蛋白质的结构和功能

1、Welcome to Our Class主讲教师：贾爽主讲教师：贾爽 绪 论 生物化学生物化学是用化学的原理和方法，是用化学的原理和方法，从分子水平来研究生物体的化学组从分子水平来研究生物体的化学组成，及其在体内的代谢转变规律从成，及其在体内的代谢转变规律从而阐明生命现象本质的一门科学。而阐明生命现象本质的一门科学。生命的共同生命的共同“语言语言”化学化学 生命的化生命的化学，化学学，化学的生命的生命 一、生物化学发展简史一、生物化学发展简史二、生物化学研究内容二、生物化学研究内容三、生物化学与医学三、生物化学与医学四、本学期课程要求和考核办法四、本学期课程要求和考核办法第一阶段：第一阶段：静

2、态静态/ /叙述生物化学阶段叙述生物化学阶段第二阶段第二阶段：动态生物化学阶段动态生物化学阶段第三阶段：第三阶段：分子生物学时期分子生物学时期 “詹姆斯詹姆斯沃森（沃森（James D. Watson）1953年年 Watson（美）与（美）与 Crick（英）提出（英）提出DNA分子的双螺分子的双螺旋结构模型，旋结构模型，1962年共获诺贝尔奖。年共获诺贝尔奖。 弗朗西斯弗朗西斯克里克（克里克（Francis H. Crick）法国科学家利用基因技术法国科学家利用基因技术“制造制造”出了一只可以发出绿色荧光的兔子出了一只可以发出绿色荧光的兔子“Alba”。在实验中，。在实验中，科学家们应用了

3、受精卵显微注射技术，他们首先从一种水母身上采集了一种荧光蛋白，然后进行科学家们应用了受精卵显微注射技术，他们首先从一种水母身上采集了一种荧光蛋白，然后进行了基因改良，使它的发光率比原先提高了两倍，然后再将这种基因植入到了兔子的受精卵中，由了基因改良，使它的发光率比原先提高了两倍，然后再将这种基因植入到了兔子的受精卵中，由此培养出了会发光的兔子此培养出了会发光的兔子Alba。在普遍光线下，它看上去与其它同类没有区别，但是在较暗的。在普遍光线下，它看上去与其它同类没有区别，但是在较暗的光线下，它的身体就会放射出奇异的绿光来。光线下，它的身体就会放射出奇异的绿光来。 OOOHOHOOO HHOOO

4、HON+ N H3 + H2O还 原 茚 三 酮 水 合 茚 三 酮 蓝 紫 色 化 合 物OOO HO HR - C H - C O O HN H2C HOOO HH水 合 茚 三 酮 氨 基 酸 还 原 茚 三 酮+ N H3 + C O2 + R - C H OO .D5 7 0 1998年，年，中国人中国人-曹谊林曹谊林在美国麻省大学在美国麻省大学查里斯查里斯文森提文森提(Charles Vacanti)的实验室的实验室创造该奇迹。创造该奇迹。13091309元元/ /支，支，1414支支/ /盒，盒，2121天天1 1个疗程个疗程重组人血管内皮抑制重组人血管内皮抑制素为血管生成抑制类

5、素为血管生成抑制类新生物制品，其作用新生物制品，其作用机理是通过抑制形成机理是通过抑制形成血管的内皮细胞迁移血管的内皮细胞迁移来达到抑制肿瘤新来达到抑制肿瘤新生血管的生成，阻断生血管的生成，阻断了肿瘤细胞的营养供了肿瘤细胞的营养供给，从而达到抑制肿给，从而达到抑制肿瘤增殖或转移目的。瘤增殖或转移目的。 世界上首例血管内皮抑制素抗癌新药世界上首例血管内皮抑制素抗癌新药 费用费用300-400元元/张；几天完成；张；几天完成；13个核心位点重复率个核心位点重复率千亿分之一千亿分之一；基本不会泄漏个人遗传信息基本不会泄漏个人遗传信息 生物化学研究内容生物化学研究内容 生物大分子的结构与功能生物大分子

