细胞超微标技术

1、细胞超微标记示踪技术细胞超微标记示踪技术前言前言IF: 12.186 (2011)Chithrani et al. Nano Lett. 2006Dependence of cellular uptake of gold nanoparticles as a function of sizeThe graph of number of gold nanoparticles per vesicle diameter vs nanoparticle sizeChithrani et al. Nano Lett. 2006(B-F) TEM images of gold nanoparticles

2、with sizes 14, 30, 50, 74, and 100 nmtrapped inside vesicles of a HeLa cell, respectively.正常细胞与纳米材料的表面形态正常细胞与纳米材料的表面形态ZnO NPsTiO2 P25controlcontrolZnO NPsZnO NPs附着于胶质细胞表面引起质膜表面囊泡结附着于胶质细胞表面引起质膜表面囊泡结构的产生构的产生ZnO NPs 6hZnO NPs 12hZnO NPs 6hZnO NPs 12h细胞表面囊泡增加ZnO材料与细胞膜发生相互作用TiOTiO2 2 P25 P25导致星形胶质细胞膜表面囊泡

3、的聚集导致星形胶质细胞膜表面囊泡的聚集TiO2 P25 6hTiO2 P25 12hTiO2 P25 6hTiO2 P25 12hTiO2聚集于细胞表面细胞表面大量囊泡结构6 h exposuremicroglia18 h post exposure第一节第一节 超微标记示踪技术的分类和评超微标记示踪技术的分类和评价价 非特异性标记示踪技术非特异性标记示踪技术（一）重金属真溶液标记（一）重金属真溶液标记（二）阳离子染料（二）阳离子染料（三）酶与金属蛋白类（三）酶与金属蛋白类 特异性标记示踪技术特异性标记示踪技术（一）弥散性标记物（一）弥散性标记物（二）颗粒性标记物（二）颗粒性标记物第一节第一节

4、 超微标记示踪技术的分类和评超微标记示踪技术的分类和评价价一、一、 非特异性标记示踪技术非特异性标记示踪技术（一）重金属真溶液标记（一）重金属真溶液标记 如钌红、硝酸镧以及葡萄糖酸亚铁等化合物中的重金属，分子小，电子如钌红、硝酸镧以及葡萄糖酸亚铁等化合物中的重金属，分子小，电子致密度高，所标记的生物标本可以在电镜下观察和研究某种致密度高，所标记的生物标本可以在电镜下观察和研究某种组织、细胞的通组织、细胞的通透性透性。这些重金属盐可以通过细胞连结和缝隙连接的小管，进入细胞间隙和。这些重金属盐可以通过细胞连结和缝隙连接的小管，进入细胞间隙和相邻细胞，但不能进入完整、未受损伤的细胞。相邻细胞，但不能

5、进入完整、未受损伤的细胞。（二）阳离子染料（二）阳离子染料 如阳离子铁蛋白，着染带有负电荷的结构。如阳离子铁蛋白，着染带有负电荷的结构。（三）酶与金属蛋白类（三）酶与金属蛋白类 主要是辣根过氧化物和铁蛋白。前者用辣根过氧化物酶（主要是辣根过氧化物和铁蛋白。前者用辣根过氧化物酶（HRP）注入机）注入机体的细胞、组织或器官，再用体的细胞、组织或器官，再用3.3-氨基联苯胺（氨基联苯胺（DAB）与其进行组织化学反）与其进行组织化学反应而产生显色物质。该产物强嗜锇，因而电镜下也能着色示踪。应而产生显色物质。该产物强嗜锇，因而电镜下也能着色示踪。多用于研究多用于研究小蛋白的追踪、通透性及神经通路小蛋白的

6、追踪、通透性及神经通路。铁蛋白也可用来示踪研究通透性。铁蛋白也可用来示踪研究通透性。 TEOS(CS-COOH)+-+AA-+-KPS+EDCAA-AA-+NH2COOHNH2AA-AA-+-AA-AA-+AA-AA-OHOHFe3O4磁性荧光多功能复合微球制备原理图磁性荧光多功能复合微球制备原理图 Fe3O4纳米粒子的TEM图 Fe3O4 SiO2 的透射电镜TEM图 第二节第二节 铁蛋白标记技术铁蛋白标记技术 亲和细胞化学技术和糖基化铁蛋白技术的应用。亲和细胞化学技术和糖基化铁蛋白技术的应用。亲和细胞化学技术的基本原理是将铁蛋白与生物素交亲和细胞化学技术的基本原理是将铁蛋白与生物素交联，利

