高效液相色谱

1、. .高效液相色谱百科名片高效液相色谱仪高效液相色谱法High Performance Liquid Chromatography HPLC又称“高压液相色谱、“高速液相色谱、“高别离度液相色谱、“近代柱色谱等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被别离后，进入检测器进展检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的别离分析技术。目录化学信息根本信息性状描述物理说明药理作用危险说明历史特点主要类型构造组成综述高压输液泵色

2、谱柱进样器检测器馏分收集器数据获取和处理系统别离原理液固色谱法离子交换色谱法离子对色谱法离子色谱法空间排阻色谱法流程使用方法综述色谱柱的理论板数别离度拖尾因子测定方法综述面积归一化法主成分自身对照法内标法外标法设备选型综述相对分子质量溶解度化学构造仪器设备综述高压泵梯度洗提进样装置色谱柱检测器应用实例化学信息根本信息性状描述物理说明药理作用危险说明历史特点主要类型构造组成综述高压输液泵色谱柱进样器检测器馏分收集器数据获取和处理系统别离原理液固色谱法离子交换色谱法离子对色谱法离子色谱法空间排阻色谱法流程使用方法综述色谱柱的理论板数别离度拖尾因子测定方法综述面积归一化法主成分自身对照法内标法外标法

3、设备选型综述相对分子质量溶解度化学构造仪器设备综述高压泵梯度洗提进样装置色谱柱检测器应用实例展开化学信息根本信息中文名称：葛根素(HPLC),98% 中文别名：葛根黄酮，8-beta-D-葡萄吡喃糖-4',7-二羟基异黄酮 英文名称：Puerarin 英文别名：8-(-D-Glucopyranosyl-7-hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one 纯度：98%CAS号：3681-99-0 分子式：C21H20O9 分子量：416.38 HPLC1性状描述高含量为白色针状结晶粉末，属于黄酮类。 物理说明熔点187-189°

4、;C 药理作用具有提高免疫，增强心肌收缩力，保护心肌细胞，降低血压，抗血小板聚集等作用。 危险说明危险品标志:F,C 危险类别码:11-34 平安说明:22-24/25-45-36/37/39-26-16 历史1906年俄国植物化学家茨维特Tswett首次提出“色谱法Chromotography和“ 实验室最常用的P230高效液相色谱仪色谱图Chromatogram的概念。他在论文中写到： “原文一植物色素的石油醚溶液从一根主要装有碳酸钙吸附剂的玻璃管上端参加，沿管滤下，后用纯石油醚淋洗，结果按照不同色素的吸附顺序在管内观察到它们相应的色带，就象光谱一样，称之为色谱图。 1930年以后，相继出

5、现了纸色谱、离子交换色谱和薄层色谱等液相色谱技术。 1952年，英国学者Martin和Synge 基于他们在分配色谱方面的研究工作，提出了关于气液分配色谱的比较完整的理论和方法，把色谱技术向前推进了一大步，这是气相色谱在此后的十多年间开展十分迅速的原因。 1958年，基于Moore和Stein的工作，离子交换色谱的仪器化导致了氨基酸分析仪的出现，这是近代液相色谱的一个重要尝试，但别离效率尚不理想。 1960年中后期，气相色谱理论和实践的开展，以及机械、光学、电子等技术上的进步，液相色谱又开场活泼。到60年代末期把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱就出现了HPLC。 1970年中期以后，微处理机

6、技术用于液相色谱，进一步提高了仪器的自动化水平和分析精度。 1990年以后，生物工程和生命科学在国际和国内的迅速开展，为高效液相色谱技术提出了更多、更新的别离、纯化、制备的课题，如人类基因组方案，蛋白质组学有HPLC作预别离等。 特点高效液相色谱法有“三高一广一快的特点： 高效液相色谱HPLC流程示意高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。 高效：别离效能高。可选择固定相和流动相以到达最正确别离效果，比工业精馏塔和气相色谱的别离效能高出许多倍。 高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在uL数量级。 应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可

7、用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的别离分析，显示出优势。 分析速度快、载液流速快：较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在1530分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。 此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。高效液相色谱的缺点是有“柱外效应。在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间进样器、柱接头、连接收和检测池等中，如果流动相的流型有变化，被别离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。 主要类型1吸附

