实验室设备及培养条件

1、2022-4-2912.1 实验室布局实验室布局 v 在进行植物组织培养工作之前，首先应在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需要哪些最基本的设备条件有个全对工作中需要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。或新建、改建实验室。2022-4-292v实验室的大小取决于工作的目的和规模：实验室的大小取决于工作的目的和规模： 1. 以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则会限制生产影响效率。会限制生产影响效率。 2.在设计组织培养实验室时，应按组织培养程在设计组织培养实验室时，

2、应按组织培养程序来设计序来设计 避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。v 植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。养条件。2022-4-293 标准的组织培养实验室包括：标准的组织培养实验室包括： 洗涤室（准备室） 配置室 灭菌室 接种室 培养室 观察室等 2022-4-294v1. 准备室准备室 器具的洗涤、干燥、消毒。 v2. 配置室配置室 进

3、行药品的保存、配置、消毒、分装 等。 v3. 灭菌室灭菌室 培养基及使用器具的消毒与灭菌v4. 接种室接种室 进行材料的接种，内置超净工作台或v 接种箱。外设缓冲间,放置拖鞋、v 工作服、工作帽等。 v5. 培养室培养室 将接种的材料进行无菌培养生长的 场所 v6. 细胞学观察实验室细胞学观察实验室 进行培养材料的组织学、 细胞学、观察照相等 2022-4-295v。准备室准备室缓冲间缓冲间(过渡室过渡室)接种室接种室(外设缓冲间外设缓冲间)培养室培养室2022-4-296 （一）仪器设备（一）仪器设备 1.超净工作台超净工作台(cleaning table): 用于培养物的无菌操作（由鼓风机

4、、滤板、操作台、紫外灯和照明灯组成）。 超净台分水平式和垂直式二种型号 2. 高压灭菌锅（手提式、立式或卧式）高压灭菌锅（手提式、立式或卧式） 用于进行培养基和器械用具的灭菌。小规模实验室可选用小型手提式高压灭菌锅。 2022-4-2972022-4-298高压灭菌锅高压灭菌锅手提式灭菌锅手提式灭菌锅超净工作台超净工作台2022-4-299 3.恒温培养箱恒温培养箱: 用于植物材料的培养，其用于植物材料的培养，其内有温度感受器，控制箱内温度到所调指标。内有温度感受器，控制箱内温度到所调指标。生化培养箱还配有光照装置。生化培养箱还配有光照装置。 4. 电子分析天平和托盘天平：电子分析天平和托盘天

5、平： 电子分析天电子分析天平，用于称取大量元素、微量元素、维生素、平，用于称取大量元素、微量元素、维生素、激素等微量药品精确度为激素等微量药品精确度为00001g；托盘；托盘天平用于称取用量较大的糖和琼脂等，其精天平用于称取用量较大的糖和琼脂等，其精确度为确度为0.1g。天平应放置在干燥、不受震动。天平应放置在干燥、不受震动的天平操作台上。的天平操作台上。2022-4-2910电子天秤电子天秤培养箱培养箱2022-4-2911 5. 酸度计：酸度计： 组织培养中培养基pH值的准确度是十分重要的，应当使用酸度计，若无酸度计，也可使用pH试纸进行粗测。首次使用酸度计前，应用标准液调节定位，然后固定

6、。测量pH值时，待测液必须充分搅拌均匀。如果培养基温度过高，测量时要调整pH值计上的温度扭使之和培养基温度相当。 6. 烘箱：烘箱： 用于干燥洗净的玻璃器皿，也可用于干热灭菌和测定干物重。用于干燥需保持80-100；进行干热灭菌需保持150，达1-3h；若测定干物重，则温度应控制在80烘干至完全干燥为止。2022-4-29122022-4-29132022-4-2914v 7. 培养架：培养架：放置培养材料。v 8. 紫外线杀菌灯紫外线杀菌灯：杀菌。v 9. 不锈钢托盘：不锈钢托盘：v 10. 定时器：定时器：控制光照时间。v 11.普通冰箱：普通冰箱：主要用于贮存母液、各种易变质、易分解的化

7、学药品以及植物材料等v 12. 大型工作台大型工作台: 其高度应方便配制工作。v 13. 药品柜药品柜: 用于放置常用药品。v 14. 解剖镜：解剖镜：种类较多，用于分离微茎尖可采用双筒实体解剖镜。解剖镜上带有照相装置，根据需要随时对所需材料进行摄影记录。 2022-4-2915仪仪仪仪仪仪 器器器器器器 设设设设设设 备备备备备备 1镊子类镊子类(forceps) 常应用医疗上的镊子。 根据操作需要有各种类型 2剪刀类剪刀类(scissors) 可采用医疗五官科用的中型剪刀。主要用于切断茎段、叶片等。也可以用弯形剪刀，由于其头部弯曲，可以深入到瓶口中进行剪切。2022-4-2916 3. 解

