验试验目的目的是：是： 获取亚慢性毒性的获取亚慢性毒性的参数参数如如最大无作用剂量最大无作用剂量( (NOAEL)NOAEL)和和最小有作用剂量最小有作用剂量，估测阈剂量，为慢估测阈剂量，为慢性毒性试验和致癌试验的剂量设计提供依据；性毒性试验和致癌试验的剂量设计提供依据； 了解亚慢性染毒情况下化学毒物的了解亚慢性染毒情况下化学毒物的毒作用性毒作用性质、特点和

40、特异靶器官质、特点和特异靶器官，并为慢性毒性试验选并为慢性毒性试验选择合适的观察指标提供依据择合适的观察指标提供依据。此外，亚慢性毒。此外，亚慢性毒性试验也可作为慢性毒性试验的预备试验。性试验也可作为慢性毒性试验的预备试验。 2.2.慢性毒性慢性毒性( (chronic toxicity)chronic toxicity)是指人或实是指人或实验动物验动物长期长期( (甚至终生甚至终生) )反复接触反复接触低剂量低剂量的化学的化学毒物所产生的毒性效应。毒物所产生的毒性效应。 许多化学物质在环境中的浓度并不具有明许多化学物质在环境中的浓度并不具有明显的急性毒性，然而在长期慢性接触的情况下，显的急性

41、毒性，然而在长期慢性接触的情况下，其潜在的累积的效应变得明显起来，如急性接其潜在的累积的效应变得明显起来，如急性接触二恶英触二恶英( (dioxin)dioxin)和多氯联苯和多氯联苯( (PCBs)PCBs)。 试验的试验的目的目的 确定确定长期长期接触化学毒物造成机体损害的接触化学毒物造成机体损害的最最小作用剂量或阈剂量小作用剂量或阈剂量和对机体无害的和对机体无害的最大无作最大无作用剂量用剂量，阐明化学毒物，阐明化学毒物慢性毒作用的性质、靶慢性毒作用的性质、靶器官和中毒机制器官和中毒机制，为制定化学物质的人类接触，为制定化学物质的人类接触安全限量标准安全限量标准如如最高容允许浓度最高容允许

42、浓度( (MAC)MAC)和每日和每日容许摄入量容许摄入量( (ADI)ADI)以及进行危险度评定提供毒以及进行危险度评定提供毒理学依据。理学依据。 二、亚慢性毒性试验设计二、亚慢性毒性试验设计 ( (一一) )实验动物实验动物 实验动物应考虑它对化学毒物的代谢过程、实验动物应考虑它对化学毒物的代谢过程、生理反应和生化特性基本上与人接近，而且在生理反应和生化特性基本上与人接近，而且在急性毒性试验中证明是对受试物敏感的物种和急性毒性试验中证明是对受试物敏感的物种和品系。品系。一般要求选择一般要求选择两个动物种属，即啮齿类两个动物种属，即啮齿类( (如大鼠、家兔如大鼠、家兔) )和非啮齿类和非啮齿

43、类( (如狗、猴如狗、猴) )，以全，以全面了解化学毒物的毒性特征。种系选择多用纯面了解化学毒物的毒性特征。种系选择多用纯系动物，如大鼠常用系动物，如大鼠常用WistarWistar和和Sprague-DawleySprague-Dawley品系，小鼠选昆明等。品系，小鼠选昆明等。 试验要求动物雌雄各半，但在一些特殊研究试验要求动物雌雄各半，但在一些特殊研究中也可以仅使用一种性别的动物，中也可以仅使用一种性别的动物，如研究化学如研究化学毒物的性腺毒性或生殖毒性。此外，毒物的性腺毒性或生殖毒性。此外，由于亚慢由于亚慢性试验期较长，所以一般选择性试验期较长，所以一般选择刚断乳刚断乳的健康动的健康动

44、物，如体重为物，如体重为15 15 g g左右的小鼠，左右的小鼠，100 100 g g左右的左右的大鼠大鼠。各试验组及对照组动物数应相同，体重。各试验组及对照组动物数应相同，体重( (年龄年龄) )相近，同组动物体重相差不超过平均体相近，同组动物体重相差不超过平均体重的重的1010，组间平均体重相差不超过，组间平均体重相差不超过5 5。 小动物小动物( (如大鼠、小鼠如大鼠、小鼠) )每组每组不应少不应少于于2020只只，大动物大动物( (如狗、猴如狗、猴) )每组不每组不少于少于6 68 8只。只。若试验要求在试验中若试验要求在试验中期处死部分动物进行病理学观察，期处死部分动物进行病理学观

