细胞生物学 第3章 细胞生物学研究方法

1、w显微镜是观察细胞的主要工具。根据显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同，可分为光学显微镜和电子显光源不同，可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。微镜两大类。光学显微镜以可见光（紫外线显微镜以光学显微镜以可见光（紫外线显微镜以紫外光）为光源。紫外光）为光源。电子显微镜以电子束为光源。电子显微镜以电子束为光源。u普通光学显微镜普通光学显微镜u荧光显微镜荧光显微镜 u激光共聚焦扫描显微镜激光共聚焦扫描显微镜u相差显微镜相差显微镜 u微分干涉差显微镜微分干涉差显微镜u倒置显微镜倒置显微镜 v普通生物显微镜由普通生物显微镜由三三部分部分构成：构成：照明系统照明系统光学放大系统光学放大系统机械装置机械装

2、置v原理：经物镜形成倒立实原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。像，经目镜进一步放大成像。（一）普通复式光学显微镜（一）普通复式光学显微镜指显微镜能分辨物体最小间隔的能力。指显微镜能分辨物体最小间隔的能力。0.61 分辨率分辨率 DN . sin （ / 2）=w制片：固定（甲酫）、包埋（石蜡）切成制片：固定（甲酫）、包埋（石蜡）切成厚约厚约5 m的薄片以便观察。的薄片以便观察。w染色：伊红和美蓝特异地与不同蛋白质结染色：伊红和美蓝特异地与不同蛋白质结合，品红特异地显示合，品红特异地显示DNA的所在部位。的所在部位。相差显微镜（相差显微镜（phasecontrast microsco

3、pe）由）由PZernike于于1932年发年发明，并因此获明，并因此获1953年诺贝尔物理奖。这种年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。标本和活细胞。组成和普通显微镜一组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之下，后者在载物台之上，载物台之上，用于观用于观察培养的活细胞，具察培养的活细胞，具有相差物镜。有相差物镜。(八八)、当代显微镜的发展趋势、当代显微镜的发展趋势v进入进入20世纪世纪80年代以来，年代以来，光学显微镜的设计和制作又光学显微镜的设计和

4、制作又有了很大的发展，其发展趋有了很大的发展，其发展趋势主要表现在，注重实用性势主要表现在，注重实用性和多功能方面的改进。在装和多功能方面的改进。在装配设计上趋于采用组合方式，配设计上趋于采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、集普通光镜加相差、荧光、暗视野、暗视野、DIC、摄影装置于一、摄影装置于一体，从而操作灵活，使用方体，从而操作灵活，使用方便。便。v自动化与电子化自动化与电子化透射电子显微镜透射电子显微镜扫描电子显微镜扫描电子显微镜n用于电镜的标本须制成厚度约用于电镜的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。左右的超薄切片。2、制样技术、制样技术超薄切片超薄切片负染技术负染技术冰冻蚀刻冰

5、冻蚀刻v电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机的超薄切片，用超薄切片机ultramicrotome）制作。）制作。v通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。属（铀、铅）盐染色。Page59超薄切片超薄切片技术主要技术主要包括取材、包括取材、固定、包固定、包埋、切片、埋、切片、染色等步染色等步骤。骤。Electron micrograph of a

6、root-tip cell stained with osmium and other heavy metal ions. The cell wall, nucleus, vacuoles, mitochondria, endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, and ribosomes are easily seen. Negative Stained Archaebacteria Negative Stained Actin用次氯酸钠用次氯酸钠Page 61酵酵母母细细胞胞扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM

7、）于20世纪60年代问世，用来观察标本的表面结构。工作原理工作原理v 用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。描图像。v 图

8、像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了图像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。的轰击下发出次级电子信号。 三、扫描隧道显微镜三、扫描隧道显微镜 扫描隧道显微镜（扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope，STM） 由由Binnig等等1981年发明，年发明，根据量子力学原理中的隧道效应而设计。根据量子力学原理中的隧道效应而设计。 v原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度

9、的针尖在原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（叠，外加一电压（2mV2V），针尖与样品之间形成），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。显示出原子水平的凹凸形态。v分辨率：横向为分辨率：横向为0.10.2nm，纵向可达，纵向可达0.001nm。v用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观用途：三态（固态、

10、液态和气态）物质均可进行观察。察。STM image of a DNA moleculeLow speedHigh speedDifferential centrifugationVelocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation1. 1. 固定固定物理固定：血膜空气快速干燥、冷冻干燥。物理固定：血膜空气快速干燥、冷冻干燥。化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂。显示多糖常用乙醇固定，显示酶类和锇酸等试剂。显示多糖常用乙醇固定，显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。多用甲醛丙酮缓冲液固定。 步骤：步骤

11、：2. 2. 显示方法显示方法金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成生成CuS或或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。有色沉淀，而显示出酶活性。Schiff反应：细胞中的醛基可使反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红试剂中的无色品红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸（变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。反应）。联苯胺反应：过氧化酶分解联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生新生氧，后者再将。产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。