8、剖刀解剖刀: 切割较小材料和分离茎尖分生组织时，可用解剖刀。刀片要经常调换，使之保持锋利状态，否则切割时会造成挤压，引起周围细胞组织大量死亡，影响培养效果。 4. 解剖针解剖针: 解剖针可深入到培养瓶中，转移细胞或愈伤组织。也可用于分离微茎尖的幼叶，可以自制。 5. 接种盘接种盘:2022-4-2917仪仪仪仪仪仪 器器器器器器 设设设设设设 备备备备备备 组培瓶（玻璃）组培瓶（玻璃）-要求透光度好，能耐高压高温, 以试管、三角瓶、培 养皿等使用较多。v三角锥瓶三角锥瓶- 适用于各种培养（如固体培养、液体培养、大规模培养或一般培养）。v培养皿培养皿- 适于作单细胞的固体平板培养、胚和花药培养和

9、无菌发芽。v试管试管- 适合于用少量培养基及试验各种不同配方时选 用。 2022-4-2918仪仪仪 器器器 设设设 备备备v 培养器皿还可就地取材，采用一些代用品。培养器皿还可就地取材，采用一些代用品。工厂化生产可采用广口的200ml罐头瓶 .v 培养容器和制备培养基所需的玻璃器皿逐培养容器和制备培养基所需的玻璃器皿逐渐被塑料器皿所代替。渐被塑料器皿所代替。塑料容器具有质轻、透明、不易破碎、成本低等优点 v 瓶口封塞可用多种方法，要具有一定的通瓶口封塞可用多种方法，要具有一定的通气性和密闭性，以防止培养基干燥和杂菌气性和密闭性，以防止培养基干燥和杂菌污染。污染。现在多采用聚丙烯塑料薄膜作为封

10、口 ,为了增加通气性，可在里面衬一层硫酸纸或牛皮纸 .也可采用专用的封口膜。2022-4-2919仪仪仪 器器器 设设设 备备备v 在组织培养中配制培养基，贮藏母液，材料的消毒等需要各种化学实验用的玻璃器皿.v 包括各种型号的烧杯、量筒、移液管、试剂瓶、容量瓶、试管以及移液管架、酒精、玻璃棒、滴瓶等等。 2022-4-2920仪仪仪 器器器 设设设 备备备（四）其他（四）其他吸耳球、刷子、记号笔、定时钟、手套、封口膜、卫生药棉、拖鞋、口罩、白大褂、滤纸、洗瓶2022-4-2921细胞学实验室 该室用于对培养物的观察分析与培养物的计数等。主要设备：双筒实体显微镜、显微镜、倒置显微镜等。小型仪器设

11、备有：分注器、血球计数器、移液枪、过滤灭菌器、电炉等加热器具、磁力搅拌器、低速台式离心机等。2022-4-2922显微镜 2022-4-2923v玻璃器皿 培养用的：试管、三角瓶、培养皿等； 显微镜下观察用的：细胞微室、载玻片、培养皿等。v微孔过滤器（细胞过滤器） ：激素用于灭菌。v一般用石棉滤膜2022-4-2924v2.3.1培养基的成分培养基的成分v2.3.2培养基的种类培养基的种类v2.3.3培养基的配制培养基的配制2022-4-2925 v2.3.1.2 无机盐类无机盐类v（1）、大量元素）、大量元素v（2）、微量元素）、微量元素v2.3.1.3有机营养成分有机营养成分v（1）、碳源

12、）、碳源v（2）、维生素）、维生素v（3）、肌醇）、肌醇v（4）、氨基酸）、氨基酸2022-4-2926v（5）、天然复合物2022-4-2927v大量元素v微量元素v氨基酸和有机附加物v植物激素（植物生长调节剂）v维生素类v凝固剂2022-4-29282.3.1 培养基成分培养基成分2.3.1.2 无机营养成分无机营养成分2022-4-2929序号序号化学式化学式化学名称化学名称用量用量mg/l1KNO3硝酸钾硝酸钾19002NH4NO3硝酸铵硝酸铵16503KH2PO4磷酸二氢钾磷酸二氢钾 1704MgSO4.7H2O硫酸镁硫酸镁3705CaCL2.4H2O二氯化钙二氯化钙4402022-

