现代色谱分析-HPLC1

1、l高效液相色谱法与经典液相色谱法原理相同，无本质区别。l1. 新型高效输液泵，使分析时间缩短l2. 高效固定相，分离效能高，选择性好l3. 高灵敏度检测器l1. 高沸点、热不稳定、分子量大、不同极性的有机物；l2. 生物活性物质、天然产物；l3. 合成与天然高分子l涉及石油化工、食品、药品、生物化工、环境等领域。80的化合物可用HPLC分析。l1. 溶剂消耗大，成本高于GC, 梯度洗脱的操作也比GC的程序升温复杂。l2. 缺少通用型检测器。近年来ELSD应用日益增多，有望成为通用型检测器，但稳定性尚需提高。l3. HPLC不能代替GC，对于柱效要求高的分析，仍需GC，如石油产品。l4. HPL

2、C 不能代替中、低压色谱，如受压易分解变性的具有生物活性的生化样品。高效液相色谱进样口检测器色谱图色谱柱溶剂泵混合器 (HPLC)l1. 贮液瓶应耐腐蚀，用玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料。l2. 溶剂使用前必须经过0.45m滤膜过滤，过滤用液相色谱专用滤膜或4号微孔玻璃漏斗。l1. 氦脱气法l2. 加热回流l3. 抽真空l4. 超声脱气l5. 在线脱气HP1100 on-line degasser12 mlSolenoid valvel要求：l1. 泵体材料耐腐蚀。优质耐酸不锈钢，聚醚醚酮（PEEK)l2. 耐高压。4050MPal3. 输出流量范围宽。填充柱: 0.110 ml/ min(分

3、析型），1100ml/min; 微径柱：101000l/minl4. 输出流量稳定，重现性好。l优点：流量稳定，无脉动l缺点：l （1）液缸体积有限，约100150ml, 不利于连续工作。l （2）不能用于梯度洗脱。单元泵工作原理单元泵工作原理Authoring Division Name File NameSecurity Notice (if required) DamperPurge valveSealPistonBall Screw DriveMotor with EncoderGearOutlet Ball ValveActive Inlet Valvel1.可在高压下连续输液l2.

4、液缸容积小（几十几百微升），适合于梯度洗脱l3.存在脉动l4.柱塞与流动相直接接触，易造成污染l又称气动放大泵四元泵工作原理Authoring Division Name File NameSecurity Notice (if required) Vacuum ChamberMCGVAIVOBVDamperPurge ValveWasteto injection devicefrom solventbottlesMCGV 比例阀AIV 主动阀OBV 单向阀ToWasteSample Loop(Fixed Volume)FromToColumnSampleSyringeLoadInjectTo

5、ColumnPumpFrom PumpTo Waste手动进样器六通阀Agilent 1100 系列自动进样器系列自动进样器00.10.20.30.40.50.6Precision 10 25 50 100l1. 柱材料l 内壁抛光、钝化的不锈钢管l2. 规格l a.内径4.6或3.9mm，柱长1030cm, 510m填料, 柱效500010000/ml b.内径4.6或3.9mm，柱长510cm, 35 m填料l c. 内径0.52mm微填充柱l d. 内径3050 m的毛细管柱l利用氧化还原反应的检测器氧化、还原反应l高效液相色谱的一种检测器l属于电化学一类l由数个多孔石墨电极串连组成l在

6、一次试验中，可同时提供多个氧化还原反应电势库 仑 阵 列 电 池 示 意 图 Channel 1Channel 2Channel 3Channel 4CounterReferenceFritOutletInlet12.012.513.013.514.014.515.00.000.501.001.502.00Retention time (minutes)Response (A)CHLOROGENIC ACID CATECHIN4HPAC VANILLIC ACID CAFFEIC ACID SYRINGIC ACID lChemStation (Agilent 1100)lEmpower (W

7、aters)lCLASS VP (Shimadzu)l杭州英谱lN-2000千谱lZD1（本研究所研制）l内容：内容：l固定相载体结构l正相色谱固定相l键合相色谱固定相Particles of ColumnPackings50 mLarge PorousParticles30 mPellicularBeads3-10 mMicroparticulates2 m Active Surface正相 HPLC极性固定相有机流动相传统目前硅胶氧化铝氰基二醇基氨基吸附色谱键合相适用于:同分异构体的分离.在有机/水流动相中不溶化合物的分离.适用于中等极性化合物分离.a.薄壳玻珠 b.无定性全多孔硅胶 c.

