刘中成重组体的筛选与鉴定

1、重组体克隆的筛选和鉴定重组体克隆的筛选和鉴定转化子和重组子转化子和重组子p转化子：将导入外源转化子：将导入外源DNA分子后能稳定存在分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子的受体细胞称为转化子p重组子：含有重组重组子：含有重组DNA分子的转化子成为重组分子的转化子成为重组子。子。p如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望克隆子克隆子或期望克隆子N在转化反应中，并非所有的细胞都转入重组在转化反应中，并非所有的细胞都转入重组DNA分子，即使所有的受体细胞都变为转化体，分子，即使所有的受体细胞都变为转化体，所获得的转化子仍是多种类型的所获得的转化子仍是

2、多种类型的DNA分子，因分子，因为在连接产物中既有裁体和一个或数个串联目为在连接产物中既有裁体和一个或数个串联目的基因的连接，也有载体的自连，还有目的的基因的连接，也有载体的自连，还有目的DNA分子的自连，更多的是未发生连接反应的分子的自连，更多的是未发生连接反应的载体和目的载体和目的DNA片段。片段。L因此在成千上万个转化子中，真正含有期望的重组DNA分子的比例很少，为了将含有外源DNA的宿主细胞和不含外源DNA宿主细胞分开，以及将含有正确重组子的宿主细胞和含有其他外源DNA的宿主细胞分开。这就需要设计出容易于筛选重组子克隆的方案并加以验证。n阳性克隆的筛选与鉴定可以从不同的层次、利用不同的

3、方法进行。总的来说，重组子的鉴定可以从直接和间接两个方面分析，可以从DNA、RNA和蛋白质三个不同的水平进行鉴定。一、抗药性标记及其插入失活选择法一、抗药性标记及其插入失活选择法pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和和Ampr。 Tetr上有插入位点上有插入位点BamH I和和Sal I; Ampr上有插入位点上有插入位点Pst I。第一节第一节 载体表型选择法载体表型选择法1. 原理：原理：（1）四环素：）四环素：（2）氨苄青霉素抗性基因：）氨苄青霉素抗性基因：2. pBR322抗菌素标记选择抗菌素标记选择含含bla基因的菌体产生基因的菌体产生 -内酰

4、胺酶，使氨苄青内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）（蓝灰色）。抑制细菌生长，但不杀死细菌。抑制细菌生长，但不杀死细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。（3）环丝氨酸：）环丝氨酸：3. 选择过程：选择过程：如果在如果在Tetr上插入外源上插入外源DNA，导致四，导致四环素抗性基因失活，可用环素抗性基因失活，可用四环素加环四环素加环丝氨酸丝氨酸平板培养基选择重组克隆。平板培养基选择重组克隆。JTetr失活失活的菌生长被四环素抑制，不被的菌生长被四环

5、素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；环丝氨酸杀死，保留下来； JTetr不失活不失活的菌抗四环素，能分裂生长，的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。反而被环丝氨酸杀死。（1）四环素抗性插入失活）四环素抗性插入失活无环丝氨酸培养基无环丝氨酸培养基（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程如果如果Ampr上插入外源上插入外源DNA，导致氨苄，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素青霉素指示液选择。指示液选择。二、二、 -半乳糖苷酶显色反应选择法半乳糖苷酶显色反应选择法 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 乳糖乳糖半乳糖半乳糖葡萄糖葡萄糖Xgal半

6、乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛蓝氯靛蓝+深蓝色深蓝色1. 原理：原理：载体载体上有一段上有一段2. 选择过程选择过程Xgal分解成兰色产物。分解成兰色产物。利用插入的外源基因的利用插入的外源基因的表达产物表达产物特性进行直特性进行直接选择。（只在特定条件下）。接选择。（只在特定条件下）。转化进来的外源基因产物能够弥补受转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。体菌株的突变型缺陷。一、原理：一、原理：1.弥补缺陷弥补缺陷his- -his+ +受体菌：受体菌：外源基因：外源基因：在不含组氨酸的在不含组氨酸的培养基中生长培养基中生长小鼠的二氢叶酸还原酶（小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三