13、4-2930序序号号化学名称化学名称化学式化学式用量用量（mg/l)1碘化钾碘化钾KI0.832硼酸硼酸H3BO36.23硫酸锰硫酸锰MnSO4.4H2O22.34硫酸锌硫酸锌ZnSO4.7H2O8.65钼酸钠钼酸钠Na2MoO4.2H2O 0.256硫酸铜硫酸铜CuSO4.5H2O0.0257氯化钾氯化钾CoCL2.6H2O0.0252022-4-2931序号 化学名称化学式用量(mg/l)1肌醇C6H12O6.2H2O1002甘氨酸NH2.CH2.COOH23盐酸硫胺素C12H17CLN4OS.HCL0.14盐酸吡哆醇C8H11O3N.HCL0.55烟酸NC5H4COOH0.52022-4

14、-29321、生长素类：、生长素类：IAA，IBA，2，4-D，NAA等。等。2、细胞分裂素类：、细胞分裂素类：KT，6-BA，ZT等。等。3、赤霉素类；、赤霉素类；GA1-GA4，GA7，GA9-GA16，GA24，GA25等等4、脱落酸：、脱落酸：ABA5、乙烯、乙烯6、PH值：值：5.6-5.8 2022-4-29332.3.1.5 其他成分其他成分（1） 活性碳活性碳（3） 硝酸银硝酸银（4） 抗生素抗生素（5） 琼脂及其他固化剂琼脂及其他固化剂（6） pH（2） 渗透压渗透压2022-4-2934v按性质分按性质分v基本培养基 ：MS、MT（Murashige and Tucher）

15、Whitev完全培养基 基本培养基 其它成分（激素、有机物质等）2022-4-2935v按状态分按状态分 固体培养基；液体培养基。v按作用分：诱导培养基；增值培养基、生根培养基。v按培养过程分：初代培养基、继代培养基。2022-4-2936l培养液的配制与保存培养液的配制与保存l培养基的配制培养基的配制2022-4-2937 成 分 用 量(g/l)每升培养基取用量(ml)母液母液1（大量元素）（大量元素）NH4NO3KNO3 MgSO4.7H2OCaCL2.2H2OKH2PO4母液母液2（微量元素）（微量元素）KIH3BO3MnSO4.4H20ZnSO4.7H2ONa2MoO4.2H2OCu

16、SO4.5H2OCoCL2.6H2O. 2022-4-2938 成 分用量（） 每升培养基用量（）母液母液3（铁盐）（铁盐）FeSO4.7H2ONa2.EDTA.2H2O. 母液母液4（维生素、氨基酸）（维生素、氨基酸）肌醇烟酸盐酸吡哆醇盐酸硫胺素甘氨酸. 2022-4-2939（1） 一些组织培养基的成分一些组织培养基的成分成分 培养基（单位）：mg/L White Heller MS ER B5 Nitsch N6NH4No3 - - 1650 1200 - 720 -KNO3 80 - 1900 1900 2527.5 950 2830CaCl2. 2H2O - 75 440 440 1

17、50 - 166CaCl2 - - - - - 166 -MgSo4. 7H2O 750 250 370 370 246.5 185 185KH2PO4 - - 170 340 - 68 400(NH4)2SO4 - - - - 134 - 463Ca(NO3)2 . 4HO2 300 - - - - - -NaNo3 - 600 - - - - -NaSO4 200 - - - - - -NaH2PO4 . HO2 19 125 - - 150 - -2022-4-2940成分 培养基（单位）：mg/L White Heller MS ER B5 Nitsch N6NH4No3 - - 16

18、50 1200 - 720 -KNO3 80 - 1900 1900 2527.5 950 2830CaCl2. 2H2O - 75 440 440 150 - 166CaCl2 - - - - - 166 -MgSo4. 7H2O 750 250 370 370 246.5 185 185KH2PO4 - - 170 340 - 68 400(NH4)2SO4 - - - - 134 - 463Ca(NO3)2 . 4HO2 300 - - - - - -NaNo3 - 600 - - - - -NaSO4 200 - - - - - -NaH2PO4 . HO2 19 125 - - 15

19、0 - -一些组织培养基的成分一些组织培养基的成分2022-4-2941成分 培养基（单位）：mg/L White Heller MS ER B5 Nitsch N6KCL 65 750 - - - - -KI 0.75 0.01 0.83 - 0.75 - 0.8H3BO3 1.5 1 6.2 0.63 3 10 1.6MnSO4. 4H2O 5 0.1 22.3 2.23 - 25 4.4MnSO4.H2O - - - - 10 - -ZnSO4 . 7H2O 3 1 8.6 - 2 10 1.5Zn.Na2 . EDTA - - - 15 - - -Na2MoO4 . 2H2O - -