8、球形全多孔硅胶 d.堆积硅珠OSiOSiOSiOOHHOROHHOR 机理 H - 键固定相 硅胶 氧化铝流动相有机溶剂 偶极矩small klarge ksaturated hydrocarbonsolefinsaromatic hydrocarbons, organic halidessulfidesethersnitro-compoundsesters, aldehydes, ketonesalcohols, aminessulfonesamidescarboxylic acids非极性sulfoxides极性被强烈吸附容易拖尾样品被催化分解不易梯度洗脱含水量要控制正相色谱键合相OSiC

9、H3CyanoOSiCH2()nNH2CH2DiolAmineCNSiCHOHCHCHOOH22CH3(CH )2nSiCH3CH3SiSiCH3CH3l为了解决固定液的流失问题，将固定液通过化学反应共价键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上，生成化学键合固定相。l键合固定相对各种溶剂都有良好的化学稳定性和热稳定性，柱效高，使用寿命长，重现性好，可用于梯度洗脱。l键合固定相已取代传统的液液分配色谱，成为HPLC中主要的固定相。Typical ColumnSiSiSiSiSiPacking SupportsChemically ModifiedSilica GelOHSiOSiOHOOSiOHOSi

10、OOSiOHPoresSilica GelSurface3CHCH3Si - O - Si - (CH2)17CH3键合固定相的“刷子”结构键合相柱优点固定相不易被流动相洗脱使用极性范围宽无需饱和色谱柱非常容易进行梯度洗脱柱子平衡非常快选择性唯一柱容量大溶质不易污染柱子lSiOC型lSiC型或SiN型lSiOSiC型lSiOH ROH SiOR H2Ol此类固定相柱效高，易水解、醇解，热稳定性差，只能用弱极性流动相用于分离极性化合物。 lSiOH SO2Cl2 SiCl（氯化硅胶）lSiCl RMgBr SiR （R=苯基或烷基）lSiCl NH2CH2CH2NH2 SiNHCH2CH2NH2

11、X 代表Cl、OH、OCH3、 OC2H5等，R 代表C8H17、C10H21、 C18H37、(CH2)nCN、 (CH2)nNH2、CH2OH、 CHOHCH2OH等此类固定相是目前最常用的键合固定相。l1. 表面覆盖量（硅胶表面含碳量） 250(一般约为10）l2. 表面覆盖率（单位表面上键合的有机官能团的量与可反应的硅羟基的量之比）l1. 表面覆盖率越大，保留越强l2. 硅胶表面残留硅羟基产生吸附作用，引起谱峰的拖尾和不对称。l3. 氢键力顺序：胺基氰基芳硝基二醇基醚基l4. 胺基柱具强极性，在酸性水溶液中作为弱阴离子交换剂，用于分离酚、羧酸、核苷酸；作为反相固定相可用于单糖、双糖、多

12、糖的分离。不能用于分离羰基化合物。l5. 氰基柱为质子受体，中等极性，分离选择性与硅胶类似，对酸性、碱性样品可获得对称的色谱峰。l6. 芳硝基柱呈弱极性，对芳香族化合物和多环芳烃有良好的分离能力。l7. 二醇基键合相呈弱极性，可用于分离有机酸及其齐聚物，还可作为分离蛋白质的凝胶过滤色谱固定相。l8. 醚基键合相也呈弱极性，可分离能形成氢键的化合物，如酚类、硝基化合物，也可作为凝胶过滤色谱固定相。l1. 稳定性la.表面覆盖率越高越稳定lb.反相键合相稳定性高于正相键合相lc.与流动相pH有关，通常应保持在28之间l2. 重现性l不同厂家，不同批号产品分离特性不同l3. 选择性l同一种键合固定相