45、察，则每组动物数要相应增加。则每组动物数要相应增加。 亚慢性毒性试验的期限亚慢性毒性试验的期限“多日多日”的的确切天数，至今尚无完全统一的认确切天数，至今尚无完全统一的认识。一般认为在环境毒理学与食品识。一般认为在环境毒理学与食品毒理学中所要求的连续接触为毒理学中所要求的连续接触为3 36 6个月，而在工业毒理学中认为个月，而在工业毒理学中认为1 13 3月即可。月即可。 现有学者主张进行实验动物现有学者主张进行实验动物9090天天喂饲喂饲试验为亚慢性毒性试验，即将受试物试验为亚慢性毒性试验，即将受试物混合物饲料或饮水中，动物自然摄取混合物饲料或饮水中，动物自然摄取连续连续9090天。天。 (

46、 (二二) )染毒途径染毒途径 染毒途径的选择应尽量染毒途径的选择应尽量采用人群实际接触采用人群实际接触的途径和方式的途径和方式，并与预期进行慢性毒性试验的并与预期进行慢性毒性试验的接触途径相一致接触途径相一致。一般以经口、经呼吸道和经。一般以经口、经呼吸道和经皮肤染毒三种途径为多。染毒频率皮肤染毒三种途径为多。染毒频率( (dosing dosing frequency)frequency)一般一般每日一次每日一次，经口染毒分为，经口染毒分为喂饲喂饲法和灌胃法。法和灌胃法。经呼吸道吸人染毒经呼吸道吸人染毒时间时间通常为每日通常为每日6 6小时小时，工，工业毒物可以缩短至业毒物可以缩短至1 1

47、小时或延长，环境污染物小时或延长，环境污染物可延长至可延长至8 8小时。小时。经皮染毒经皮染毒一般一般每天每天6 6小时小时，而且，而且每周每周应对染毒应对染毒部位部位脱毛一次脱毛一次。 一般设一般设3 3个个剂量组剂量组和和1 1个阴性对照组个阴性对照组，必要时再，必要时再加加1 1个溶剂对照组。个溶剂对照组。 低剂量组低剂量组的剂量应相当于的剂量应相当于亚慢性的阈剂量水平亚慢性的阈剂量水平或未观察到作用水平或未观察到作用水平， 中剂量组中剂量组动物以动物以出现出现轻微轻微中毒效应中毒效应为度，相当为度，相当于有害作用的最低剂量。于有害作用的最低剂量。 高剂量组高剂量组的染毒剂量应使动物在染

48、毒期间产的染毒剂量应使动物在染毒期间产生生明显明显的中毒症状的中毒症状或某项观察指标发生明显的改或某项观察指标发生明显的改变，变，但不会引起动物死亡但不会引起动物死亡，即使有死亡，也应少即使有死亡，也应少于于1010的动物数。的动物数。 通常可通常可根据两个数据来确定最高剂量根据两个数据来确定最高剂量，即以，即以该化学物该化学物急性毒性的阈剂量急性毒性的阈剂量( (同一动物品系和同样同一动物品系和同样的染毒途径的染毒途径) )或以该化学物的或以该化学物的1/201/201/5 1/5 LDLD5050作为作为最高染毒剂量；最低剂量组的动物应无中毒反应最高染毒剂量；最低剂量组的动物应无中毒反应或

49、仅有极其轻微的反应，相当于亚慢性的阈剂量或仅有极其轻微的反应，相当于亚慢性的阈剂量或或NOAELNOAEL水平。水平。 ( (四四) )观察指标观察指标 通常包括通常包括一般性指标、特异性指标和组织一般性指标、特异性指标和组织病理学检查病理学检查。 1.1.一般性指标一般性指标 一般性指标主要指非特异的观察指标，能一般性指标主要指非特异的观察指标，能综合反映化学毒物对机体的毒作用，而且常常综合反映化学毒物对机体的毒作用，而且常常是是敏感的综合毒效应指标敏感的综合毒效应指标。在试验过程中，只。在试验过程中，只要详细记录，仔细分析，往往可以从中发现一要详细记录，仔细分析，往往可以从中发现一些化学毒