20、0.25 0.025 0.25 0.25 -MoO3 0.001 - - - - - -CuSO4 . 5H2O 0.01 0.03 0.025 0.0025 0.025 0.025 -CoCl2 . 6H2O - - 0.025 0.0025 0.025 - -AlCl3 - 0.03 - - - - -NiCl . 6H2O - 0.03 - - - - -FeCl3 . 6H2O - 1 - - - - -Fe2(SO)4 2.5 - - - - - -2022-4-2942成分 培养基（单位）：mg/L White Heller MS ER B5 Nitsch N6FeSO4 . 7H

21、2O - - 27.8 27.8 - 27.8 27.8 Na2 . EDTA . 2H2O - - 37.3 37.3 - 37.3 37.3NaFe . EDTA - - - - 28 - -有机物肌醇 - - 100 - 100 100 -烟酸 0.05 - 0.5 0.5 1 5 0.5盐酸吡哆醇 0.01 - 0.5 0.5 1 0.5 1盐酸硫胺素 0.01 - 0.1 0.5 10 0.5 1甘氨酸 3 - 2 2 - 2 2 叶酸 - - - - - 0.5 -生物素 - - - - - 0.05 -蔗糖 2% - 3% 4% 2% 2% 5%2022-4-29431、在洁净的

22、不锈钢锅里放入、在洁净的不锈钢锅里放入750ml蒸馏水，加入所需蒸馏水，加入所需要的琼脂和糖，加热熔化。要的琼脂和糖，加热熔化。2、加入储备液、加入储备液1，储备液，储备液2、各、各，按需要量加入植物激素。，按需要量加入植物激素。3、用蒸馏水定容到、用蒸馏水定容到1L。4、调、调H值。一般值。一般.5、培养基的分装。、培养基的分装。6、封口。、封口。7、培养基的高压灭菌。、培养基的高压灭菌。2022-4-2944v培养基灭菌培养基灭菌v器皿试材和接种用具的灭菌器皿试材和接种用具的灭菌v培养室和接种室的灭菌培养室和接种室的灭菌v无菌操作无菌操作2022-4-2945即培养室和接种室的灭菌即培养室

23、和接种室的灭菌v室内灭菌可用室内灭菌可用 2新洁尔敏檫洗新洁尔敏檫洗v 75 酒精喷雾酒精喷雾v UV照射照射20分钟分钟2022-4-2946v灭菌方法有：灭菌方法有：v高温高压蒸汽灭菌高温高压蒸汽灭菌v121，1.1Kg/c，15-20芬，时间芬，时间过长，培养基成分易变性失效过长，培养基成分易变性失效v过滤灭菌过滤灭菌v在高温高压下易分解的培养基和激在高温高压下易分解的培养基和激素类素类2022-4-2947v解剖刀、镊子、剪刀等用具采用解剖刀、镊子、剪刀等用具采用干热灭菌法，用烘箱灭菌，干热灭菌法，用烘箱灭菌，120时时1小时小时2022-4-2948v原则：原则：v充分灭菌，但不伤外

24、植体充分灭菌，但不伤外植体v不同的外植体，灭菌的要求也不不同的外植体，灭菌的要求也不一样一样2022-4-2949v75酒精酒精v表面杀菌，具有湿润和杀菌作用，表面杀菌，具有湿润和杀菌作用，浸浸30秒秒v氯化汞（升汞氯化汞（升汞）v常用浓度常用浓度0.1-0.2 ，处理，处理5-10分钟，分钟，有残毒有残毒v次氯酸钠次氯酸钠v浓度浓度2-10 ，是，是15-30芬，对植物芬，对植物无害无害2022-4-2950v即外植体的接种即外植体的接种v是将表面灭菌的植物材料切碎或是将表面灭菌的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞，转放分离出器官、组织、细胞，转放到无菌培养基上的全部过程。整到无菌培养基上

25、的全部过程。整过接种过程均需无菌操作。过接种过程均需无菌操作。2022-4-2951 l采样和表面灭菌采样和表面灭菌外植体：就是第一次接种用的植物材料。外植体：就是第一次接种用的植物材料。任何植物细胞或组织培养体系的建立，都必任何植物细胞或组织培养体系的建立，都必须采用适宜的外植体。须采用适宜的外植体。l首次接种污染率的计算与对策首次接种污染率的计算与对策首次接种，小容器。多数量，尽量分散，互首次接种，小容器。多数量，尽量分散，互相隔离，效果最好。初次接种时以每管放一相隔离，效果最好。初次接种时以每管放一块材料，采用大量小试管将块材料，采用大量小试管将材料分散，是材料分散，是最有效的。最有效的