8、色谱Adsorption Chromatography 2分配色谱Partition Chromatography 3离子色谱Ion Chromatography 4体积排阻色谱Size Exclusion Chromatography 5亲和色谱Affinity Chromatography 构造组成综述高效液相色谱仪可分为“高压输液泵、“色谱柱、“进样器、“检测器、“馏分收集器以及“数据获取与处理系统等局部。 高压输液泵功能 驱动流动相和样品通过色谱别离柱和检测系统； 性能要求 流量稳定±1，耐高压3060Mpa，耐各种流动相：例如：有机溶剂、水和缓冲液； 种类 往复泵和隔膜泵。

9、 色谱柱功能 别离样品中的各个物质； 尺寸 1030cm长，25mm内径的内壁抛光的不锈钢管柱； 填料粒度 5 10m ，高效微粒固定相； 进样器功能 将待分析样品引入色谱系统； 种类 注射器，10Mpa以下，110m微量注射器进样 停流进样 阀进样，常用、较 理想、体积可变，可固定 自动进样器，有利于重复操作，实现自动化 检测器功能 将被分析组在柱流出液中浓度的变化转化为光学或电学信号； 分类 示差折光化学检测器 紫外吸收检测器紫外一可同分光光度检测器 二极管阵列紫外检测器 荧光检测器 电化学检测器馏分收集器功能 如果所进展的色谱别离不是为了纯粹的色谱分析，而是为了做其它波谱鉴定，或获取少量

10、试验样品的小型制备，馏分收集是必要的； 方法 手工，少数几个馏分，手续麻烦，易出过失。 馏分收集器收集，比较理想，微机控制操作准确。 数据获取和处理系统功能 把检测器检测到的信号显示出来。 别离原理液液分配色谱法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography)流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶极性不同，防止固定液流失，有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进展分配。到达平衡时，服从于高效液相色谱计算公式： 高效液相色谱计算公式式中，cs溶

11、质在固定相中浓度；cm-溶质在流动相中的浓度； Vs固定相的体积；Vm流动相的体积。LLPC与GPC有相似之处，即别离的顺序取决于K，K大的组分保存值大；但也有不同之处，GPC中，流动相对K影响不大，LLPC流动相对K影响较大。 a. 正相液 液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography): 流动相的极性小于固定液的极性。 b. 反相液 液分配色谱法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流动相的极性大于固定液的极性。 c. 液 液分配色谱法的缺点：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动相中仍有微量溶解；

12、流动相通过色谱柱时的机械冲击力，会造成固定液流失。上世纪70年代末开展的化学键合固定相见后，可抑制上述缺点。现在应用很广泛7080%。 液固色谱法流动相为液体，固定相为吸附剂如硅胶、氧化铝等。这是根据物质吸附作用的不同来进展别离的。其作用机制是：当试样进入色谱柱时，溶质分子 (X) 和溶剂分子(S)对吸附剂外表活性中心发生竞争吸附未进样时，所有的吸附剂活性中心吸附的是S，可表示如下：Xm nSa = Xa nSm 式中：Xm-流动相中的溶质分子；Sa-固定相中的溶剂分子；Xa-固定相中的溶质分子；Sm-流动相中的溶剂分子。 当吸附竞争反响达平衡时： K=XaSm/XmSa 式中：K为吸附平衡常

13、数。讨论：K越大，保存值越大。 离子交换色谱法(Ion-exchange Chromatography) IEC是以离子交换剂作为固定相。IEC是基于离子交换树脂上可电离的离子与流 离子交换色谱柱动相中具有一样电荷的溶质离子进展可逆交换，依据这些离子以交换剂具有不同的亲和力而将它们别离。以阴离子交换剂为例，其交换过程可表示如下： X-(溶剂中) (树脂-R4N Cl-)= (树脂-R4N X-) Cl- (溶剂中) 当交换达平衡时： KX=-R4N X- Cl-/-R4N Cl- X- 分配系数为： DX=-R4N X-/X-= KX -R4N Cl-/Cl- 讨论：DX与保存值的关系 但凡在

14、溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进展别离。 离子对色谱法(Ion Pair Chromatography) 离子对色谱法是将一种 ( 或多种 ) 与溶质分子电荷相反的离子 ( 称为对离子或反离子 ) 加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保存行为。其原 离子色谱仪流程示意理可用下式表示：X 水相 Y-水相 = X Y-有机相式中：X 水相-流动相中待别离的有机离子也可是阳离子；Y-水相-流动相中带相反电荷的离子对如氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲铵等；X Y-形成的离子对化合物。 当达平衡时： KXY = X Y-有机相/ X 水相