13、，用两种极性参数相近的流动相时，分离结果会相差很大。如在ODS柱上分离山梨酸和苯甲酸，40甲醇水溶液作流动相时无法分离，而用32.5%四氢呋喃水溶液能完全分离。l4. 再生la.对正相柱，可用1:1甲醇氯仿冲洗lb.对反相柱，用甲醇再生，若效果不好，可用丙酮、二甲基甲酰胺或0.01mol/L无机酸进行再生。色谱柱保护色谱柱保护 过滤所有的溶剂和样品过滤所有的溶剂和样品 使用保护柱使用保护柱 仪器在使用完毕，要冲洗整个系统，移走系统中缓冲液仪器在使用完毕，要冲洗整个系统，移走系统中缓冲液 柱子在不使用时，两端密封保存柱子在不使用时，两端密封保存 在适当的溶剂中保存柱子在适当的溶剂中保存柱子 注意

14、色谱柱的注意色谱柱的pH值使用范围值使用范围 不要高压冲洗柱子不要高压冲洗柱子 不要高温下过长时间使用硅胶键合相不要高温下过长时间使用硅胶键合相操作条件操作条件流动相对色谱柱寿命的影响H111111R2R2R2普通键合普通键合StableBond稳定键合稳定键合低低 pH (1-3) - 由于酸催化水解导致键合相的流失由于酸催化水解导致键合相的流失*H3O+* 易水解的硅氧键易水解的硅氧键COLUMN VOLUMES1008060402000100020003000400050006000%k REMAINING操作条件操作条件流动相对色谱柱寿命的影响键合相水解速度随温度的升高而加大键合相水解

15、速度随温度的升高而加大StableBond CN (二异丙基苯基二异丙基苯基 CN)普通键合普通键合 CN (二甲基丙基二甲基丙基CN)低低pH 的淋洗液的淋洗液 高温高温(60C)操作条件操作条件流动相对色谱柱寿命的影响H普通键合普通键合Eclipse XDB (Extra Densely Bonded超高密度键合超高密度键合)高高 pH (7-14) - 硅胶溶解硅胶溶解pH 升高升高温度升高温度升高磷酸盐磷酸盐 硼酸盐硼酸盐 有机溶剂有机溶剂色谱柱的良好使用规范色谱柱的良好使用规范l使用新鲜的水溶液,要注意使用生物稳定剂,如叠氮化钠l储存色谱柱时,要将缓冲液冲洗干净,并保存在适合的溶剂中

16、,如乙腈l避免操作不当损坏色谱柱,如:猛敲,跌落或过紧拧接头l运输中变干了的色谱柱要完全浸湿l如果样品中含有无需考虑而保留强的组分时,必须进行前处理l定期用强极性溶剂冲洗色谱柱l 清楚了解色谱柱填料适用的:l了解样品溶剂对溶解度及分离的影响l pH范围，温度，化学适应性l 溶剂使用前必须过滤预柱和保护柱预柱和保护柱由泵输送的流动相预柱进样器保护柱分析柱至检测器预柱净化流动相HP Part No.: 79916KT-102保护柱净化样品截留或浓缩柱Authoring Division Name File NameSecurity Notice (if required) H卡卡套柱：带可重复使用

17、的末端套柱：带可重复使用的末端接头和一体化的保护柱柱芯接头和一体化的保护柱柱芯无保护卡套柱芯无保护卡套柱芯有保护卡套柱芯有保护卡套柱芯带带Techtron 卡套柱芯的卡套柱芯的Zorbax 保护柱保护柱Techtron 柱芯柱芯含一体化的滤芯含一体化的滤芯min5101520253035mAU140142.5145147.5150152.5155157.5160min5101520253035mAU140142.5145147.5150152.5155157.5160BDS ODS Hypersil 250 - 2 mm with integrated Guard ColumnBDS ODS

