第10 章 高效液相色谱法

1、第10 章 高效液相色谱法High Performance Liquid Chromatography高效液相色谱法基本类型和应用范围高效液相色谱法基本类型和应用范围 液相色谱没有挥发性和热稳定性限制，流动相对分离有很大影响，提供了一个改善分离的条件 分类： 分配色谱(partition chromatography) 吸附(液固)色谱(absorption chromatography, liquid- solid chromatography) 离子交换色谱(ion exchange chromatography) 尺寸排阻(凝胶)色谱(size exclusion chromatogra

2、phy, gel chromatography) 10-1 液相色谱的柱效一、液相色谱的速率理论一、液相色谱的速率理论I 涡流扩散项； II 流动相区域内，流动相的传质阻力项（见下页）；III 分子扩散项； IV 固定相传质阻力项； V 流动相停滞区域内的传质阻力（见下页）。 2221()1sfsmpdMMSMepmpC dC dC DHuDuDDC dC d u(I)(II)(III)(IV)(V)II 项， 流动相流经同一区域，接近固定相的流速要比流动中间的慢V 项， 进入固定相微孔，就会减慢传质速率 H dp2 ，故减小填料粒度是提高柱效的有效的有效方法。二、柱外谱带展宽二、柱外谱带展宽

3、 流经连接管道引起 , 线性流速， cm/s； r, 连接管半径，cm;DM 溶质在流动相中的扩散系数， cm2/s, 一般柱外管道的半径小于3 mm.224exMr uHDu10-2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪 高效液相色谱仪的结构示意见右图，一般可分为4个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由

4、此得到液相色谱图。 液相色谱仪液相色谱仪 高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，必须配备有高压输液系统, 20-40 MPa。 一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成。 高压输液泵应符合密封性好，输出流量恒定( x l-20 ml/min)，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。 常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。 恒流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。一、高压输液系统高压泵应具有的性能足够的输出压力恒定的输出流量可调的输出流量范围平稳的压力二、进样系统 高效液相色谱柱比气相色谱

5、柱短得多（约530 cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。进样方式 直接注射进样停流进样高压六通阀进样三、 分离系统色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。 柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其它金属。 一般色谱柱长530 cm，内径为45 mm，凝胶色谱柱内径312 mm，制备柱内径较大，可达25 mm 以上。 一般在分离前备有一个前置柱（预柱），前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离

6、技的性能不受影响。常用分离柱常用分离柱 柱体为直型不锈钢管，见下图 柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（20m）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。四、检测系统 要求： 灵敏度高， 噪音低， 线性范围宽 相应快 死体积小， 对温度和流速变化不敏感。 在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。 另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。 常用的

7、检测器见表。紫外可见光、电化学检测器的流通池比较紫外检测器紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点：特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm 10mm ，容积 8L）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。紫外光电二极管阵列检测器紫外光电二极管阵列检测器 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，可获得三维立体谱图光电二极管阵列检测器谱图光电二极管阵列检测器谱图荧光检测器荧光检测器 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。示差折光检测器示差折光检测器 除紫

8、外检测器之外应用最多的检测器； 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比； 通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）； 灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱； 偏转式、反射式和干涉型三种； 五. 附属系统 包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置。 质谱作为检测器 (HPLC-MS) 红外光谱作为检测器 (HPLC-FTIR） 10-3 分配色谱分配色谱 一般可分液-液色谱和键合相色谱。液-液色谱固定液容易流失，目前应用最广泛的一种键合相色谱。 据统计，约有3/4以上的分离问题是在化学键

9、合固定相上进行的。一、化学键合固定相 化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. a. 硅氧碳键型：硅氧碳键型： SiOC SiOC b. b. 硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiOSi C SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. c. 硅碳键型：硅碳键型： SiC SiC d. d. 硅氮键型：硅氮键型： SiN SiN 用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶硅胶。利用硅胶表面的硅醇基(Si一OH)与有机分可成键,即可得到各种性能的固定相。一般可分三类（1）疏水基团疏水基团 如不同链长的烷烃（C8和C18。）和苯基等（

10、2）极性基团极性基团 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。（3）离子交换基团离子交换基团 如作为阴离子交换基团的胺基， 季镀盐；作为阳离子交换 基团的磺酸等。 根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正正相分配色谱相分配色谱和反相分配色谱反相分配色谱。如果采用流动相的极性小于固定相的极性，称为正相分配色谱正相分配色谱，它适用于极性化合物的分离。其流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。 如果采用流动相的极性大于固定相的极性，称为反相分配色谱。它适用于非极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相反。 相应键合相色谱： 正相键合色谱 反相键合色谱 柱子可选

11、择方式： 1. 1. 固定相极性与分析物匹配，选用极性不同的流动相。固定相极性与分析物匹配，选用极性不同的流动相。 2. 流动相极性与分析物匹配，选用极性不同的固定相 3. 固定相极性与分析物质极为相似，仅由流动相极性差 异使分析物质沿柱移动。 通常采用第一类方式。 溶剂的极性可用极性指数 p描述，为了精细调整k值，可采用混合溶剂，混合溶剂的极性指数可以表示为：二、固定相和流动相的选择 一般反相分离，可改变水含量来改变k值， 如果效果不理想，则可改变化学性质（a值如改变溶剂）。 反相色谱的四溶剂最佳操作 甲醇、乙腈、四氢呋喃调节a 值 水调节k值正相色谱的四溶剂系统 乙醚、氯仿、三氯甲烷调节a