7、用生物素对卵白蛋白的高亲和力、以联，利用生物素对卵白蛋白的高亲和力、以生物素生物素卵白蛋白配体（或抗体）卵白蛋白配体（或抗体）为桥，将铁蛋白标记在细为桥，将铁蛋白标记在细胞的特定结构或物质上，以观察细胞超微结构及化学胞的特定结构或物质上，以观察细胞超微结构及化学性质。性质。使用生物素卵白蛋白标记技术的优点是方法灵敏，使用生物素卵白蛋白标记技术的优点是方法灵敏，非特异性低，亲和力极强，可以进行双重或多重标记，非特异性低，亲和力极强，可以进行双重或多重标记，简单方便，可以仅制备保存一种标记卵白素或标记生简单方便，可以仅制备保存一种标记卵白素或标记生物素，而进行多种反应，以显示多种特定的物质结构。物

8、素，而进行多种反应，以显示多种特定的物质结构。第三节第三节 金微粒（胶体金）标记技金微粒（胶体金）标记技术术一、金标记技术的优点：一、金标记技术的优点：1. 胶体金的制备容易、简单、便宜胶体金的制备容易、简单、便宜2. 几乎不出现非特异性吸附、标记几乎不出现非特异性吸附、标记3. 可用不同的试剂和浓度严格控制所需金微粒的大小可用不同的试剂和浓度严格控制所需金微粒的大小4. 能用多种方法定量分析标记到细胞表面的金微粒能用多种方法定量分析标记到细胞表面的金微粒5. 胶体金可以与抗体、多糖、外源凝集素和其他多种蛋白质相连，胶体金可以与抗体、多糖、外源凝集素和其他多种蛋白质相连，生成标记大分子而不影响

9、大分子的生物活性，用途广泛生成标记大分子而不影响大分子的生物活性，用途广泛6. 可用于扫描电镜和可用于扫描电镜和X线衍射分析，这是其他标记物无法比拟的线衍射分析，这是其他标记物无法比拟的二、胶体金的特性、稳定性基标记原理二、胶体金的特性、稳定性基标记原理 胶体金的特性主要取决于胶体金的特性主要取决于金微粒的直径金微粒的直径、吸收光谱吸收光谱及其及其稳定性稳定性。金微粒的大小可以用透射电镜直接测定。金微粒的大小可以用透射电镜直接测定。国际上通国际上通用的标示方法如用的标示方法如WGA-Au5。胶体金是一种疏水胶体，由吸附的周围离子云维持胶体金是一种疏水胶体，由吸附的周围离子云维持胶体的稳定性。胶

10、体金的稳定性取决于胶体粒子的胶体的稳定性。胶体金的稳定性取决于胶体粒子的大小，颗粒越小越稳定，越不容易受电解质的干扰大小，颗粒越小越稳定，越不容易受电解质的干扰而凝聚。而凝聚。目前已有三种稳定金属胶体溶液防止凝聚的方法。目前已有三种稳定金属胶体溶液防止凝聚的方法。（1）胶体颗粒表面吸附表面活性物质（如肥皂）以）胶体颗粒表面吸附表面活性物质（如肥皂）以增加表面电荷密度及潜能。增加表面电荷密度及潜能。（2） 吸附亲水大分子以降低粒子间的吸引力。吸附亲水大分子以降低粒子间的吸引力。（3）吸附高分子多聚体以增加胶体溶液的立体稳定）吸附高分子多聚体以增加胶体溶液的立体稳定性。性。 此外，多糖和其他多聚物

11、也能提高其立体稳定性。此外，多糖和其他多聚物也能提高其立体稳定性。典型样品的透射电子显微镜图 (a) Fe3O4; (b) 氨基化Fe3O4; (c) 胶体金; (d) Fe3O4/Au (15-20 nm)王显祥等，科学通报王显祥等，科学通报. 2009; 54(4):430-435 直径直径1620 nm的胶体金的制备：的胶体金的制备： 用干净非金属药勺和容器称氯金酸用干净非金属药勺和容器称氯金酸50 mg，溶于，溶于500 ml三蒸三蒸水中，制成水中，制成0.01%的氯金酸液，煮沸，快速加入的氯金酸液，煮沸，快速加入1%枸掾酸钠枸掾酸钠12.5 ml，边加边搅拌边加热，至，边加边搅拌边加