15、Y-水相 根据定义，分配系数为： DX= X Y-有机相/ X 水相= KXY Y-水相 讨论：DX与保存值的关系 离子对色谱法(特别是反相)发解决了以往难以别离的混合物的别离问题，诸如酸、碱和离子、非离子混合物，特别是一些生化试样如核酸、核苷、生物碱以及药物等别离。 离子色谱法(Ion Chromatography) 用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相。以电导检测器为通用检测器，为消除流动相中强电解质背景离子对电导检测器的干扰，设置了抑制柱。试样组分在别离柱和抑制柱上的反响原理与离子交换色谱法一样。 以阴离子交换树脂R-OH作固定相，别离阴离子如Br-为例。当待测阴离子Br-随流动相

16、NaOH进入色谱柱时，发生如下交换反响洗脱反响为交换反响的逆过程： 担体图示抑制柱上发生的反响： R-H NaOH- = R-Na H2O R-H Na Br- = R-Na H Br- 可见，通过抑制柱将洗脱液转变成了电导值很小的水，消除了本底电导的影响；试样阴离子Br-那么被转化成了相应的酸H Br-，可用电导法灵敏的检测。 离子色谱法是溶液中阴离子分析的最正确方法。也可用于阳离子分析。 空间排阻色谱法(Steric Exclusion Chromatography) 空间排阻色谱法以凝胶 (gel) 为固定相。它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到数百纳米。溶

17、质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进展别离，而是按分子大小进展别离。别离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，因此就直接通过柱子，首先在色谱图上出现，一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保存值最大，在色谱图上最后出现。 流程流程流程：如右图所示，溶剂贮器1中的流动相被泵2吸入，经3梯度控制器按一写的梯度进展混后然后输出，经4测其压力和流量，导入5进样阀器经6保护柱、7别离柱后到8检测器检测，由10数据处理设备处理数据或11记录仪记录色谱图，12馏分

18、收集器收集馏分，13为废液。 使用方法综述色谱柱的填料和流动相的组分应按各品种项下的规定.常用的色谱柱填料有硅胶和化学键合硅胶。后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用辛基键合硅胶次之,氰基或氨基键合硅胶也有使用；离子交换填料用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等，用于分子排阻色谱等。注样量一般为数微升。除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。 在用紫外吸收检测器时,所用流动相应符合紫外分光光度法项下对溶剂的要求。 正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进 化学键合固

19、定相反响样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变 以适应具体品种并到达系统适用性试验的要求。一般色谱图约于20分钟内记录完毕。 2.系统适用性试验 按各品种项下要求对仪器进展适用性试验，即用规定的对照品对仪器进展试验和调整,应到达规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、别离度和拖尾因子. 色谱柱的理论板数在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图 化学键合固定相应用，量出供试品主成分或内标物质峰的保存时间t(R)和半顶峰宽W(h/2)，按n=5.54t(R)W(h/2)2计算色谱柱的理论板数，如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某

20、些条件如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等，使理论板数到达要求。 别离度定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的别离度。别离度R的计算公式为：2t(R2)-t(R1) ，R= -W1+W2 式中 t(R2)为相邻两峰中后一峰的保存时间； t(R1)为相邻两峰中前一峰的保存时间； W1及W2为此相邻两峰的峰宽。 除另外有规定外，别离度应大于1.5。 拖尾因子为保证测量精度，特别当采用峰高法测量时，应检查待测峰的拖尾因子(T)是否符合各品种项下的规定或不同浓度进样的校正因子误差是否符合要求。拖尾因子计算公式为： W(0.05h) T=-2d1 式中 W(0.05h)为0.