7、甲氧）对三甲氧苄二氨嘧啶苄二氨嘧啶(抑制大肠杆菌生长抑制大肠杆菌生长)有抗性。有抗性。DHFR载体载体连接连接转化受转化受体菌体菌三甲氧苄二氨嘧三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板啶培养基平板含含DHFR的克隆才能生长的克隆才能生长例：例：使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。2. 增加新性状增加新性状降解利用有插入片段的重组载体的分子量比利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。野生型载体分子量大。一、直接电泳检测法一、直接电泳检测法从转化后的菌体克隆从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、中分离质粒，电泳、比较其分子量。比较其分子量。第三节第三节 DNA

8、电泳检测法电泳检测法 分子量分子量 Marker载体载体重组克隆重组克隆二、酶切电泳筛选法二、酶切电泳筛选法1. 原理：原理：根据已知的外源根据已知的外源DNA序列的限制性酶切序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。带数和长度）。或用合适的内切酶切下插入片断，再用或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。否符合预计的结果。酶切前酶切前酶切后酶切后插入片断插入片断载体载体不同克隆的酶切结果不同克隆的酶切结果1. 原理原理

9、PCR能在模板序列上扩增出预期能在模板序列上扩增出预期DNA片断。片断。2. 过程过程（1）从重组克隆中提取质粒（或）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。）。（2）用外源）用外源DNA插入片断引物作插入片断引物作PCR。（3）电泳）电泳PCR产物。产物。（4）检查是否有）检查是否有PCR产物。产物。（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。产物的长度是否与外源基因一致。1. 核酸核酸杂交杂交第四节第四节 核酸杂交检测法核酸杂交检测法 一、原理：一、原理：重组克隆与探针杂交。重组克隆与探针杂交。3. 识别标记识别标记32P 或或 125I 。（1）放射性同位素）放射性同位素2. 检测用的探针检测用

10、的探针与外源与外源DNA插入片断互补的序列。插入片断互补的序列。（2）非放射性标记）非放射性标记荧光素荧光素二、核酸杂交检测方法二、核酸杂交检测方法用用DNA（或（或RNA）探针检测）探针检测DNA样品。样品。1. Southern blotting从宿主细胞中提取从宿主细胞中提取DNA（或质粒（或质粒载体），再用探针杂交。载体），再用探针杂交。只有带有插入片断的重组载体才能只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。与探针杂交，在底片上曝光显示。Southern blot 筛选筛选结果结果特点：特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落

11、。可以直接找出阳性菌落。2. Northern blotting用用DNA（或（或RNA）探针检测探针检测RNA样样品。品。主要检测插入片主要检测插入片断是否被转录。断是否被转录。从宿主细胞中提从宿主细胞中提取取RNA，再用探，再用探针杂交。针杂交。利用抗体作为利用抗体作为“探针探针”来检测转入受体菌来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。并且表达出相应的蛋白质的外源基因。根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：的性质可分为几种作用方式：第五节第五节 免疫化学检测法免疫化学检测法 1. 抗体与产物的结合方式抗体与产物的结合

12、方式对表达产物的检测。对表达产物的检测。蛋白蛋白蛋白蛋白“杂交杂交” 待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗二抗二抗125I 标记的二标记的二 抗结合蛋白抗结合蛋白固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗125I标记的二抗标记的二抗固相支固相支持滤膜持滤膜待待测基因测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗固相支固相支持滤膜持滤膜固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗 二抗二抗125I 标记的二抗标记的二抗 结合蛋白结合蛋白125I标记的二抗标记的二抗2. 放射性抗体检测法过程放射性抗体检测法过程质粒基因质粒基因A插入基因插入基因B表达表达质粒蛋

13、白质粒蛋白A 外源蛋白外源蛋白B融合蛋白融合蛋白检测融合蛋白。检测融合蛋白。既检测外源基因产物又检测载体基因产物。既检测外源基因产物又检测载体基因产物。固相支固相支 持滤膜持滤膜抗抗A抗体抗体125I标记的标记的 抗抗B抗体抗体质粒蛋白质粒蛋白A 外源蛋白外源蛋白B质粒蛋白质粒蛋白A外源蛋白外源蛋白B固相支固相支 持滤膜持滤膜抗抗A抗体抗体发光，底片曝光发光，底片曝光把非放射性抗体加到平板培养把非放射性抗体加到平板培养当插当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成周围时，就会与抗体反应形成“沉淀沉淀圈圈”。1. 原理原理抗原抗原抗体凝集反应。