50、物的毒性特征。这些指标通常些化学毒物的毒性特征。这些指标通常包括包括： 动物体重动物体重：实验动物在亚慢性方式接触：实验动物在亚慢性方式接触外来化合物过程中，有多种因素均可影响外来化合物过程中，有多种因素均可影响动物体重的增长，包括食欲变化、消化功动物体重的增长，包括食欲变化、消化功能变化、代谢和能量消耗变化等。能变化、代谢和能量消耗变化等。 食物利用率食物利用率：亚慢性试验期间必：亚慢性试验期间必须注意观察并记录动物的饮食情况，须注意观察并记录动物的饮食情况，在此基础上计算食物利用率，即动在此基础上计算食物利用率，即动物物每食入每食入100100g g饲料所增长的体重克饲料所增长的体重克数数

51、。症状症状：实验动物在接触外来化：实验动物在接触外来化合物过程中所出现的合物过程中所出现的中毒症状及中毒症状及出现各症状的先后次序、时间出现各症状的先后次序、时间均均应记录和分析。应记录和分析。 脏器系数脏器系数：或称：或称脏脏/ /体比值体比值，是指某个，是指某个脏器的湿重与单位体重的比值，通常以脏器的湿重与单位体重的比值，通常以100100g g体重计。如肝体重计。如肝/ /体比，即体比，即( (全肝全肝湿重湿重/ /体重体重) ) 100100。 生化检验指标生化检验指标：常规生化检查一般包：常规生化检查一般包括血象、肝、肾功能的检测，所选指标括血象、肝、肾功能的检测，所选指标多具筛检性

52、。多具筛检性。 2.2.病理学检查病理学检查 病理组织学检查是亚慢性毒性试验病理组织学检查是亚慢性毒性试验中最重要的检测指标之一，中最重要的检测指标之一，目的目的是是确定确定化学毒物对机体毒作用的化学毒物对机体毒作用的靶部位、损害靶部位、损害的性质和程度的性质和程度，从病理学角度寻找化学，从病理学角度寻找化学毒物与病理改变的剂量效应关系，为了毒物与病理改变的剂量效应关系，为了解化学毒物的毒效应及其机制提供依据。解化学毒物的毒效应及其机制提供依据。 病理学检查病理学检查包括：大体检查、常规病理包括：大体检查、常规病理组织学检查、酶组织化学检查、免疫组组织学检查、酶组织化学检查、免疫组织化学检查、

53、细胞超微结构检查等织化学检查、细胞超微结构检查等，分分别从大体、组织、细胞、亚细胞甚至分别从大体、组织、细胞、亚细胞甚至分子水平等多个方面发现化学毒物的毒效子水平等多个方面发现化学毒物的毒效应应。3.3.特异性指标特异性指标 特异性指标可以反映受试物的特异性指标可以反映受试物的毒作用本毒作用本质质，也有助于取得中毒机制的线索。但是在中，也有助于取得中毒机制的线索。但是在中毒机制不明确的情况下往往毒机制不明确的情况下往往难以选择难以选择。一般从。一般从分析受试物的化学结构或急性或亚急性毒性特分析受试物的化学结构或急性或亚急性毒性特征时发现线索征时发现线索 三、慢性毒性实验设计三、慢性毒性实验设计

54、 慢性毒性是指以低剂量外来化合物长期给慢性毒性是指以低剂量外来化合物长期给予实验动物接触，观察其对实验动物所产生的予实验动物接触，观察其对实验动物所产生的毒性效应。毒性效应。是化学毒物一般毒性评价程序中的是化学毒物一般毒性评价程序中的最重要最重要的实验，也是的实验，也是最后阶段最后阶段的试验的试验，在化学，在化学物质安全性毒理学评价中具有十分重要的作用。物质安全性毒理学评价中具有十分重要的作用。该实验周期长、目的性强，其结果是制定化学该实验周期长、目的性强，其结果是制定化学物质物质安全限量标准安全限量标准的重要依据。的重要依据。 ( (一一) )实验动物实验动物 与亚慢性毒性试验相同。为减少个

55、体差异，与亚慢性毒性试验相同。为减少个体差异，最好用纯系动物并将同窝动物均匀地分配到各最好用纯系动物并将同窝动物均匀地分配到各剂量组和对照组。剂量组和对照组。 一般要求选用两个种属的实验动物，即啮一般要求选用两个种属的实验动物，即啮齿类和非啮齿类，目前对啮齿类动物首选大鼠，齿类和非啮齿类，目前对啮齿类动物首选大鼠，非啮齿类为狗或猴。非啮齿类为狗或猴。每个剂量组的动物数应满每个剂量组的动物数应满足试验结束时数据统计学处理的要求，足试验结束时数据统计学处理的要求，如如大鼠大鼠40406060只，狗只，狗8 81010只只，雌雄各半。，雌雄各半。慢性毒性试验期长，故应选择年龄较小的动物，慢性毒性试验