21、05峰高处的峰宽； d1为峰极大至峰前沿之间的距离。 除另有规定外，T应在0.951.05间。 也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，参加规定量的内标溶液，配成三种不同浓度的溶液，分别注样3次,计算平均校正因子，其相对标准偏差应不大于2.0%。 测定方法综述定量测定时，可根据样品的具体情况采用峰面积法或峰高法。但用归一法或内标法测定杂质总量时，须采用峰面积法。 面积归一化法测定供试品或经衍生化处理的供试品中各杂质及杂质的总量限度采用不加校正因子的峰面积归一法。计算各杂质峰面积及其总和，并求出占总峰面积的百分率。但溶剂峰不计算在内。色谱 硅胶图的记录时间

22、应根据各品种所含杂质的保存时间决定，除另有规定外可为该品种项下主成分保存时间的倍数。 主成分自身对照法当杂质峰面积与成分峰面积相差悬殊时，采用主成分自身对照法。在测定前，先按各品种项下规定的杂质限度，将供试品稀释成一定浓度的溶液作为对照溶液，进样，调节检测器的灵敏度或进样量，使对照溶液中的主成分色谱峰面积满足准确测量要求。然后取供试品溶液，进样，记录时间，除另有规定外，应为主成分保存时间的倍数。根据测得的供试品溶液的各杂质峰面积及其总和并和对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质限度。 内标法测定供试品中杂质的总量限度 采用不加校正因子的峰面积法。取供试品，按各品种项下规定的方法配制不含内标物质的

23、供试品溶液，注入仪器，记录色谱图I；再配制含有内标物质的供试品溶液，在同样的条件下注样，记录色谱图。记录的时间除另有规定外，应为该品种项下规定的内标峰保存时间的倍数，色谱图上内标峰高应为记录仪满标度的30%以上，否那么应调整注样量或检测器灵敏度。 如果色谱图中没有与色谱图上内标峰保存时间一样的杂质峰，那么色谱图中各杂质峰面积之和应小于内标物质峰面积溶剂峰不计在内。如果色谱图中有与色谱图上内标物质峰保存时间一样的杂质峰，应将色谱图上的内标物质峰面积减去色谱图中此杂质峰面积，即为内标物质峰的校正面积；色谱图中各杂质峰总面积加色谱图中此杂峰面积，即为各杂质峰的校正总面积，各杂质峰的校正总面积应小于内

24、标物质峰的校正面积。 加校正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量 按各品种项下的规定,精细称量取对照品和内标物质，分别配成溶液，精细量取各溶液，配成校正因子测定用的对照溶液，取一定量注入仪器，记录色谱图，测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子： As/ms校正因子f=- Ar/mr 式中 As为内标物质的峰面积或峰高，Ar为对照品的峰面积或峰高； ms为参加内标物质的量mr为参加对照品的量。 再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品或其杂质峰和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：Ax 含量mx=f×-As/ms 式中 Ax为供试品或

25、其杂质峰面积或峰高； mx为供试品或其杂质的量。 f、As和ms的意义同上。 当配制校正因子测定用的对照溶液和含有内标物质的供试品溶液使用同一份内标物质溶液时，那么配制内标物质溶液不必精细称量取。 外标法测定供试品中某个杂质或主成分含量 按各品种项下的规定,精细称(量)取对照品和供试品，配制成溶液，分别精细取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品和供试品待测成分的峰面积或峰高，按下式计算含量： A<x> 含量mx=mr×-Ar式中各符号意义同上 由于微量注射器不易准确控制进样量，当采用外标法测定供试品中某杂质或主成分含量时，以定量环进样为好。 设备选型综述要正确地选择色

26、谱别离方法，首先必须尽可能多的 了解样品的有关性质，其 选型常用参照表次必须熟悉各种色谱方法的主要特点及其应用范围。选择色谱别离方法的主要根据是样品的相对分子质量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度以及化学构造等物理、化学性质。 相对分子质量对于相对分子质量较低一般在200以下，挥发性比较好，加热又不易分解的样品，可以选择气相色谱法进展分析。相对分子质量在200 2000的化合物，可用液固吸附、液-液分配和离子交换色谱法。相对分子质量高于2000，那么可用空间排阻色谱法。 溶解度水溶性样品最好用离子交换色谱法和液液分配色谱法；微溶于水，但在酸或碱存在下能很好电离的化合物，也可用离

27、子交换色谱法；油溶性样品或相对非极性的混合物，可用液-固色谱法。 化学构造假设样品中包含离子型或可离子化的化合物，或者能与离子型化合物相互作用的化合物例如配位体及有机螯合剂，可首先考虑用离子交换色谱，但空间排阻和液液分配色谱也都能顺利地应用于离子化合物；异构体的别离可用液固色谱法；具有不同官能团的化合物、同系物可用液液分配色谱法；对于高分子聚合物，可用空间排阻色谱法。 仪器设备实例综述HPLC的出现不过三十多年的时间，但这种别离分析技术的开展十分迅猛，目前应用也十分广泛。其仪器构造和流程也多种多样。典型的高效液相色谱仪构造和流程可用以下方框图表示See Fig.3-4。高效液相色谱仪一般都具备