12、热，至5 min左右溶液由黄、蓝，变成左右溶液由黄、蓝，变成深红色。冷却后用碳酸钾溶液调深红色。冷却后用碳酸钾溶液调pH。 注意：注意： 玻璃器皿应非常洁净，实际加入的次序要正确，玻璃器皿应非常洁净，实际加入的次序要正确，应用高纯度的去离子水。应用高纯度的去离子水。 注意颜色的变化注意颜色的变化: 电镜下金微粒应为圆球形或椭圆形的电子致密电镜下金微粒应为圆球形或椭圆形的电子致密颗粒，不得有微粒的聚集凝结，而应完全呈现单个分颗粒，不得有微粒的聚集凝结，而应完全呈现单个分散状态。可在无菌或特殊处理情况下保存数月。散状态。可在无菌或特殊处理情况下保存数月。四、金标记物的制备四、金标记物的制备（一）制

13、备大分子（一）制备大分子被标记物中含有无机盐时，会降低胶体颗粒间的排斥电荷，招致胶体凝聚或被标记物中含有无机盐时，会降低胶体颗粒间的排斥电荷，招致胶体凝聚或影响大分子的吸附和标记，为此，需对金标记的大分子进行纯化或透析。影响大分子的吸附和标记，为此，需对金标记的大分子进行纯化或透析。（二）金微粒标记（二）金微粒标记先要测定标记大分子最适宜的标记量、最适宜先要测定标记大分子最适宜的标记量、最适宜pH，以求得最佳的标记效果和，以求得最佳的标记效果和最稳定的金标记物溶液。此外，金和大分子蛋白间的等电点有关，最稳定的金标记物溶液。此外，金和大分子蛋白间的等电点有关，蛋白质与蛋白质与金结合的最佳点是在等

14、电点或稍微偏碱。金结合的最佳点是在等电点或稍微偏碱。若胶体金的若胶体金的pH不合适、胶体金颗粒太大，被标记物质的分子过小、数量过少，不合适、胶体金颗粒太大，被标记物质的分子过小、数量过少，则易引起金粒凝集。则易引起金粒凝集。这时可用小牛血清白蛋白与小肽交联后，在进行金标记。这时可用小牛血清白蛋白与小肽交联后，在进行金标记。五、胶体金标记物的应用和研究五、胶体金标记物的应用和研究（一）光镜中的应用（一）光镜中的应用标记物在光镜下为桔红色。标记物在光镜下为桔红色。金标金标IgG在普通光镜下计数组织、细胞。在普通光镜下计数组织、细胞。应用应用Au-rhodamine ConA-avidin 复合物对

15、同一细胞进行光镜、荧复合物对同一细胞进行光镜、荧光镜、电镜的联合观察。光镜、电镜的联合观察。若标本用金标记染色后再经银染，灵敏度更高。若标本用金标记染色后再经银染，灵敏度更高。 （二）扫描电镜中的应用（二）扫描电镜中的应用这是金标记的优点之一。因金微粒有很强的发射二次电子的能力，这是金标记的优点之一。因金微粒有很强的发射二次电子的能力，故可以扫描电镜观察金标记物在细胞表面的分布。此外，用不同故可以扫描电镜观察金标记物在细胞表面的分布。此外，用不同大小的金微粒，还可进行多重标记。大小的金微粒，还可进行多重标记。 （四）（四） 超薄切片的金标记法超薄切片的金标记法 胶体金是单一均质微粒胶体，可以根

16、据要求制备出不同规格、胶体金是单一均质微粒胶体，可以根据要求制备出不同规格、适合超薄切片的多重标记。适合超薄切片的多重标记。 用金标记超薄切片，需要戊二醛固定标本，环氧树脂包埋。用金标记超薄切片，需要戊二醛固定标本，环氧树脂包埋。 用直接法时，将超薄切片裱到铜网上，或者将铜网漂浮在金标用直接法时，将超薄切片裱到铜网上，或者将铜网漂浮在金标液表面、室温下反应液表面、室温下反应0.53 h，有时金标液中加入少许小牛血清，有时金标液中加入少许小牛血清白蛋白，以进一步减少非特异性吸附。白蛋白，以进一步减少非特异性吸附。 间接法是将带有切片的铜网先与特异性抗血清在室温下孵育间接法是将带有切片的铜网先与特