26、。2022-4-2952顶芽与腋芽的发育顶芽与腋芽的发育顶芽的培养又叫顶芽的培养又叫“茎尖培养茎尖培养”，一般为，一般为0.10.5mm,有去除病毒有去除病毒的作用。如果是经过病毒检验的母株，最好是采用腋芽或带叶腋的作用。如果是经过病毒检验的母株，最好是采用腋芽或带叶腋的茎切段。的茎切段。不定芽的发育不定芽的发育不定芽的发生大多有一个从外植体上产生愈伤组织的阶段。从观不定芽的发生大多有一个从外植体上产生愈伤组织的阶段。从观赏园艺育苗的要求来说，应尽快出苗，减少发生愈伤组织。由外赏园艺育苗的要求来说，应尽快出苗，减少发生愈伤组织。由外植体产生不定芽经历两个不同的生长时期，首先形成愈伤组织，植体产

27、生不定芽经历两个不同的生长时期，首先形成愈伤组织，而后形成不定芽而后形成不定芽。体细胞胚状体的发生与发育体细胞胚状体的发生与发育原球茎的发育原球茎的发育2022-4-2953 在第二阶段培养的基础上所获得的芽、在第二阶段培养的基础上所获得的芽、苗、胚状体和原球茎等，难以直接栽培，苗、胚状体和原球茎等，难以直接栽培，这些培养的材料统称为中间繁殖体。需要这些培养的材料统称为中间繁殖体。需要进一步增殖才能发挥快速繁殖的优势。一进一步增殖才能发挥快速繁殖的优势。一般情况下，在般情况下，在46周内增殖周内增殖34倍是很容倍是很容易的。易的。2022-4-2954 一般认为，矿物质元素浓度较高时有一般认为

28、，矿物质元素浓度较高时有利于发展茎叶，而较低时有利于生根。所利于发展茎叶，而较低时有利于生根。所以多采用以多采用1/2或或1/4量的培养基，仅用很低的量的培养基，仅用很低的细胞分裂素，并加入适量的生长（细胞分裂素，并加入适量的生长（NAA）。）。一般一般24周即可生根。周即可生根。2022-4-2955v2.5.1 2.5.1 外植体的种类外植体的种类2022-4-2956v植株的生理植株的生理年龄越小年龄越小，外植体的，外植体的再生再生能力越强能力越强，培养成功的可能性越大。，培养成功的可能性越大。v同一植株上越同一植株上越 接近接近基部基部 的枝条，生的枝条，生理年龄理年龄 越小越小。20

29、22-4-2957v选取外植体的季节和时间，对培养材选取外植体的季节和时间，对培养材料的启动和培养至关重要。料的启动和培养至关重要。v一般在一般在生长季生长季春夏春夏2022-4-2958v外植体过大，不易灭菌，过小，不易成活。外植体过大，不易灭菌，过小，不易成活。v一般一般 0.51厘米厘米v脱毒培养脱毒培养 0.20.5厘米厘米2022-4-2959v 无菌的外植体材料是植物组织培养成功无菌的外植体材料是植物组织培养成功的重要前提与可靠保证，而消毒则是获得的重要前提与可靠保证，而消毒则是获得无菌外植体的有效方法。无菌外植体的有效方法。v 生长在开放环境条件下的植物，其表面生长在开放环境条件

30、下的植物，其表面附着各种微生物，取来的外植体需要经过附着各种微生物，取来的外植体需要经过仔细的表面灭菌处理。仔细的表面灭菌处理。2022-4-2960灭菌剂灭菌剂使用浓度使用浓度（）（）处理时间处理时间（min)从外植体从外植体去除难易去除难易程度程度灭菌效果灭菌效果次氯酸钙次氯酸钙次氯酸钠次氯酸钠过氧化氢过氧化氢氯化汞氯化汞乙醇乙醇溴水溴水硝酸银硝酸银抗菌素抗菌素漂白粉漂白粉 910 2 1012 0.11 7075 12 1 450mg/L 饱和溶饱和溶液液 530 530 515 215 0.22 210 530 3060 5-30 容易容易 容易容易 最易最易 较难较难 容易容易 容易

