2基因工程-1酶ppt课件

1、1第二章第二章 基因工程基因工程 Gene engineering Gene engineering2 基因工程的定义基因工程的定义3内内 容容4 基因工程的技术流程基因工程的技术流程5第一节第一节 基因工程工具酶基因工程工具酶6一、限制性内切酶一、限制性内切酶 （Restriction EndonucleaseRestriction Endonuclease）782. 2. 限制性核酸内切酶的定义和生物学功能限制性核酸内切酶的定义和生物学功能定义：凡能识别和切割双链定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸分子内特定核苷酸序列的酶，称为限制性核酸内切酶，简称限制酶。序列的酶，称为限制性核

2、酸内切酶，简称限制酶。生物学功能：生物学功能：A. 防御外来生物在体内繁殖。防御外来生物在体内繁殖。B. 限制限制-修饰系统决定了噬菌修饰系统决定了噬菌体、病毒等具有种属特异性。体、病毒等具有种属特异性。C. 阻止了生物远距离种属间阻止了生物远距离种属间杂交优势。杂交优势。9Hind III 属名属名 种名种名 株名株名 序数序数 含义：流感嗜血杆菌含义：流感嗜血杆菌d株株(Haemophilus influenzae d)的第的第三种酶三种酶3. 限制酶的命名限制酶的命名 第第1个字母是产生该酶的细菌属名的第一个字母，大写；个字母是产生该酶的细菌属名的第一个字母，大写； 第第2-3个字母个字

3、母 是细菌种名的前两个字母，小写；是细菌种名的前两个字母，小写； 第第4个字母是株名的第一个字母，小写；个字母是株名的第一个字母，小写； 用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。104. 限制酶系统分类限制酶系统分类11限制酶特性比较限制酶特性比较 I型型 II型型 III型型举例举例 EcoB BamHI EcoPL亚基亚基 三种不同的亚基三种不同的亚基 两个相同的亚基两个相同的亚基 两种两种活性活性 限制酶、修饰酶限制酶、修饰酶 限制酶限制酶 限制酶、修限制酶、修饰酶饰酶酶反应辅助因子酶反应辅助因子ATP.mg+ SAM mg+ ATP.mg+SAM识别位点特性识别位点

4、特性 / 4-6bp回文对称回文对称 /识别位点识别位点 TGAN8TGCT GGATCC AGACC切割位点切割位点 可变，间隔可变，间隔1kb 识别位点中识别位点中 距距3端端24-26bp克隆工作中用途克隆工作中用途 无无 有有 无无SAM: 硫一腺苷甲硫氨酸硫一腺苷甲硫氨酸125. II5. II型限制酶的识别特点型限制酶的识别特点 A. A. 识别顺序一般为识别顺序一般为4-7 bp4-7 bp B. B. 识别切割位点具有旋转对称性识别切割位点具有旋转对称性( (回文结回文结构构) ) 4bp HpaC CGG Hae GG CC 5bp Ava G GWCC EcoR CCWGG

5、 6bp BamHG GATTC SmaCCC GGG136. 6. 限制酶的切割末端限制酶的切割末端 平端：缺口在识别序列对称轴上平端：缺口在识别序列对称轴上Hind I I Hind I I ） 5 5粘端：缺口在对称轴粘端：缺口在对称轴55端一侧端一侧EcoR IEcoR I） 3 3粘端：缺口在对称轴粘端：缺口在对称轴33端一侧端一侧Pst Pst I I）限制酶产生的末端的连接限制酶产生的末端的连接A. A. 匹配粘端匹配粘端: : 直接连接直接连接B. B. 平末端平末端: : 万能连接万能连接C. C. 不匹配粘端：不匹配粘端： S1 Nuclease S1 Nuclease切去

6、突出端或切去突出端或KlenowKlenow补平补平147. 7. 识别位点与切割方式之间的关系识别位点与切割方式之间的关系 A. A.识别不同，切割不同识别不同，切割不同 eg: BamHI eg: BamHI EcoRIEcoRI -G GATC -G GATC C- C- - A - A GATCT- GATCT- -C -C CTAG G- - T CTAG G- - T CTAG CTAG A- A- B. B.识别不同，切割产生末端相同识别不同，切割产生末端相同( (同尾酶同尾酶) ) eg: BamHI eg: BamHI Bg1 Bg1 - A - A GATCT -G GAT