6、的结构与功能 物质代谢及其调节物质代谢及其调节 遗传信息的传递及其调控遗传信息的传递及其调控 专题篇专题篇 生物化学与医学生物化学与医学 生物化学的理论与技术已渗透到医学科生物化学的理论与技术已渗透到医学科学的各个领域学的各个领域 生物化学与分子生物学在生命科学中占生物化学与分子生物学在生命科学中占有重要的地位有重要的地位 生物化学的发展促进了疾病病因、诊断生物化学的发展促进了疾病病因、诊断和治疗的研究和治疗的研究18参考书参考书1 .生物化学生物化学 主编主编 查锡良查锡良, 人民卫生出版社人民卫生出版社 2008年年2. 医学细胞与分子生物学医学细胞与分子生物学 主编主编 陈诗书等科学出版

7、社陈诗书等科学出版社2004年年3. 生物化学生物化学 主编主编 王镜岩等高等教育出版社王镜岩等高等教育出版社2002年年4.生物化学生物化学 主编主编 刘新光等刘新光等 科学出版社科学出版社 2007年年5. Berg J M , et al . Biochemistry.5th ed. 20026. Lehninger A , et al . Lehninger Principles of Biochemistry. 3rd ed.7. Murray R K, et al. Harpers Biochemistry,25th ed. 2000.（英文影印本）北京：科学出版社（英文影印本）北

8、京：科学出版社.学习方法学习方法万能方法：理解记忆万能方法：理解记忆蛋白质的结构与功能蛋白质的结构与功能第第 一一 章章Structure and Function of Protein2013年执业医师考试大纲蛋白质蛋白质(protein)是由许多氨基酸是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。相连形成的高分子含氮化合物。蛋白质的生物学重要性蛋白质的生物学重要性1. 蛋白质是生物体的重要组成成分蛋白质是生物体的重要组成成分2. 蛋白质具有重要的生物学功能蛋白质具有重要的生物学功能1）作为生物催化剂）作为生物催化剂2）代谢调

9、节作用）代谢调节作用3）免疫保护作用）免疫保护作用4）物质的转运和存储）物质的转运和存储5）运动与支持作用）运动与支持作用6）参与细胞间信息传递）参与细胞间信息传递3. 氧化供能氧化供能蛋白质的分子组成The Molecular Component of Protein第第 一一 节节 蛋白质的元素组成蛋白质的元素组成主要有主要有C、H、O、N和和S。 有些蛋白质含有少量有些蛋白质含有少量P或金属元素或金属元素Fe、Cu、Zn、Mn、Co、Mo，个别蛋白质还，个别蛋白质还含有含有 I 。蛋白质的含氮量平均为蛋白质的含氮量平均为16。 通过样品含氮量计算蛋白质含量的公式：通过样品含氮量计算蛋白质

10、含量的公式： 蛋白质元素组成的特点蛋白质元素组成的特点100克样品中蛋白质的含量克样品中蛋白质的含量 (g %)= 每克样品含氮克数每克样品含氮克数 6.251001/16%一、氨基酸一、氨基酸 蛋白质的基本组成单位蛋白质的基本组成单位存在自然界中的氨基酸有存在自然界中的氨基酸有300余种，余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，种，且均属且均属 L- -氨基酸氨基酸（甘氨酸除外）。（甘氨酸除外）。H甘氨酸甘氨酸CH3丙氨酸丙氨酸L-氨基酸的通式氨基酸的通式RC+NH3COO-H 非极性脂肪族氨基酸非极性脂肪族氨基酸 极性中性氨基酸极性中性氨基酸 芳香族氨基酸芳香

11、族氨基酸 酸性氨基酸酸性氨基酸 碱性氨基酸碱性氨基酸二、氨基酸的分类二、氨基酸的分类非极性脂肪族氨基酸非极性脂肪族氨基酸2. 极性中性氨基酸极性中性氨基酸3. 芳香族氨基酸芳香族氨基酸C H2C H C O O-N H2+C H2C H2C H2C H C O O-N H2+C H2C H24. 酸性氨基酸酸性氨基酸5. 碱性氨基酸碱性氨基酸Aspartic acid (Asp)Glutamic acid (Glu)天天冬冬氨氨酸酸谷谷氨氨酸酸CH2CHNH3COOCH2CHNH3COOOOCOOC CH2Lysine (Lys)精精氨氨酸酸赖赖氨氨酸酸Arginine (Arg) 组组氨氨酸