28、贮液器、高压泵、梯度洗提装置用双泵、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。 高效液相色谱更适宜于别离、分析高沸点、热稳定性差、有生理活性及相对分子量比较大的物质，因而广泛应用于核酸、肽类、内酯、稠环芳烃、高聚物、药物、人体代谢产物、外表活性剂，抗氧化剂、杀虫剂、除莠剂的分析等物质的分析。 高压泵HPLC使用的色谱柱是很细的16 mm，所用固定相的粒度也非常小几m到几十m，所以流动相在柱中流动受到的阻力很大，在常压下，流动相流速十分缓慢，柱效低且费时。为了到达快速、高效别离，必须给流动相施加很大的压力，以加快其在柱中的流动速度。为此，须用高压泵进展高压输液。高压、高速是高效液相色谱的

29、特点之一。 仪器主要组成HPLC使用的高压泵应满足以下条件： a. 流量恒定，无脉动，并有较大的调节范围一般为110 mL/min； b. 能抗溶剂腐蚀； c. 有较高的输液压力；对一般别离，60×105Pa的压力就满足了，对高效别离，要求到达150300×105Pa。 (1). 往复式柱塞泵 当柱塞推入缸体时，泵头出口上部的单向阀翻开，同时，流动相进入的单向阀下部关闭，这时就输出少量的流体。反之，当柱塞向外拉时，流动相入口的单向阀翻开，出口的单向阀同时关闭，一定量的流动相就由其储液器吸入缸体中。这种泵的特点是不受整个色谱体系中其余局部阻力稍有变化的影响，连续供给恒定体积的

30、流动相。 2气动放大泵其工作原理是：压力为 p1 的低压气体推动大面积 SA 活塞 A ，那么在小面积 SB 活塞 B 输出压力增大至 p2 的液体。压力增大的倍数取决于 A 和 B 两活塞的面积比，如果 A 与 B 的面积之比为 50 : 1 ，那么压力为 5 × Pa 的气体就可得到压力为 250×Pa 的输出液体。这是一种恒压泵。 梯度洗提类似于GC中的程序升温。已成为现代高效液相色谱中部缺少的局部。 气动放大泵梯度洗提，就是载液中含有两种或更多不同极性的溶剂，在别离过程中按一定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的变化来改变被别离组分的别离因素，以提

31、高别离效果。梯度洗提可以分为两种： a. 低压梯度也叫外梯度：在常压下，预先按一定程序将两种或多种不同极性的溶剂混合后，再用一台高压泵输入色谱柱。 b.高压梯度 ( 或称内梯度系统 ) ：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按设定的比例送入梯度混合室，混合后，进入色谱柱。 进样装置(1).注射器进样装置：进样所用微量注射器及进样方式与 GC法一样。进样压力150×105Pa时，必须采用停流进样。(2).高压定量进样阀：与GC法用的流通法相似，能在高压下进样。 色谱柱色谱柱是色谱仪最重要的部件心脏。通常用厚壁玻璃管或内壁抛光的不锈钢管制作的，对于一些有腐蚀性的样品且要求耐高压时，可

32、用铜管、铝管或聚四氟乙烯管。柱子内径一般为16 mm。常用的标准柱型是内径为 4.6 或 3.9mm ，长度为 15 30cm 的直形不锈钢柱。填料颗粒度 5 10m ，柱效以理论塔板数计大约 7000 10000 。 开展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 检测器(1).紫外光度检测器 它的作用原理是基于被分析试样组分对特定波长紫外光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关系遵守比尔定律。最常用的检测器，应用最广，对大局部有机化合物有响应。 特点： a.灵敏度高：其最小检测量10-9g·mL-1，故即使对紫外光吸收很弱的物质，也可以检测； b. 线性范围宽；(比尔定律) c. 流通池可做的很小1mm × 10mm ，容积 8L； d. 对流动相的流速和温度变化不敏感可用于梯度洗脱； e. 波长可选，易于操作:如，使用装有流通池的可见紫外分光