31、容易 较难较难 中等中等 易易 很好很好 很好很好 好好 最好最好 好好 很好很好 好好 比较好比较好 很好很好2022-4-29611 1、表面消毒剂对植物组织是有害的，应正确选择消毒、表面消毒剂对植物组织是有害的，应正确选择消毒剂的浓度和处理时间，以减少组织的死亡。剂的浓度和处理时间，以减少组织的死亡。2 2、在表面消毒后，必须用无菌水漂洗材料、在表面消毒后，必须用无菌水漂洗材料3 3次以上以次以上以除去残留杀菌剂，但若用酒精消毒，则不必漂洗。除去残留杀菌剂，但若用酒精消毒，则不必漂洗。3 3、与消毒剂接触过的切面在转移到无菌基质前需将其、与消毒剂接触过的切面在转移到无菌基质前需将其切除，

32、因为消毒剂会阻碍植物细胞对基质中营养物质切除，因为消毒剂会阻碍植物细胞对基质中营养物质的吸收。的吸收。4 4、若外植体污染严重则应先用流水漂洗、若外植体污染严重则应先用流水漂洗1 1小时以上或先小时以上或先种子培养得到无菌种苗，然后用其各个部分建立组织种子培养得到无菌种苗，然后用其各个部分建立组织培养。培养。5 5、HgClHgCl2 2效果最好，但对人的危害最大，用后要用水冲效果最好，但对人的危害最大，用后要用水冲洗至少洗至少5 5次。次。 消毒注意事项消毒注意事项2022-4-29622022-4-2963v（一）外植体的接种（一）外植体的接种 无菌操作无菌操作是将表面灭菌的植物材料切碎或

33、分离出是将表面灭菌的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞，转放到无菌培养基器官、组织、细胞，转放到无菌培养基上的全部过程。整过接种过程均需无菌上的全部过程。整过接种过程均需无菌操作。操作。2022-4-2964外植体接种全过程外植体接种全过程酒精擦拭手酒精擦拭手外植体消毒外植体消毒浸泡浸泡5min器械消毒器械消毒酒精灯灼烧酒精灯灼烧酒精擦拭培养皿酒精擦拭培养皿2022-4-2965酒精擦拭酒精擦拭旋转灼烧旋转灼烧取外植体取外植体接种接种盖好瓶塞盖好瓶塞修剪外植体修剪外植体2022-4-2966（二）外植体的培养（二）外植体的培养1、光照、光照2、温度、温度3、湿度、湿度4、氧气、氧气2022-

34、4-2967v 在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条件，培养基组成、PH值、渗透压等各种化学环境条件都回影响组织培养育苗的生长和发育。 2022-4-2968 温度是植物组织培养中的重要因素，大多数植物组织培养在2327之间进行，一般采用252。 低于15时培养，植物组织会表现生长停止， 高于35时对植物生长不利。 但是，不同植物培养的适温不同。白鹤非的最适温度是20、月季是2527、番茄是28。温度不仅影响植物组织培养育苗的生长速度，也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽的形成以28为最好，在12以下，33以上形成率皆最低。2022-4-2969 不同培养目标采用的培养温度

35、不同：v 百合鳞片在30以下再生的小鳞茎的发叶速度和百分率比在25 以下的高。v 桃胚在2条件进行一定时间的低温处理，有利于提高胚培养成活率。v 用35处理草莓的茎尖分生组织3d，可得到无病毒苗。2022-4-2970 组织培养中光照也是重要的条件之一， 光强 主要表现在 光质 光照时间 2022-4-29711、光照强度（、光照强度（light intensity) 光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目前的研究情况看，光照强度对外植物体、细胞的最初分裂有明显的影响。 光照强度：1000lx1500lxv黑暗条件：利于细胞、愈伤组织的诱导增殖v光照条件：利于器官的分化 百合原球

36、茎：黑暗下长出小球茎，关照下长出叶片2022-4-29722、光质（、光质（light wave) 光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。如百合珠芽在红光下培养，8周后，分化出愈伤组织。但在蓝光下培养，十几周后才出现愈伤组织，而唐菖蒲子球块接种15天后，在蓝光下培养首先出现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白光下幼苗纤细。 杨树：对愈伤组织生长红光促进蓝光阻碍2022-4-2973培培培培培培 养养养养养养 条条条条条条 件件件件件件3、光周期（、光周期（light period) 试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。 研究