12、酸CH2CHNH3COOCH2CHNH3COONH2CH2CH2CH2CH2CHNH3COONH2CNHCH2CH2NHHCNCHNHCHistidine (His)几种特殊氨基酸几种特殊氨基酸Gly：无手性碳原子。：无手性碳原子。Pro：为环状亚氨基酸。：为环状亚氨基酸。Cys：可形成二硫键。：可形成二硫键。NH2CHCOOHCH2NH2CHCOOHCH22Cys胱氨酸二硫键SHSSCH2CHNH2COOH2HCHNH2CO O HR CHNH2CO O HR三、氨基酸的理化性质三、氨基酸的理化性质1. 两性解离及等电点两性解离及等电点2. 紫外吸收紫外吸收 3. 茚三酮反应茚三酮反应 pH

13、=pI+OH-pHpI+H+OH-+H+pHpI氨基酸的兼性离子氨基酸的兼性离子 阳离子阳离子阴离子阴离子CHNH3+COO-R CHNH3+COO-RCHNH2COO-R CHNH2COO-RCH COOHRNH3+CH COOHRNH3+芳香族氨基酸的紫外吸收芳香族氨基酸的紫外吸收四、四、蛋白质是由许多氨基酸残基组成的蛋白质是由许多氨基酸残基组成的 多肽链多肽链* 肽键肽键(peptide bond)：是由一个氨基是由一个氨基酸的酸的 -羧基与另一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的 -氨基氨基脱水缩合而形成的化学键。脱水缩合而形成的化学键。（一）肽（一）肽(peptide)H2N C CHR1

14、OHO+N CHHHR2COOHH2OH2N CCHR1ONCHR2COOHH肽键N H2-C H -C -N -C H -COO HHHHON H2-C H -C -N -C H -COO HHHHONH-CH-CHOHO OH甘甘氨氨酸酸+-HOH甘氨酰甘氨酸甘氨酰甘氨酸肽键肽键 肽肽 二肽，三肽二肽，三肽 寡肽寡肽(oligopeptide)，多肽，多肽(polypeptide) 氨基酸残基氨基酸残基(residue) 多肽链多肽链(polypeptide chain) 氨基末端（氨基末端（amino terminal）和羧基末端）和羧基末端（carboxyl terminal）多肽链多

15、肽链 多肽链多肽链N末端末端C末端末端牛核糖核酸酶牛核糖核酸酶（二）（二） 几种生物活性肽几种生物活性肽 1. 谷胱甘肽谷胱甘肽(glutathione, GSH)结构结构: : 谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽三肽 谷氨酸的谷氨酸的 -羧基羧基形成肽键形成肽键 SH为活性基团为活性基团 为为酸性肽酸性肽 是体内重要的是体内重要的还原剂还原剂GSH过氧过氧化物酶化物酶H2O2 2GSH 2H2O GSSG GSH还原酶还原酶NADPH+H+ NADP+ 主要功能主要功能: :肽类激素：如促甲状腺素释放激素（肽类激素：如促甲状腺素释放激素（TRH）神经肽神经肽(n

16、europeptide)2. 肽类激素及神经肽肽类激素及神经肽蛋 白 质 的 分 子 结 构The Molecular Structure of Protein 第第 二二 节节蛋白质的分子结构包括：蛋白质的分子结构包括： 一级结构一级结构 (primary structure)二级结构二级结构 (secondary structure)三级结构三级结构 (tertiary structure)四级结构四级结构 (quaternary structure)高级结构高级结构或空间构或空间构象象定义：定义：蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。的排列顺序。一、