12、 值n-己烷调节k值 三、洗脱物的流出顺序解释 把非极性的烷基键合相看作一层键合在硅胶表面上的十八烷基的“分子毛分子毛”，这种“分子毛”有较强的疏水特性。 如图所示，两种作用力-分子中的非极性部分与固定相表面上的疏水烷基的缔合作用和被分离物的极性部分受到极性流动相的作用-之差，决定了分子在色谱中的保留行为。四、分配色谱的应用 反相键合相色谱应用广泛，见表21-3(p 394)。 特点 改变流动相， 可调节k 和a 可分离离子化合物、非离子化合物和可电离化和物 水为主体 可预测洗脱顺序 平衡快，适合梯度洗脱 离子对色谱，流动相中含有可与分析物质形成离子对的相反电荷离子化合物-对离子。10-4 液

13、液固固( (吸附吸附) )色谱法色谱法 液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。 一、固定相 吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。 由于硅胶的优点较多，如线性容量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等，因此，以硅胶用得最多。二、保留机制 当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，只要它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂分

14、子，于是，在固定相表面发生竞争吸附: X + nSad = Xad + nS 达平衡时,有 nadnadadSXSXK其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。Kad值小,则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分据此得以分离。Kad值可通过吸附等温线数据求出。 三、流动相 一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。 洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数（0）来衡量，0越大，表示洗脱剂的极性越强。 列出一些常用溶剂在氧化铝吸附剂中的0值。在硅胶吸附剂中0值的顺序相同，数值可换算（0硅胶=0770氧化铝）。

15、四、应用 见书 适合分离异构体10-5 离子交换色谱和离子色谱离子交换色谱和离子色谱 不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。一、离子交换平衡一、离子交换平衡 反离子：为保持交换剂电中性，基质上存在的带相同电荷数但符号相反的离子。 对于典型的磺酸型阳离子交换树脂，一价离子的KB/A值按以下顺序： Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+ 二价离子的顺序为： Ba2+Pb2+Sr2+Ca2+Cd2+Cu2+，Zn2+Mg2+ 对于季胺型强碱阴离子交换树指，阴离子的选择性顺序为： ClO4-I-HS04-SCN-NO2-Br-CN-Cl-BrO3-

16、OH- HCO3-H2P04-IO3-CH3COOF二、固定相 作为固定相的离子交换剂，其基质大致有三大类：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶。而离子交换剂又有阳离子和阴离子之分。再根据官能基的离解度大小还有强弱之分（见表21-8）（l）多孔型离子交换树脂 主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交联聚合物，直径约为520m，有微孔型和大孔型之分见图21-12中（a）和（b）。（2）薄膜型离子交换树脂 直径约对30m的固体情性核上，凝聚12m厚的树脂层，如图中（c）。（3）表面多孔型离子交换树脂 在固体情性核上，覆盖一层微球硅胶，再在上面涂一层很薄的离子交换树脂，如图中（d）所示。（4）离子交换键合固定相

17、 用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。它也分为两种类型。一种是键合薄壳型，其载体是薄壳玻珠。另一种是键合微粒载体型，它的载体是多孔微粒硅胶。后者是一种优良的离子交换固定相，它的优点是机械性能稳定，可使用小粒度固定相和高柱压来实现快速分离。 常用的离子交换剂固定相可分以下几种：三、流动相 流动相大都是一定pH和盐浓度（或离子强度）的缓冲溶液。 通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和pH值可控制k值，改变选择性。 如果增加反离子的浓度，则可降低样品离子的竞争吸附能力，从而降低其在固定相上的保留值。 一般，对于阴离子交换树脂来说，各种阴离子的滞留次序为： 柠檬酸离子SO42C2O42-I-NO

18、3-CrO42-Br-SCN- Cl-HCOO-CH3C00-OH-F- 所以用柠檬酸离子洗脱要比用氟离子快。 阳离子的滞留次序大为： Ba2+Pb2+Ca2+Ni2+Cd2+Cu2+Co2+Zn2+Mg Ag+Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li十 但差别不如阴离子明显。 pH值的影响，要视不同情况而定。pH 改变会改变电离度，只要电离度增大，就会使样品的保留增大。四、离子色谱法 用低交换容量（0.02-0.05 mmol/L) 的填料，用电导检测，分析痕量无机离子和有机离子。 待测离子和洗脱离子应有不同响应。 （1）双柱离子色谱法 分离柱+抑制柱 （填充物电荷相反） 若样品为阳离子，用无

19、机酸作流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂。当试样经阳离子交换剂的分离柱后，随流动相进入抑制柱，在抑制柱中发生两个反应： R+OH+H+Cl- R+Cl+H2O R+一OH-+M+Cl-M+OH+R+Cl-可测不可测 可连续自动再生抑制柱，如中空纤维抑制器和平板微膜抑制器。(2) 单柱离子色谱 采用低电导洗脱液，可省去抑制柱。五、离子排斥色谱 不是离子交换色谱。 分离弱酸和弱碱盐 稀盐酸为洗脱剂分离羧酸，抑制柱用Ag+型阳离子交换剂，通过反应 去除冲洗剂中的Cl-。AgClAgCl10-6 尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱一、原理 尺寸排阻色谱是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法。 其固定相为化学情性多孔物质凝胶，它类似于分子筛，但孔径比分子筛大。凝胶内具有一定大小的孔