7、CT -G GATCCGATCC - T CTAG - T CTAG A -CCTAG A -CCTAG G G15C.识别相同，切割不同识别相同，切割不同 eg: SmaI XmaI -CCC GGG-C CCGGG - -GGG CCC- -G GGCC C-D.识别相同，切割相同识别相同，切割相同同工酶同工酶 同裂酶同裂酶 eg: Hpa Msp -CCGG- -C * C GG- -GG CC- -G G CC-甲基化后不可切割甲基化后不可切割 甲基化后仍可切割甲基化后仍可切割 168.8.限制酶反应的影响因素限制酶反应的影响因素1. 1. 温度：一般温度：一般3737C C 有例外有

8、例外, ,如：如：SmaI 25SmaI 25C C， BclI 50 BclI 50C C，TaqI 65TaqI 65C C2. 2. 缓冲液：高、中、低盐之分缓冲液：高、中、低盐之分 3. 3. 时间：时间：1-21-2小时小时4. 4. 反应体积和甘油浓度：酶反应体积和甘油浓度：酶1/108.0) 存在有害试剂存在有害试剂(1%乙乙 醇醇, DMSO, 乙乙二醇二醇) 阳离子变化阳离子变化:Mn+, Co+, Zn+, Cu+代替代替mg+21酶的灭活酶的灭活琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳22酶切操作技术酶切操作技术2324限制酶的应用：限制酶的应用：1. res

9、triction map 1. restriction map 2. DNA physical map 2. DNA physical map ：a series of ERa series of ER3. gene library construction 3. gene library construction application2526聚合酶：聚合酶： 细菌细菌DNA聚合酶聚合酶*E. Coli DNA聚合酶聚合酶 I全酶）全酶） *Klenow酶酶 噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶 T4噬菌体噬菌体DNA聚合聚合酶酶 *测序酶修饰的测序酶修饰的T7 pol） *Taq DNA聚合聚合

10、酶酶 *反转录酶反转录酶 末端脱氧核苷酸末端脱氧核苷酸转移酶转移酶 RNA聚合酶聚合酶 SP6噬菌体噬菌体RNA聚合聚合酶酶 T3噬菌体噬菌体RNA聚合聚合酶酶 T4噬菌体噬菌体RNA聚聚合酶合酶27连接酶：连接酶： E. Coli DNA连接连接 *T4 DNA连接酶连接酶 T4噬菌体噬菌体 RNA连接酶连接酶修饰酶：修饰酶： 激酶激酶 T4噬菌体多核苷酸激酶噬菌体多核苷酸激酶 磷酸酶磷酸酶 *碱性磷酸酶碱性磷酸酶 核酸酶核酸酶 Ba131核酸酶核酸酶 S1核酸酶核酸酶 绿豆核绿豆核酸酶酸酶 RNaseA RNaseT1 DNaseI EXo 噬菌体外切核酸酶噬菌体外切核酸酶 甲基化酶甲基化

11、酶28二、二、DNADNA聚合酶聚合酶DNA polymeraseDNA polymerase）依赖于依赖于DNADNA的的DNADNA聚合酶聚合酶: DNA: DNA聚合酶聚合酶(全酶全酶);); klenow klenow大片段大片段; ; 耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶 (Taq (Taq 酶酶) )依赖于依赖于RNARNA的的DNADNA聚合酶聚合酶: : 逆转录酶。逆转录酶。不依赖于不依赖于DNADNA的的DNADNA聚合酶聚合酶: : 末端转移酶。末端转移酶。29活性活性3）活性活性1）302. Klenow大片段大片段 枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解