17、蛋白质的一级结构一、蛋白质的一级结构主要化学键：主要化学键：肽键肽键二硫键二硫键的位置属于一级结构研究范畴。的位置属于一级结构研究范畴。 一级结构是蛋白质空间构象和特异生一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。物学功能的基础。胰岛素的一级结构胰岛素的一级结构3021二、蛋白质的二级结构二、蛋白质的二级结构蛋白质分子中某一段肽链的局部空蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象的构象 。定义：定义：稳定因素稳定因素： 氢键氢键 蛋白质二级结构的主要形式蛋白质二

18、级结构的主要形式 -螺旋螺旋 ( -helix ) -折叠折叠 ( -pleated sheet ) -转角转角 ( -turn ) 无规卷曲无规卷曲 ( random coil ) （一）肽单元（一）肽单元 (peptide unit) 参与组成肽键的参与组成肽键的6个原子位于同一平面，个原子位于同一平面，又叫酰胺平面或肽键平面。它是蛋白质构又叫酰胺平面或肽键平面。它是蛋白质构象的基本结构单位。象的基本结构单位。PrNH3+COOHPrNH3+COO- -PrNH2COO- -OH- -H +OH- -H +兼 性 离 子p H = p I阳 离 子p H p IHHHH（二）（二） -螺旋

19、螺旋: 多肽链主链围绕中心轴形成多肽链主链围绕中心轴形成右手螺旋右手螺旋，侧链侧链伸向螺旋外侧。伸向螺旋外侧。每圈螺旋含每圈螺旋含3.6个氨基酸个氨基酸，螺距为，螺距为0.54nm。每个肽键的亚氨氢和第四个肽键的羰基氧形成每个肽键的亚氨氢和第四个肽键的羰基氧形成的氢键保持螺旋稳定。的氢键保持螺旋稳定。氢键氢键与螺旋长轴基本平行。与螺旋长轴基本平行。 侧链伸出螺旋。侧链伸出螺旋。（三）（三） - -折叠折叠多肽链充分伸展，相邻肽单元之间折叠成锯多肽链充分伸展，相邻肽单元之间折叠成锯齿状结构，侧链位于锯齿结构的上下方。齿状结构，侧链位于锯齿结构的上下方。 两段以上的两段以上的 -折叠结构平行排列折

20、叠结构平行排列 ，两链间可，两链间可顺向平行，也可反向平行顺向平行，也可反向平行 。两链间的肽键之间形成氢键，以稳固两链间的肽键之间形成氢键，以稳固 -折叠折叠结构。氢键与螺旋长轴垂直。结构。氢键与螺旋长轴垂直。 （四）（四） - -转角和无规卷曲转角和无规卷曲 - -转角：转角：无规卷曲：没有确定规律性的肽链结构。无规卷曲：没有确定规律性的肽链结构。 肽链内形成肽链内形成180180回折。回折。含含4 4个氨基酸残基，第一个氨基酸残基与个氨基酸残基，第一个氨基酸残基与第四个形成氢键。第四个形成氢键。 第二个氨基酸残基常为第二个氨基酸残基常为ProPro。 - -转角：转角：（五）模体（五）模

21、体蛋白质分子中，二个或三个具有二蛋白质分子中，二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个具有特殊功能的空间构象，被称成一个具有特殊功能的空间构象，被称为模体为模体(motif)。螺旋环螺旋螺旋环螺旋 锌指锌指（六）影响二级结构形成的因素（六）影响二级结构形成的因素氨基酸侧链所带电荷氨基酸侧链所带电荷 、大小及形状。、大小及形状。影响影响-螺旋形成的因素：螺旋形成的因素： -折叠形成条件：折叠形成条件：要求氨基酸侧链较小。要求氨基酸侧链较小。三、蛋白质的三级结构三、蛋白质的三级结构疏水键、离子键、氢键和疏水键、离子键、氢键和 Van der Waa

22、lsVan der Waals力等。力等。 稳定因素：稳定因素：整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。（一）定义（一）定义 肌红蛋白肌红蛋白 (Mb) N 端端 C端端纤连蛋白分子的结构域纤连蛋白分子的结构域 （二）结构域（二）结构域 (domain) 大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行其功能，称为结构域。行其功能，称为结构域。结构域结构域Triose