17、异性抗血清在室温下孵育2 h或或4下下24 h，缓冲液冲洗后再用金标记物室温孵育，缓冲液冲洗后再用金标记物室温孵育10 min2 h，清洗后再用常规电镜处理。，清洗后再用常规电镜处理。 目前有几种间接法：目前有几种间接法：切片先用外源凝集素处理，然后与金标记多糖或糖蛋白孵育，切片先用外源凝集素处理，然后与金标记多糖或糖蛋白孵育，显示外源凝集素多糖或糖蛋白的标记定位。该法较直接法显示外源凝集素多糖或糖蛋白的标记定位。该法较直接法反应强，非特异性吸附少，但较麻烦，每次要制备所用的金反应强，非特异性吸附少，但较麻烦，每次要制备所用的金标溶液。标溶液。金蛋白金蛋白A法。该法根据蛋白法。该法根据蛋白A能

18、特异结合到各种能特异结合到各种IgG的的FC段，段，制备了一种金制备了一种金-蛋白蛋白A标记液，使用各种不同的标记液，使用各种不同的IgG抗血清，抗血清，可显示各种相应的细胞抗原。需选择合适的抗血清滴度或用可显示各种相应的细胞抗原。需选择合适的抗血清滴度或用金标记免疫球蛋白替代金标蛋白金标记免疫球蛋白替代金标蛋白A。根据抗原抗体双价结合原理，可用金标记的抗原检测特异抗根据抗原抗体双价结合原理，可用金标记的抗原检测特异抗体。用微过量的体。用微过量的2价抗体与组织细胞反应，使该价抗体与组织细胞反应，使该2价抗体仅有价抗体仅有一个抗原结合部分与组织抗原结合，剩余的抗原结合部分将一个抗原结合部分与组织

19、抗原结合，剩余的抗原结合部分将与加入的金标抗原结合，显示某种抗原的定位。但有非特异与加入的金标抗原结合，显示某种抗原的定位。但有非特异性吸附。性吸附。（4） 金标记的其他应用金标记的其他应用金标记还可用于测定细胞的凝集性，结合免疫蚀刻研究金标记还可用于测定细胞的凝集性，结合免疫蚀刻研究红细胞表面的抗原立体分布、血管的通透性、神经末梢红细胞表面的抗原立体分布、血管的通透性、神经末梢的选择性结合、摄入和逆向运输、溶酶体和红细胞的的选择性结合、摄入和逆向运输、溶酶体和红细胞的X线微量分析等。线微量分析等。图图 生物膜分子的流动镶嵌模型及冷冻断裂面图解生物膜分子的流动镶嵌模型及冷冻断裂面图解 （5）金

20、标记的定量及其分布）金标记的定量及其分布 测定细胞表面的金标记结构有几种方法：诸如分光光度计，放射测定细胞表面的金标记结构有几种方法：诸如分光光度计，放射测定、测定、X线分析等。线分析等。 由于金微粒特别是由于金微粒特别是2075 nm者，能大量吸收可见光（者，能大量吸收可见光（max 525550 nm），），因此可以用分光光度计测出结合在细胞表面的金因此可以用分光光度计测出结合在细胞表面的金微粒的数量和结合常数。微粒的数量和结合常数。如：红细胞表面可结合如：红细胞表面可结合16,000个大豆凝集素个大豆凝集素-Au17颗粒、结合常颗粒、结合常数为数为5.6x109 mol-1/L；神经氨酸

21、酶处理红细胞后，每个细胞表面；神经氨酸酶处理红细胞后，每个细胞表面的金标记物增加到的金标记物增加到42,000，但结合常数不变。其他几种金标记外，但结合常数不变。其他几种金标记外源凝集素的结合常数大约为源凝集素的结合常数大约为1010 mol-1/L左右。左右。 金微粒数量金微粒数量 金标记物体积金标记物体积应用实例应用实例超顺磁性铁纳米颗粒标记对超顺磁性铁纳米颗粒标记对视网膜前体细胞体外培养的影响视网膜前体细胞体外培养的影响 Chen SY, et al. Int J Ophthalmol. 2008; 8(5): 913-915研究背景研究背景 近年来，视网膜干细胞移植已经成为视神经变性和再生领域研近年来，视网膜干细胞移植已经成为视神经变性和再生领域研究的热点之一，使以往认为无法治疗的理念得以更新究的热点之一，使以往认为无法治疗的理念得以更新 。 但是，干细胞移植人体后，如何从受体辨别供体干细胞，并观但是，干细胞移植人体后，如何从受体辨别供体干细胞，并观察其在体内的迁移变化情况，一直是让人困扰的问题。察其在体内的迁移变化情况，一直是让人困扰的