12、E. Coli DNA聚合酶得到的该酶的大片段聚合酶得到的该酶的大片段 活性：（活性：（153聚合酶活性聚合酶活性 （235外切核酸酶活性外切核酸酶活性 主要用途：主要用途： (1)补平补平3凹端凹端 (2)补平补平3凹端，末端标记凹端，末端标记 (3)合成合成cDNA第二链第二链 (4)体外诱变中从单链模板合成双链体外诱变中从单链模板合成双链 DNA314. T7噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶 活性：活性： （1） 53聚合酶活性很强）聚合酶活性很强） （2） 3-5 外切活性，为外切活性，为 Klenow的的1000 倍倍 主要用途：修饰后用于测序主要用途：修饰后用于测序Sequenase

13、测序酶）：切除了测序酶）：切除了 99% 以上的以上的 3-5 外切活性。外切活性。 Sequenase Version 2 ：切除了所有的：切除了所有的 3-5 外切活性，是测序外切活性，是测序 的理想用酶。的理想用酶。 3. T4 噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶 活性：（活性：（153聚合酶活性聚合酶活性 （235外切核酸酶活性外切核酸酶活性, 比比 Klenow强强200倍倍 主要用途主要用途: 3突出端切平突出端切平 326.逆转录酶：逆转录酶： 源于源于AWV (鸟成髓细胞白血病病毒鸟成髓细胞白血病病毒)， 或或Mo-MLV(Moloney鼠白血病病毒鼠白血病病毒) 活性：活性： (

14、1) 53聚合酶活性聚合酶活性 (2) RNaseH活性活性(即外切即外切RNA酶活性酶活性) 主要用途：反转录合成主要用途：反转录合成cDNA第一条链第一条链337.末端转移酶末端转移酶作用作用:无模板的情况下，在无模板的情况下，在DNA或或RNA3羟基上羟基上加加dNTP主要用途：主要用途：(1)载体或载体或cDNA加同聚尾加同聚尾(100nt) (2)DNA的的3OH末端同位素标记末端同位素标记34DNADNA聚合酶的用途：聚合酶的用途： 1 1DNADNA分子的标记分子的标记 2 2DNADNA的序列分析的序列分析 3 3DNADNA的末端修饰的末端修饰 4 4合成双链合成双链cDNA

15、cDNA 5 5定点突变定点突变 6 6基因扩增基因扩增PCRPCR技术技术）35三、三、RNA聚合酶聚合酶RNA polymerase） 催化催化RNA体外合成反应体外合成反应 分类：依赖分类：依赖DNA的的RNA聚合酶聚合酶 不依赖不依赖DNA的的RNA聚合酶聚合酶36用途：具有修复单链或双链的能力用途：具有修复单链或双链的能力, ,在在DNADNA重组、复制重组、复制 和损伤后的修复中都起关键作用。和损伤后的修复中都起关键作用。37383940T4多聚核苷酸激酶：多聚核苷酸激酶：催化催化ATP的的 -磷酸基到磷酸基到DNA或或RNA的的5 OH主要用途主要用途:对缺乏对缺乏 5-磷酸的磷

16、酸的 DNA 或合成接头进行磷酸化或合成接头进行磷酸化; 对对5OH末端进行同位素标记末端进行同位素标记五、激酶五、激酶(Kinase)(Kinase) 对核酸末端羟基进行磷酸化的对核酸末端羟基进行磷酸化的酶。酶。41六、碱性磷酸酶六、碱性磷酸酶 去除核酸末端磷酸基团的酶去除核酸末端磷酸基团的酶.包括包括: 细菌碱性磷酸酶细菌碱性磷酸酶(BAP) 牛小肠碱性磷酸酶牛小肠碱性磷酸酶(CIP) 虾碱性磷酸酶虾碱性磷酸酶(SAP)主要用途主要用途: 去除去除DNA、RNA的的5磷酸根，防止片段自磷酸根，防止片段自身连接身连接;标志标志5 端前除端前除 DNA 或或 RNA 5 磷酸磷酸 4243七、