14、抗体凝集反应。检测分泌型产物。检测分泌型产物。2. 方法方法对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。三、酶联免疫吸附测定（三、酶联免疫吸附测定（ELISA）Enzyme-linked immunosorbant assay1. 原理：原理：一抗（一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。与目标分子的特异结合。 二抗（二抗（secondary antibody）：）： 与一抗的特异性结合。与一抗的特异性结合。 酶连（酶连（enzyme-linke）： 二抗上携带

15、一种酶二抗上携带一种酶能催化一种反应将无能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。从而推测目标分子的含量。待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗二抗二抗酶酶 待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗 二抗二抗无色的底物无色的底物有色的产物有色的产物比色观察比色观察酶酶 19在特殊的分光光度仪（在特殊的分光光度仪（酶标仪酶标仪）上比色，打）上比色，打印出结果。印出结果。（5）比色）比色四、免疫印迹（四、免疫印迹（western blot

16、ting）法）法1.1.原理：原理：在蛋白质凝胶电泳以后，用在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫转膜和免疫的方的方法检测胶上的蛋白质泳带。法检测胶上的蛋白质泳带。（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质蛋白质维持线性状态维持线性状态，并与蛋白质，并与蛋白质结合，使蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷带上负电荷。 SDS:（SDS-PAGE）：）： 聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：）：（Polyacrylamide gel electrophoresis）在电场的作用下线性在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰

17、蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极胺凝胶介质中向正极移动，移动，移动的速率主移动的速率主要取决于其分子量大要取决于其分子量大小（链的长短）小（链的长短），从，从而把不同分子量的肽而把不同分子量的肽链分开。链分开。电泳电泳buffer电泳电泳buffer点样点样电泳方向电泳方向蛋白质电泳的分子蛋白质电泳的分子量标准量标准已知分子量的蛋白质已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。白质提供分子量估计。Da道尔顿道尔顿( (质量单位质量单位, , 等于等于一氧原子质量的十六分一氧原子质量的十六分之一。之一。 一克约为一克约为6 6

18、10102323道尔顿道尔顿DaltonSDS PAGE凝胶中的蛋白质染色：凝胶中的蛋白质染色：考马斯亮蓝：考马斯亮蓝： 灵敏度底、只能检出灵敏度底、只能检出0.3-1g/带，但可带，但可褪色回收。褪色回收。 硝酸银：硝酸银： 灵敏度高、可检出灵敏度高、可检出2-5ng/带。带。2）转到膜上进行染色。）转到膜上进行染色。1）直接染色）直接染色直接染色电泳结果直接染色电泳结果（2）Western blotting电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、膜、中性尼龙膜等）。中性尼龙膜等）。 Western（

19、转膜）（转膜）胶里的蛋白质带在电胶里的蛋白质带在电场的作用下场的作用下横向横向转移转移到正极一侧的膜上。到正极一侧的膜上。膜膜胶胶蛋白蛋白Western装置装置 Blotting原理与原理与ELISA相同。相同。待测蛋白待测蛋白硝酸纤硝酸纤 维素膜维素膜一抗一抗 二抗二抗辣根过氧辣根过氧 化物酶化物酶底物底物产物，产物， 并发出光并发出光PAGE胶胶待测蛋白待测蛋白底片曝光底片曝光辣根过氧化物酶：辣根过氧化物酶：HRPO1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。膜上的蛋白结合。2）洗去未结合的一抗。）洗去未结合的一抗。3）用二抗与一抗结合（）用

20、二抗与一抗结合（二抗上带有二抗上带有HRPO）。）。4）清洗掉未结合的二抗。）清洗掉未结合的二抗。5）用）用HRPO的底物浸泡膜。的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，冲洗胶片。）暗室里曝光，冲洗胶片。 Blotting过程过程结果结果多克隆抗体多克隆抗体Blotting的的结果结果单抗单抗blotting结果结果几种常用的几种常用的真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。基。二氢叶酸二氢叶酸四氢叶酸四氢叶酸二氢叶酸还原酶（二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）一、哺乳动物基因转移的选择标记一、哺乳动物基因转移的选择标记1.