23、 phosphate isomerase（三）分子伴侣（三）分子伴侣 (chaperon)通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构的一类蛋白质。成天然构象或形成四级结构的一类蛋白质。* * 可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可使肽链正确折叠。如此重复进行可使肽链正确折叠。 * * 与错误聚集的肽段结合，诱导其正确折叠。与错误聚集的肽段结合，诱导其正确折叠。 * * 对蛋白质分子中二硫键的正确形成起重要的作用。对蛋白质分子中二硫键的正确形成起重要的作用。 作用：作用：伴侣蛋白

24、在蛋白质折叠中的作用伴侣蛋白在蛋白质折叠中的作用亚基之间的结合力主要是亚基之间的结合力主要是氢键和离子键。氢键和离子键。四、蛋白质的四级结构四、蛋白质的四级结构蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级蛋白质的四级结构。结构。每条具有完整三级结构的多肽链，称为每条具有完整三级结构的多肽链，称为亚亚基基 (subunit)。血红蛋白（血红蛋白（Hb）的四级结构）的四级结构五、蛋白质的分类五、蛋白质的分类n根据蛋白质组成成分根据蛋白质组成成分:单纯蛋白质单纯蛋白质结合蛋白质结合蛋白质 = = 蛋白质部

25、分蛋白质部分 + + 非蛋白质部分非蛋白质部分n根据蛋白质形状根据蛋白质形状:纤维状蛋白质纤维状蛋白质球状蛋白质球状蛋白质蛋白质结构与功能的关系The Relation of Structure and Function of Protein第第 三三 节节（一）一级结构是空间构象的基础（一）一级结构是空间构象的基础 一、蛋白质一级结构与功能的关系一、蛋白质一级结构与功能的关系 牛核糖核酸酶的牛核糖核酸酶的一级结构一级结构二二硫硫键键 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性尿素、尿素、-巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性（二）一级结构

26、相似的蛋白质具有相似的高级（二）一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能结构与功能胰岛素胰岛素氨基酸残基序号氨基酸残基序号A5A6A10B30人人ThrSerIleThr猪猪ThrSerIleAla狗狗ThrSerIleAla兔兔ThrGlyIleSer牛牛AlaGlyValAla羊羊AlaSerValAla马马ThrSerIleAla（三）（三）氨基酸序列提供重要的生物化学信息氨基酸序列提供重要的生物化学信息一些广泛存在于生一些广泛存在于生物界的蛋白质如细胞色物界的蛋白质如细胞色素素(cytochrome C)，比，比较它们的一级结构，可较它们的一级结构，可以帮助了解物种进化间以帮助了解

27、物种进化间的关系。的关系。 （四）一级结构改变可引起疾病（四）一级结构改变可引起疾病例：镰刀形红细胞贫血例：镰刀形红细胞贫血:Hb:HbN-Val His Leu Thr Pro Glu Glu C(146) HbS 肽链肽链HbA 肽肽 链链N-Val His Leu Thr Pro Val Glu C(146) 这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为称为“分子病分子病”。（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构 二、蛋白质空间结构与功能的关系二、蛋白质空间结构与功能的关系 Hb与与Mb一样能可逆地与一样能可逆地与O2结合，结合，

28、 Hb与与O2结合后称为结合后称为氧合氧合Hb。氧合。氧合Hb占总占总Hb的百分数的百分数（称（称百分饱和度百分饱和度）随）随O2浓度变化而改变。浓度变化而改变。（二）血红蛋白的构象变化与结合氧（二）血红蛋白的构象变化与结合氧 肌红蛋白肌红蛋白(Mb)和血红蛋白和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线的氧解离曲线* 协同效应协同效应(cooperativity) 一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为力的现象，称为协同效应协同效应。 促进作用称为促进作用称为正协同效应正

29、协同效应 (positive cooperativity)抑制作用称为抑制作用称为负协同效应负协同效应(negative cooperativity)O2血红素与氧结血红素与氧结合后，铁原子半径合后，铁原子半径变小，就能进入卟变小，就能进入卟啉环的小孔中，继啉环的小孔中，继而引起肽链位置的而引起肽链位置的变动。变动。变构效应变构效应(allosteric effect)凡蛋白质（或亚基）因与某小分子物质凡蛋白质（或亚基）因与某小分子物质相互作用而发生构象变化，导致蛋白质（或相互作用而发生构象变化，导致蛋白质（或亚基）功能的变化，称为蛋白质的亚基）功能的变化，称为蛋白质的变构效应变构效应。（三）