56、期长，故应选择年龄较小的动物，一般选一般选初断奶初断奶的大鼠或小鼠，即小鼠出生后的大鼠或小鼠，即小鼠出生后3 3周周( (体重约体重约101015 15 g g) )，大鼠出生大鼠出生3 34 4周周( (体重约体重约505070 70 g g) )，狗一般在狗一般在4 46 6月月龄时开始试验。龄时开始试验。 ( (二二) )实验目的实验目的 慢性毒性实验是慢性毒性实验是确定外来化合物的确定外来化合物的毒性下限毒性下限，即长期接触该化合物可以引起，即长期接触该化合物可以引起机体危害的机体危害的阈剂量和无作用剂量阈剂量和无作用剂量。为进行。为进行该化合物的危险性评价与制定人接触该化该化合物的危

57、险性评价与制定人接触该化合物的安全限量标准提供毒理学依据，如合物的安全限量标准提供毒理学依据，如最高容许浓度和每日容许摄入量最高容许浓度和每日容许摄入量等。等。 ( (三三) )染毒时间与期限染毒时间与期限 一般认为工业毒理学慢性试验动物一般认为工业毒理学慢性试验动物染毒染毒6 6个月或更长时间个月或更长时间；而环境毒理学与；而环境毒理学与食品毒理学则要求实验动物染毒食品毒理学则要求实验动物染毒1 1年以上年以上或或2 2年年。也有学者主张动物终生接触外来也有学者主张动物终生接触外来化合物才能全面反映外来化合物的慢性化合物才能全面反映外来化合物的慢性毒性效应，以及求出阈剂量或无作用剂毒性效应，

58、以及求出阈剂量或无作用剂量。量。 慢性毒性试验多为慢性毒性试验多为经口与经呼经口与经呼吸道接触吸道接触。经呼吸道接触，每日接。经呼吸道接触，每日接触时间，依实验要求而定。工业毒触时间，依实验要求而定。工业毒物的试验通常每日吸入物的试验通常每日吸入4 46 6小时。小时。环境污染物一般要求每日吸入环境污染物一般要求每日吸入8 8小时小时或更长。或更长。 ( (四四) )剂量分组剂量分组 剂量设计一般以亚慢性毒性试验数剂量设计一般以亚慢性毒性试验数据据( (阈剂量或最大无作用剂量阈剂量或最大无作用剂量) )、人群期、人群期望接触剂量等为依据。理想的剂量选择望接触剂量等为依据。理想的剂量选择应能体现

59、：应能体现：一种毒性物质的剂量一种毒性物质的剂量- -反应反应关系；最大无作用水平关系；最大无作用水平( (NOAEL)NOAEL)；最最高剂量组能观察到某些毒作用所致变化。高剂量组能观察到某些毒作用所致变化。 慢性毒性试验一般设慢性毒性试验一般设3 3个染毒剂量组和个染毒剂量组和1 1个对照组，必要时另设个对照组，必要时另设1 1个溶剂对照组，个溶剂对照组，一般认为以一般认为以亚慢性亚慢性毒性试验毒性试验阈值阈值的的1/51/51/21/2为其为其最高剂量组最高剂量组，以亚慢性阈，以亚慢性阈值的值的1/501/501/101/10为慢性试验的为慢性试验的中间剂量中间剂量组组，以，以1/100

60、1/100亚慢性阈值为亚慢性阈值为最低剂量组最低剂量组。 在在没有没有亚慢性试验资料的情况下亚慢性试验资料的情况下，可以参，可以参照照LDLD5050值设计剂量组，如以值设计剂量组，如以1/101/10LDLD5050为最高剂为最高剂量量，以，以1/100 1/100 LDLD5050为预期慢性阈剂量为预期慢性阈剂量，1/1000 1/1000 LDLD5050为最大无作用剂量组为最大无作用剂量组。各染毒剂量组之间。各染毒剂量组之间的剂量间距应当大一些，组间剂量差一般以的剂量间距应当大一些，组间剂量差一般以5 51010倍为宜，最低不小于两倍，以利于求出倍为宜，最低不小于两倍，以利于求出剂量剂