12、脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。茚三酮反应：显示蛋白质。茚三酮反应：显示蛋白质。金属沉淀法金属沉淀法Schiff反应反应联苯胺反应联苯胺反应脂溶染色法脂溶染色法F. 米伦（米伦（Millon）染色：显示蛋白质（红色）染色：显示蛋白质（红色）酪氨酸残基与氮汞试剂反应酪氨酸残基与氮汞试剂反应 1. 免疫荧光技术免疫荧光技术Immunofluorescence technique ：抗原抗原-抗体特异结合与荧光标记技术相结合用于研究特异蛋白抗原抗体特异结合与荧光标记技术相结合用于研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。在细胞内分布的方法。用Alex

13、a488标记的抗人-tubulin抗体染色显示微管(绿色); 细胞核: 红色, DAPI染色(常规荧光显微镜照片，Shi Qinghua等)用抗用抗-tubulin抗体染色显示微管抗体染色显示微管(绿色绿色); 细胞核细胞核: 红色红色, DAPI染色染色(激光共聚焦显微镜照片激光共聚焦显微镜照片) 2. 免疫电镜技术免疫电镜技术 Immune electron microscopy：通过通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等位与骨架蛋白的定位等 用免疫电镜方用免疫电镜

14、方法法,观察到寇氏隐甲观察到寇氏隐甲藻的多条凝集染色藻的多条凝集染色体和细胞中的金颗体和细胞中的金颗粒粒,并且细胞核内、并且细胞核内、核膜上的金颗粒簇核膜上的金颗粒簇集相对于胞质中相集相对于胞质中相对集中对集中,指示了指示了ACA抗抗CJFD2003通常用通常用*原位杂交原位杂交： 指用标记的核酸探针通过分子杂交确定指用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或者在细胞中的位置的方法。特异核苷酸序列在染色体上或者在细胞中的位置的方法。五、放射自显影术五、放射自显影术v用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更

15、新、作用机理、作用部位等定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。等。v原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。射性曝光，使乳胶感光。v一般用一般用14C和和3H标记。常用标记。常用3H-TDR来显示来显示DNA，用，用3H-UDR显示显示RNA；用；用3H氨基酸研究蛋白质，用氨基酸研究蛋白质，用3H甘甘露糖、露糖、3H岩藻糖研究多糖。岩藻糖研究多糖。 14C半衰期为半衰期为5730年，年，3H为为12.5年。年。2. 2

16、. 显微光谱分析技术显微光谱分析技术v细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。特征性的吸收曲线。v可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性和定量测定。定性和定量测定。(一一)、细胞培养的基本概念、细胞培养的基本概念(二二)、动物细胞培养、动物细胞培养(三三)、植物细胞培养、植物细胞培养(四四) 非细胞体系在细胞生物学研究的作用非细胞体系在细胞生物学研究的作用(一一)、细胞培养的基本概念、细胞培养的基本概念选用最佳生存条件对

17、活细胞进行培养和研究选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。的技术。 动物细胞的生存环境与植物细胞差别很大，动物细胞的生存环境与植物细胞差别很大，因而二者的培养方法很不相同。因而二者的培养方法很不相同。(二二)、动物细胞培养、动物细胞培养 原代细胞原代细胞(primary culture cell) 从动物机体取出的进行培养的细胞群从动物机体取出的进行培养的细胞群 。有人也把。有人也把培养的第培养的第2代细胞与传代细胞与传10代以内的细胞统称为原代代以内的细胞统称为原代培养细胞。培养细胞。 有限细胞系有限细胞系(finite cell line) 从原代细胞群中筛选出的仍保持原来染色体的

18、二从原代细胞群中筛选出的仍保持原来染色体的二倍体数量及接触抑制性，能够繁殖倍体数量及接触抑制性，能够繁殖40-50代左右的代左右的传代细胞。传代细胞。永生细胞系永生细胞系(infinite cell line) 细胞发生遗传突变，并带有癌细胞的特点，可能细胞发生遗传突变，并带有癌细胞的特点，可能在培养条件下无限制地传代下去，这种传代细胞在培养条件下无限制地传代下去，这种传代细胞称为称为永生细胞系永生细胞系。 如：如：HeLa细胞系、细胞系、BHK21细胞系、细胞系、Vero细胞系、细胞系、CHO细胞系细胞系细胞株：细胞株：具有特殊遗传标记或性质的细胞群体。具有特殊遗传标记或性质的细胞群体。2.

19、 体外培养细胞的类型：体外培养细胞的类型：v原代培养细胞原代培养细胞v传代细胞：适应在体外持续传代培养的细胞传代细胞：适应在体外持续传代培养的细胞3. 细胞培养的类型细胞培养的类型u单层细胞培养单层细胞培养u悬浮培养悬浮培养4. 细胞的形态：成纤维样细胞、上皮样细胞细胞的形态：成纤维样细胞、上皮样细胞原原代代培培养养(四四) 非细胞体系在细胞生物学研究非细胞体系在细胞生物学研究的作用的作用1. 定义：通过培养和介导，两个或多个细胞合并成定义：通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）或细胞杂交。）或细胞杂交。2. 同核体同核体：相同基因型的细胞融合而成。：相同基因型的细胞融合而成。3. 异核体：异核体：不同基因型的细胞融合而成。不同基因型的细胞融合而成。4.