37、表明，对短日照敏感的品种的器官组织，在短日照下易分化，而在长日照下产生愈伤组织，如葡萄，茎切段培养在短日照下形成根。 2022-4-2974 三、湿度（三、湿度（humidity) 湿度的影响包括培养容器内湿度的保持和环境的湿度条件。 a. 容器内湿度水平主要受培养基水分含量和封口材料的影响。前者又受琼脂含量的影响。在冬季应当适当减少琼脂用量，否则，将使培养基干硬，以致不利于外植体接触或插进培养基，导致生长受阻。封口材料直接影响容器内湿度情况，但封闭性较高的封口材料易引起透气性受阻，也会导致植物生长发育受影响。2022-4-2975v b. 环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发，一般要求70

38、%-80%的相对湿度，常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。湿度过低会使培养基丧失大量水分，导致培养基各种成分浓度的改变和渗透压的升高，进而影响组织培养的正常进行。湿度过高时，易引起棉塞长霉，造成污染。2022-4-2976培培培培培培 养养养养养养 条条条条条条 件件件件件件 四、渗透压（四、渗透压（penetrating pressure) 培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，因此，而影响到渗透压的变化。通常1-2个大气压对植物生长有促进作用，2个大气压以上就对植物生长有阻碍作用，而5-6个大气压植物生长就会完全停止，6个大气压植物细胞就不能生存。 2022-4-2977培培培培培培

39、养养养养养养 条条条条条条 件件件件件件 五、五、PH值值 不同的植物对培养基最适PH值的要求也是不同的（见表），大多在56.5左右，一般培养基皆要求5.8，这基本能适应大多数植物培养的需要。PH值适度因材料而异，也因培养基的组成而不同。 2022-4-2978培培培培培培 养养养养养养 条条条条条条 件件件件件件不同植物的最适不同植物的最适PH值值 种类种类 最适最适PH值值 种类种类 最适最适PH值值 杜鹃 4.0 月季 5.8 越橘 4.5 胡萝卜 6.0 石刁柏 6.0 蚕豆 5.5 桃 7.0 番茄、葡萄 5.72022-4-2979培培培培培培 养养养养养养 条条条条条条 件件件件

40、件件 以硝态氮硝态氮作氮源比以铵态氮铵态氮作氮源PH值较小一些。 一般来说PH值高于6.5时，培养基会变硬；低于5时，琼脂不能很好地凝固。因为高温灭菌会降低PH值（约0.2-0.3个PH值）因此在配制时常提高PH值0.2-0.3单位。 PH值大小调节可用0.1M的NaOH和0.1M的HCl来调整。1ml的NaOH可使PH值升高0.2单位，1ml的HCl可使PH值降低0.2单位。调节时一定要充分搅拌均匀。 2022-4-2980培培培培培培 养养养养养养 条条条条条条 件件件件件件 六、气六、气 体（体（gas) v 氧气是组织培养中必需的因素，瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料

41、。通气最好的是棉塞封闭瓶口，但棉塞易使培养基干燥，夏季易引起污染。v 固体培养基可加进活性炭来增加通气度，以利于发根。v 培养室要经常换气，改善室内的通气状况。v 液体振荡培养时，要考虑振荡的次数、振幅等，同时要考虑容器的类型、培养基等。 2022-4-2981v高温高压蒸汽灭菌：121，1.1Kg/c，15-20芬，时间过长，培养基成分易变性失效v过滤灭菌：在高温高压下易分解的培养基和激素类2022-4-2982主要内容：v外植体的选择v外植体的灭菌v外植体的接种和培养v外植体的成苗途径v污染的原因及预防措施v外植体的褐变及其防止措施v培养物的玻璃化现象及其预防措施2022-4-29831、

42、外植体（Explant）：是指植物离体培养中的各种接种材料。包括植物体的各个器官、组织、细胞和原生质体等。2、外植体选择的要求v选择优良的种质：材料的选择要有目的,具有一定的代表性,提高成功率,增加实用性。v选择健壮的植株：选取发育正常的器官或组织，再生能力强，组培易成功。2022-4-2984v选择合适的大小：根据不同的植物而异，太大容易污染，太小，多形成愈伤组织甚至难于成活。一般在0.5-1.0cm之间。v选择最适的时期：一般按植物生长的最适时期选取材料2022-4-29851、茎尖（园艺植物组织培养中应用最多，繁殖率高，不易发生遗传变异，但取材有限）2、茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，

43、取材容易）3、叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株，取材容易，操作方便，但易发生变异）；4、花球和花蕾5、种子、根、块根、块茎、花瓣等。 2022-4-2986 外植体的消毒是组培成功与否的第一关键步骤。v外植体的预处理：对外植体进行修整,去掉不要的部分,在流水下冲洗干净.v外植体的表面灭菌： 原则：充分灭菌，但不伤外植体；不同的外植体，灭菌的要求也不一样2022-4-2987消毒剂使用浓/%清除难易消毒时/min灭菌效果次氯酸钠2易5-30很好次氯酸钙9-10易5-30很好漂白粉饱和溶液易5-30很好升汞0.1-1较难2-10最好酒精70-75易0.2-2好过氧化氢10-12最易