30、蛋白质构象改变与疾病（三）蛋白质构象改变与疾病 蛋白质构象病蛋白质构象病：若蛋白质的折叠发生错：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。疾病发生。蛋白质构象病的机理：蛋白质构象病的机理：有些蛋白质错误折有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括：这类疾病包括：人纹

31、状体脊髓变性病、老人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。疯牛病疯牛病疯牛病是由朊病毒蛋白疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的正常的PrP富含富含-螺旋，称为螺旋，称为PrPc。PrPc在在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的折叠的PrPsc，从而致病。，从而致病。PrPc-螺旋螺旋PrPsc-折叠折叠正常正常疯牛病疯牛病第四节第四节蛋白质的理化性质与分离纯化The Physical and Chemical

32、 Characters and Separation and Purification of Protein（一）蛋白质的两性电离（一）蛋白质的两性电离 一、理化性质一、理化性质 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 蛋白质的等电点蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为

33、兼性离子，净电正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的荷为零，此时溶液的pH称为称为蛋白质的等电点。蛋白质的等电点。利用蛋白质两性电离的性质，可通过电泳、利用蛋白质两性电离的性质，可通过电泳、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。（二）蛋白质的胶体性质（二）蛋白质的胶体性质 蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至万至100万之巨，其分子的直径可达万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。，为胶粒范围之内。 * 蛋白质胶体稳定的因素蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷颗粒表面电荷水化膜水

34、化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉溶液中蛋白质的聚沉（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固 * 蛋白质的变性蛋白质的变性(denaturation)在某些物理和化学因素作用下，蛋白质分在某些物理和化学因素作用下，蛋白质分子的特定空间构象被破坏，从而导致其理化性子的特定空间构象被破坏，从而导致其理化性质改变

35、和生物活性的丧失。质改变和生物活性的丧失。 造成变性的因素：造成变性的因素：如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等重金属离子及生物碱试剂等 。 变性的本质：变性的本质： 破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。质的一级结构。 应用举例应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。灭菌。防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。（如疫苗等）的必要条件。 蛋白质变性后的性质改变：蛋白质变性后的性质改变：溶解度降

36、低、粘度增加、结晶能力消失、溶解度降低、粘度增加、结晶能力消失、生物活性丧失及易受蛋白酶水解。生物活性丧失及易受蛋白酶水解。若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为象和功能，称为复性复性。复性复性(renaturation) 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性尿素、尿素、-巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性* 蛋白质沉淀蛋白质沉淀在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互

37、缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。但并不变性。 * 蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。 （四）蛋白质的紫外吸收（四）蛋白质的紫外吸收由于蛋白质分子中含由于蛋白质分子中含有共轭双键的有共轭双键的酪氨酸酪氨酸和和色色氨酸氨酸，因此在，因此在280nm波长波长处有特征性吸收峰

38、。蛋白处有特征性吸收峰。蛋白质的质的OD280与其浓度呈正比与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定关系，因此可作蛋白质定量测定。量测定。（五）蛋白质的呈色反应（五）蛋白质的呈色反应茚三酮反应茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的蛋白质经水解后产生的氨基酸氨基酸也可发生茚也可发生茚三酮反应。三酮反应。 双缩脲反应双缩脲反应(biuret reaction)蛋白质和多肽分子中蛋白质和多肽分子中肽键肽键在稀碱溶液中与在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双双缩脲反应缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解，双缩脲反应

39、可用来检测蛋白质水解程度。程度。双缩脲反应双缩脲反应二、蛋白质的分离和纯化二、蛋白质的分离和纯化（一）透析及超滤法（一）透析及超滤法* 透析透析(dialysis)：利用透利用透析袋把大分子蛋白质与小析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。分子化合物分开的方法。* 超滤法：超滤法：应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。目的。（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀 *使用使用丙酮沉淀丙酮沉淀时，必须在时，必须在04低温下进行，低温下进行，丙酮用量一

