实验一 纤维素的微生物降解

1、实验一 纤维素的微生物降解 一、实验目的1、掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征；进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术；掌握微生物培养方法。2、了解纤维素分解的基本理论，并掌握有关纤维素好氧和厌氧分解的一些基本实验技术。二、实验原理1、从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化2、常用的分离纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法等。稀释涂布平板法的步骤：倒平板制备土壤污水稀释液涂布培养挑菌落；平板划线法的步骤：倒平板标记培养基名称划线。3、测定纤

2、维素分解酶，可观察其对提供的唯一碳源滤纸纤维的分解情况确定。如果滤纸溃烂，说明有纤维素分解菌的作用。4、纤维素分解微生物可根据需氧的与否分为两大类：好氧分解微生物和厌氧分解微生物。三、实验材料1. 培养基 A. 赫奇逊液固体培养基（好氧）：KH2PO4 ，MgSO47H2O ，FeCl3 ，CaCl2 ，NaNO3 ，蒸馏水1000ml，pH值为，灭菌20min。B. 厌氧液体培养基：牛肉膏，蛋白胨，水1000ml，CaCO3 ；灭菌20min。2. 器材3mm粒度菜园土。B.镊子，无淀粉滤纸，1ml和10ml无菌吸管，无菌水，天平。3、土样： 格物楼西，小树根部约10cm，地表覆盖较多枯叶、

3、枯草，取土深度约15cm。四、方法步骤1. 土粒法分离纤维素的好氧分解微生物 n 采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面515cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好、标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。n 将赫奇逊培养基趁热倒入培养皿，冷却后加直径近于培养皿的滤纸一张，用少量培养液润湿。 n 在滤纸上等距放10个近3mm粒度的土粒，2830静置培养。n 在每隔2d直到7d后，观察并记录土粒周围滤纸变色情况。n 当出现黄或棕绿色斑时，挑取少许不含土粒的变色纤维制片镜检，初步观察分解纤维素的细菌、真菌和放线菌。n 计算各类微生物的土粒占总土粒的比例。2.

4、 液体稀释法分离纤维素的厌氧分解微生物 n 制备土壤稀释液10-110-5。每个稀释度接种于1管培养基中，每管接种1ml。于2830培养静置培养一周。 n 取出滤纸条，检查溶解区并观察有无菌落生长。若有厌氧性纤维素分解菌生长，滤纸上常有黄、褐或黑色斑，滤纸条一摇动即破裂。n 由检查得出的数量指标，求出厌氧性纤维素分解菌的近似数并换算成每克干土中的数量。 注意事项：n 土粒法中，在出现变色斑后应当尽早观察菌体形态，同时可以转接到新的培养基滤纸上进一步培养。n 厌氧分解纤维素时，必须将滤纸条浸入深层环境。五、实验结果 1、第四天观察结果：（1）土粒法分解纤维素的好养分解微生物的培养基中的滤纸片上，

5、部分土粒周围较大且明显的黄色斑块出现，有的黄色不明显。39个土粒中有16个土粒周围有黄色斑块。 （2）液体稀释法分离纤维素的厌氧分解微生物的试管中，稀释度为10-1的试管中液体培养基呈褐色，液面有大量薄膜状物，滤纸片边缘有丝状物。10-2试管中，培养基仍无色但略显浑浊，液面有大量薄膜状滤纸碎片，滤纸边缘也有少量丝状物。10-3试管中液面薄膜少，培养集中有少量絮状物。10-4试管液面几乎无薄膜，底部有少量絮状物。10-5试管培养基中很少量碎片，液面无薄膜状物。2、第七天观察结果：（1）土粒法分解纤维素的好养分解微生物的培养基中的滤纸片上，有的土粒周围变为绿色，有的土粒周围有白色或黑色的霉菌菌苔出

6、现。纯细菌的土粒数（土粒周围仅绿色或黄色）为13个，白色或黑色菌苔着生在细菌至上的土粒数为10个。 （2）液体稀释法分离纤维素的厌氧分解微生物的试管中，稀释度为10-1的试管中液体培养基极为浑浊，近黑色，液面有大而厚的薄膜状物，滤纸片上有黑色、褐色斑点出现且数目较多。10-2试管中，培养基较浑浊，滤纸片上有少量黑色、褐色斑点出现，液面及内部均有较多滤纸碎片，底部有大块絮状物。10-3试管中培养基较透明，液面薄膜少，培养集中有絮状物但不多，滤纸片上有黑色斑点但数目很少。10-4试管培养基透明，底部有大块絮状物，液面薄膜少，液面上无明显斑点。10-5试管培养基透明，液面及培养基中絮状物均很少，滤纸

7、上无斑点。3、制片观察： （1）从土粒法分解纤维素的好养分解微生物的滤纸片上选择纯绿色、黄色的部分和霉菌菌落上，分别用接种针轻刮一下，制成水涂片，观察。 （2）从液体液体稀释法分离纤维素的厌氧分解微生物的10-3试管中，用移液枪吸取少量液体制片观察。 食纤维菌属 4、结果计算：项 目细 菌真 菌放 线 菌土 粒 数18120总 土 粒 数404040比 率(%)45300六、结果分析1、在所采集的土样中，分解纤维素的微生物易细菌为主，约占 45% ，真菌数约占30%，无放线菌存在。2、纤维素厌氧降解维生物的分离：试管中漂浮物为滤纸碎片和好氧及兼性厌氧微生物，底部滤纸片上附着的是厌氧微生物。3、

8、好氧性纤维素分解细菌n 食纤维菌属和生孢食纤维菌属是土壤中常见的好氧性纤维素分解细菌n 在滤纸上生长时，滤纸表面会出现淡黄色或其他颜色的菌落，并有粘液。肉眼可见，在长有菌落之处滤纸已溶解变薄n 用光学显微镜检查则可发现，在各个发育阶段菌落中的细菌呈现不同的形态。幼龄时，细胞弯曲，两头尖锐；以后逐渐缩短变粗，细胞呈弧形弯曲，类似食纤维菌。有的细菌还能形成小孢囊 4、分解纤维素的真菌n 许多真菌具有很强的纤维素分解能力。其中主要有木霉、镰刀霉、青霉、曲霉、毛霉、葡萄孢霉（ Botrytis ）等属的一些种。n 在森林的枯枝落叶中，占优势的纤维素分解菌是担子菌。在潮湿土壤中，真菌也是纤维素分解的优势菌群。 5、厌氧性纤维素分解微生物n 主要是芽孢梭菌属的一些种，如奥氏梭菌，它是中温性细菌，适宜的生长温度为 3337；另外还有一些与奥氏梭菌区别很小的嗜热性种，如热纤梭菌等n 莱姆德（ Lamed ）等发现在热纤梭菌表面存在着分散而不连续的细胞表面细胞器纤维素体，其中含有一种高分子量、连接纤维素的多个纤维素酶的蛋白质复合体，具有纤维素水解活性。细菌细胞首先通过这种纤维素体强烈粘附在纤维素上。在其他分解纤维素的厌氧微生物细胞表面也观察到不同的结构附属物，这些结构与细菌和纤