17、核酸酶七、核酸酶nucleasenuclease） 以核酸为底物的水解酶以核酸为底物的水解酶按底物专一性分：按底物专一性分：RNaseRNase、DNaseDNase、非专一性核酸酶、非专一性核酸酶按作用位点分：内切酶或外切酶按作用位点分：内切酶或外切酶 5- 5-核酸酶或核酸酶或3-3-核酸酶核酸酶常用常用:BAL31:BAL31核酸酶、核酸酶、S1S1核酸酶、绿豆核酸酶、核酸酶、绿豆核酸酶、 RNaseA RNaseA、RNaseT1RNaseT1、DNaseDNase、 外切核酸酶外切核酸酶、 噬菌体外切核酸酶等。噬菌体外切核酸酶等。许多核酸酶兼有内切和外切活性许多核酸酶兼有内切和外切活

18、性442.RNA2.RNA酶酶 内切核糖核酸酶内切核糖核酸酶, ,专用降解专用降解RNARNA1.DNA1.DNA酶酶 为为DNADNA内切核酸酶内切核酸酶, ,水解单链或双链水解单链或双链 用途用途:(1):(1)缺口平移标记探针时产生随机切口缺口平移标记探针时产生随机切口 (2) (2)降解降解DNADNA453. S1核酸酶核酸酶 作用作用:降解单链降解单链DNA或或RNA(酶量小酶量小) 降解双链降解双链DNA(酶量大酶量大) 用途用途:(1)去除去除DNA突出端突出端,切为平头切为平头 (2)切除切除cDNA发夹结构发夹结构4.4.外切核酸酶外切核酸酶III(ExoIII)III(E

19、xoIII) 作用作用: :从双链从双链 DNA3OH DNA3OH 逐一降解单核苷酸逐一降解单核苷酸 不降解单链不降解单链DNADNA或或33突出的双链突出的双链DNADNA 用途用途: :系列缺失亚克隆系列缺失亚克隆46 核酸酶的分类核酸酶的分类 内切酶内切酶 非专一性非专一性 外切酶外切酶 3 3- -核酸核酸酶酶 核酸酶核酸酶 内切酶内切酶 5 5- -核酸核酸酶酶 RNA RNA 外切酶外切酶 专一性专一性 非限制非限制性性 内切酶内切酶 限制性限制性 DNA DNA 外切酶外切酶 47八、甲基化酶八、甲基化酶MethylaseMethylase）1. Dam 1. Dam 甲基化酶

20、甲基化酶 在在 GATC GATC 序列中的腺嘌呤序列中的腺嘌呤 N6 N6 位置上引位置上引入甲基入甲基 。 限制酶限制酶Pvu, BamHPvu, BamH、BclBcl、BglBgl、XhoXho、MboMbo、 Sau3A Sau3A）的）的识别位点中含识别位点中含 GATC GATC 序列。序列。2. Dcm 2. Dcm 甲基化酶甲基化酶 识别识别 CCAGG CCAGG 或或 CCTGG CCTGG 序列，在第二个胞嘧啶序列，在第二个胞嘧啶 C C 的的 C5 C5 位置上引入甲基位置上引入甲基 。受受 Dcm Dcm 甲基化作用影响的酶有甲基化作用影响的酶有 EcoR EcoR

21、（CCWGGCCWGG） 483. EcoK 3. EcoK 甲基化酶甲基化酶 识别位点少，识别识别位点少，识别 AAC AACN N6GTGC 6GTGC 和和 GCAC GCACN N6GTT 6GTT 序列中序列中 A A 的的 N6 N6 位置位置 。 4. Sss 4. Sss 甲基化酶甲基化酶 来自原核生物来自原核生物 Spiroplasma Spiroplasma ，可使，可使 CG CG 序列中的序列中的 C C 在在 C5 C5 位置上甲基化。位置上甲基化。敏感酶：如敏感酶：如 Aat Aat、 Cla Cla、 Xho Xho、 Sal Sal 等等 。495.5.甲基化酶的作用甲基化酶的作用 A. A.修饰酶切位点：修饰酶切位点： Hinc Hinc 可识别四个位点可识别四个位点GTCGACGTCGAC、 GTCAACGTCAAC、 GTTGAC GTTGAC 和和 GTTAAC GTTAAC），甲基化酶），甲基化酶 M.Taq M.Taq 处置处置 DNA DNA 后，将后，将TCGA TCGA 中的中的 A A甲基