40、般丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。外，也可用乙醇沉淀。 *盐析盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。沉淀。 *免疫沉淀法：免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应

41、的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。原蛋白。 （三）电泳（三）电泳蛋白质在高于或低于其蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术质的技术, 称为称为电泳电泳(elctrophoresis) 。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。胶电泳等。 几种重要的蛋白质电泳几

42、种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳：常用于蛋白质分子量：常用于蛋白质分子量的测定。的测定。*等电聚焦电泳等电聚焦电泳：通过蛋白质等电点的差异而分离：通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳：双向凝胶电泳：是蛋白质组学研究的重要技术。是蛋白质组学研究的重要技术。（四）层析（四）层析层析层析(chromatography)分离蛋白质的原理分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力

43、等，使待蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。蛋白质分离常用的层析方法蛋白质分离常用的层析方法* 离子交换层析：离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。质不同进行分离。* 凝胶过滤凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析：又称分子筛层析：利利用各蛋白质分子大小不同分离。用各蛋白质分子大小不同分离。（五）超速离心（五）超速离心* 超速离心法超速离心法(ultracentrifugati

44、on)既可以既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。白质的分子量。 *蛋白质在离心场中的行为用蛋白质在离心场中的行为用沉降系数沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示表示,沉沉降系数与蛋白质的密度和形状相关降系数与蛋白质的密度和形状相关 。三、多肽链中氨基酸序列分析三、多肽链中氨基酸序列分析1. 分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成2. 测定多肽链的测定多肽链的N端与端与C端的氨基酸残基端的氨基酸残基3. 把肽链水解成片段，分别进行分析把肽链水解成片段，分别进行分析4. 测定各肽段的氨基

45、酸排列顺序，一般采用测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法降解法5. 经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。基酸顺序的结果。（一）改进的（一）改进的Sanger法法水解肽链的方法及特征水解肽链的方法及特征裂解剂裂解剂裂解位点裂解位点胰蛋白酶胰蛋白酶Lys、Arg（C）胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶Phe、Tyr、Trp（C）弹性蛋白酶弹性蛋白酶Ala、Gly、Ser、Val（C）胃蛋白酶胃蛋白酶Phe、Trp、Tyr（N）溴化氰溴化氰Met（C）羟胺羟胺AsnGly通过核酸推演的方法通过核酸推演的方法按照三联密码的原则推演出氨基酸的

46、序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列分离编码蛋白质的基因分离编码蛋白质的基因测定测定DNA序列序列排列出排列出mRNA序列序列重要内容：重要内容：1、重要名词：、重要名词：protein; peptide bond; GSH; isoelectric point； peptide unit; motifs；domain; subunit； allosteric effect; protein denaturation; molecular disease; 蛋白质的一、二、三、四级结构蛋白质的一、二、三、四级结构2、结构层次、结构层次n元素组成：元素组成：C、H、O、N（16%）、）、Sn

47、结构单位：结构单位：20种种L-氨基酸（芳香族、含硫、酸性、碱性氨基氨基酸（芳香族、含硫、酸性、碱性氨基酸等）酸等） n一级结构：稳定力：肽键；多肽链；一级结构：稳定力：肽键；多肽链；N端端C端；端；n二级结构：稳定力（氢键）；类型（二级结构：稳定力（氢键）；类型（ 螺旋，螺旋， 折叠，折叠， 转角，转角，无规卷曲）无规卷曲）n三级结构特点：稳定力三级结构特点：稳定力n四级结构特点：稳定力四级结构特点：稳定力3、重要性质：、重要性质：两性解离及两性解离及带电状态判定带电状态判定；紫外吸收；沉淀；紫外吸收；沉淀； 变性变性; 显色反应显色反应4、分离纯化：、分离纯化：方法、分类及原理方法、分类及原理 （凝胶过滤层析技术，凝胶过滤层析技术，SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳 技术，双技术，双 向电泳的原理。向电泳的