44、5-15好溴水1-2易2-10很好硝酸银1较难5-30好抗菌素4-50mg/L中30-60较好2022-4-2988v(1)茎尖、茎段及叶片等的消毒：用清洁剂清洗-75%酒精浸泡10-20min-无菌水洗2-3次或Naclo或升汞溶液泡10-15min-无菌水洗3-4次v（2）果实和种子的消毒：自来水冲洗10-30min-70%酒精漂洗-2%Naclo液浸10min-无菌水2-3次-取出种子培养v（3）根及地下部器官的消互毒：自来水冲洗-纯酒精漂洗-升汞浸5-10min或2%Naclo液浸10-15min-无菌水洗3次v（4）花药的消毒：自来水冲洗 70%酒精浸泡数秒钟-无菌水洗2-3次-漂白

45、粉上清液浸10min-无菌水洗2-3次2022-4-2989v表面消毒剂对植物组织是有害的，应正确选择消毒剂的浓度和处理时间，以减少组织的死亡。v在表面消毒后，必须用无菌水漂洗材料3次以上以除去残留杀菌剂，但若用酒精消毒，则不必漂洗。v与消毒剂接触过的切面在转移到无菌基质前需将其切除，因为消毒剂会阻碍植物细胞对基质中营养物质的吸收。v若外植体污染严重则应先用流水漂洗1小时以上或先种子培养得到无菌种苗，然后用其各个部分建立组织培养。vHgCl2效果最好，但对人的危害最大，用后要用水冲洗至少5次。 2022-4-29902022-4-2991v是将表面灭菌的植物材料切碎或分离出器是将表面灭菌的植物

46、材料切碎或分离出器官、组织、细胞，转放到无菌培养基上的官、组织、细胞，转放到无菌培养基上的全部过程。整过接种过程均需无菌操作。全部过程。整过接种过程均需无菌操作。2022-4-2992外植体接种全过程外植体接种全过程酒精擦拭手外植体消毒浸泡5min器械消毒酒精灯灼烧酒精擦拭培养皿2022-4-2993酒精擦拭旋转灼烧取外植体接种盖好瓶塞修剪外植体2022-4-29942022-4-29952022-4-2996v1、光照v2、温度v3、湿度v4、氧气2022-4-2997v愈伤组织途径：试管苗外植体愈伤组织根、芽芽芽 根如安祖花的组织培养就属此类途径2022-4-2998v器官发生途径：外植体

47、经诱导后直接形成根和芽，进而形成完整的植物体。如茎尖培养。2022-4-2999v胚胎发育途径：外植体胚状体（原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期、子叶期）试管苗2022-4-29100v50年代末期，Steward等人从胡萝卜的韧皮部用液体培养基通过游离细胞的分化，获得了胚状体。据统计，在植物组织培养中具有胚状体分化能力的种子植物已达117种，分属43科，75属 。v培养基的激素成分和氮源影响胚状体的发生。有的植物可在无激素培养基上诱导出胚状体，如烟草、曼陀萝、水稻、小麦花药培养；有的植物需要生长素与细胞分裂素的一定比例诱导胚状体，如油茶、酸枣、桃等。v在植物组织组织培养中，诱导胚状体与诱

48、导芽相比较，具有显著的优点，一是数量多，二是速度快，三是成苗率高。由于胚状体具有这些优点，所以在育种工作及园艺工作中，可用胚状体作为特定的优良基因型个体的无性繁殖手段，同时在研究胚胎发育中也有很重要的理论意义。 2022-4-291011、污染：植物组织培养过程中培养基和培养材 料滋生杂菌，导致培养失败的现象2、污染的原因v一是病原菌污染（细菌、真菌）v二是外植体、培养基、培养器皿带菌v三是操作人员未遵守操作规程。真菌污染2022-4-291022022-4-291032022-4-29104 组织培养中降低污染率是工厂化生产中不可忽视的技术环节。预防措施有：v防止材料带菌-选择取材时间、材料与培养、外植体灭菌等措施；v防止用具带菌-器皿与金属器械灭菌；v操作室要处于无菌状态-工作室、培养室灭菌等；v操作人员要按照操作程序进行。v在培养基中加入抗菌素v分散接种2022-4-29105假设污染率为假设污染率