21、胸苷激酶（胸苷激酶（thymidine kinase, tk）（1）TK选择原理选择原理四氢叶酸的必要性四氢叶酸的必要性DHFR氨甲喋啉（氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用）的抑制作用氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似物。物。 能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻断断dATP、dCTP和和dTTP的合成：的合成：dUMP dATP TTP dCTP 氨甲喋啉氨甲喋啉 抑制抑制 抑制抑制 胸苷酸激酶胸苷酸激酶的补救作用的补救作用TK+ +细胞细胞能产生胸苷酸激酶，所以可以利能产生胸苷酸激酶，所以可以利用培养基中的胸苷（用培养基中的

22、胸苷（T）合成）合成TTP，存活。，存活。Ttk次黄嘌呤次黄嘌呤的补救作用的补救作用细胞可以利用次黄嘌呤合成细胞可以利用次黄嘌呤合成dATP和和dCTP。dUMP dATP TTP dCTP 次黄嘌呤次黄嘌呤 补救补救 氨甲喋啉氨甲喋啉 抑制抑制 抑制抑制 HAT培养基：培养基：Tk- - 细胞株。细胞株。TK基因。基因。 宿主细胞宿主细胞 载体标记载体标记（2）TK选择过程选择过程含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养基。的培养基。(hypoxanthine，aminopterin，thiymidine）只有转入只有转入TK基因的细胞才能生存。基因的细胞才能生存。20真核

23、细胞核苷酸的合成需要真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸四氢叶酸提提供甲基。供甲基。2. 二氢叶酸还原酶基因（二氢叶酸还原酶基因（DHFR）（1） 选择原理选择原理二氢叶酸还原酶的必要性二氢叶酸还原酶的必要性dUMPdATPTTPdCTP四氢叶酸四氢叶酸四氢叶酸四氢叶酸DHFR+ +细胞细胞二氢叶酸二氢叶酸四氢叶酸四氢叶酸二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸DHFR+ +细胞能产生二氢叶酸还原酶，所细胞能产生二氢叶酸还原酶，所以能合成四氢叶酸。以能合成四氢叶酸。能在能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存的培养基中生存不需要补救！不需要

24、补救！DHFR- - 细胞细胞DHFR- - 细胞不能产生二氢叶酸还原酶，所细胞不能产生二氢叶酸还原酶，所以不能合成四氢叶酸。以不能合成四氢叶酸。需要补救！需要补救！不能在无不能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存。的培养基中生存。 胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救dUMPdATPTTPdATP次黄嘌呤次黄嘌呤补救补救胸苷胸苷补救补救无四氢叶酸提供甲基，无四氢叶酸提供甲基，dNTP合成受阻合成受阻时，时，胸腺嘧啶和次黄嘌呤分别补救胸腺嘧啶和次黄嘌呤分别补救:DHFR- -细胞株（不能在细胞株（不能在无核苷酸无核苷酸的培的培养基中生长）。养基中生长）。 宿主细胞宿主

25、细胞（2）选择过程）选择过程透析除去血清中的内源性核苷酸，以透析除去血清中的内源性核苷酸，以免补救。免补救。 无核苷酸的培养基无核苷酸的培养基需要需要胸腺嘧啶和次黄嘌呤胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救！补救！ 氨甲喋呤氨甲喋呤“加压加压” 添加少量氨甲喋啉抑制添加少量氨甲喋啉抑制内源性内源性DHFR的的补救作用，可提高选择。补救作用，可提高选择。DHFR+ +基因。基因。 载体标记载体标记只有转入只有转入DHFR+ +基因的细胞才能生存。基因的细胞才能生存。DHFR- -DHFR- -DHFR+ +DHFR+ +livedie无核苷酸的培养基无核苷酸的培养基是细菌抗生素，干扰细菌的核糖体，是细菌抗生素，干扰细菌的核糖体，使细菌的蛋白质合成不能正常进行，使细菌的蛋白质合成不能正常进行，但但不影响真核生物不影响真核生物。3. 新霉素抗性基因（新霉素抗性基因（neor）（1）选择原理）选择原理 新霉素（新霉素（neomycin）新霉素的类似物，是一种