18、Hypersil 250 - 2 mm without Guard Column2 mm 内径卡套柱有和无保护柱的比较内径卡套柱有和无保护柱的比较l在色谱柱安装前、后测试压力差l如果柱两端的反压很高，反接色谱柱，再用10-20倍柱体积的流动相冲洗柱体后，再测试压力差l如果出现沉淀， (如：蛋白质凝聚，细胞物，聚合物)设法用相应的可溶性溶剂，如0.1% TFA / 80% 乙腈, 6M 盐酸胍, THF等清洗以除去堵塞物l若仍无效，应考虑更换过滤片色谱柱的修复和再生色谱柱的修复和再生-物理性阻塞柱进样口柱进样口滤片滤片密封垫圈密封垫圈柱体柱体Female End FittingMale End

19、Fitting操作注意事项：操作注意事项：l带手套带手套l填料不能变干填料不能变干l不要接触色谱柱体不要接触色谱柱体 l加热填料会被挤出加热填料会被挤出l不要拧得过紧不要拧得过紧色谱柱故障诊断色谱柱故障诊断更换进样口滤芯更换进样口滤芯由于键合相水解或硅胶溶解而造成的色谱柱填料变化是不可逆的l 由于污染而产生的色谱柱变化可以通过适当的洗清使之修复l 梯度洗脱的方式 (水 - 强有机溶剂) 通常最有效l 低 pH 流动相, 如 0.1% TFA 或 0.01M H3PO4, 也是有效的l 适当升高温度也有帮助 (60-80C)色谱柱的修复和再生色谱柱的修复和再生-化学变化-Il某些溶液，如6M盐酸

20、胍、异硫氰酸胍、尿素可用于清除蛋白质的沉积l某些填料 (XDB, 有机聚合物)，可使用高pH 水/有机溶液，如：0.01M NaOH溶于50%异丙醇/水溶液。 硅胶基质应尽量减少接触时间 (15-30 min)。色谱柱的修复和再生色谱柱的修复和再生-化学变化-II例子：4.6 mm ID x 15 cm Zorbax 300SB-C18流速: 1 mL / min; 温度: 80CA: 0.1% TFA 水溶液 B: 0.1% TFA 乙腈溶液100% A for 30 min.; 0-100% B over 30 min.; Hold 100% B for 30 min., Return t

21、o 100% A in 5 min.重复3次 如果事先适当注意，大部分液相色谱柱的问题是可以预防的如果事先适当注意，大部分液相色谱柱的问题是可以预防的- 流动相必须是互溶、无颗粒的流动相必须是互溶、无颗粒的- 使用保护柱和在线过滤器，并定期更换使用保护柱和在线过滤器，并定期更换- 采用恰当的样品制备过程采用恰当的样品制备过程- 采取恰当的色谱柱清洗步骤采取恰当的色谱柱清洗步骤- 不同的操作条件选用不同的色谱柱不同的操作条件选用不同的色谱柱 (e.g. SB: pH 1-6, XDB: pH 3-11，Extend:2-12)- 保存柱反压和其他重要色谱参数的记录，即保存柱反压和其他重要色谱参数

22、的记录，即 (e.g. R, N, As, k)- 色谱柱保存时必须充满有机溶剂，如乙腈色谱柱保存时必须充满有机溶剂，如乙腈l要求l参数l正相色谱流动相选择l反相色谱流动相选择l与固定相不互溶l与检测器相匹配l对样品有足够的溶解能力l粘度小，沸点低l纯度高l毒性低1.溶剂强度参数。 根据Snyder的定义， 。为该溶剂分子在单位吸附剂表面上的吸附能。 。越大，表示该溶剂洗脱能力越强。一些纯溶剂的。值己烷 0.00 乙酸乙酯 0.38异辛烷 0.01 二噁烷 0.49四氯化碳 0.11 乙腈 0.50氯仿 0.26 异丙醇 0.63二氯甲烷 0.32 甲醇 0.73四氢呋喃 0.35 水 20.73乙醚 0.38 乙酸 20.73_ 2.极性参数P P是溶剂与乙醇、二氧六环、硝基甲烷等极性溶质作用的综合量度。 混合溶剂的P： PViPi3.溶剂的选择性参数Xe、Xd、Xn 分别表示溶剂接受质子、给予质子和偶极作用的能力。溶剂PXeXdXn溶剂PXeXdX