生物反应动力学酶促反应

1、会计学1生物反应动力学酶促反应生物反应动力学酶促反应1.1 酶促反应动力学概述酶促反应动力学概述生物生物催化剂催化剂使用方法使用方法游离状态固定化状态酶游离酶固定化酶(微)生物休眠悬浮细胞死亡悬浮细胞固定化休眠细胞固定化死亡细胞 酶是以活力、而不是以质量购销的。 酶有不同的质量等级：工业用酶、食品用酶、医药用酶。 酶在实际应用中应注意，没有必要使用比工艺条件所需纯度更高的酶。 经典酶学研究中研究中，酶活力的测定是在反应的初始短时间内进行的，并且酶浓度、底物浓度较低，且为水溶液，酶学研究的目的是探讨酶促反应的机制。 工业上工业上，为保证酶促反应高效率完成，常需要使用高浓度的酶制剂和底物，且反应要

2、持续较长时间，反应体系多为非均相体系，有时反应是在有机溶剂中进行。1.1.3 酶促反应的特征酶促反应的特征 常温、常压、中性范围（个别除外）下进行反应；常温、常压、中性范围（个别除外）下进行反应； 与一些化学反应相比，省能且效率较高；与一些化学反应相比，省能且效率较高； 专一性好；专一性好； 反应体系较简单，反应过程的最适条件易于控制等反应体系较简单，反应过程的最适条件易于控制等。优点：优点：不足：不足： 多限于一步或几步较简单的生化反应过程；多限于一步或几步较简单的生化反应过程； 一般周期较长。一般周期较长。 对工程技术人员而言，仅用于解释酶促反应的机制是不够的，还应对影响其反应速率的因素进

3、行定量分析，建立可靠的反应速率方程式，为反应器的合理设计合反应过程的最佳条件选择服务。酶促反应速率的影响因素浓度因素：酶浓度、底物浓度、产物浓度、效应物浓度。内部因素(结构因素)：底物或效应物的结构、酶的结构。外部因素(反应环境)：温度、pH、离子强度、溶剂介电常数。1 影响酶促反应速率的因素2 反应方程的建立反应方程的建立式中：CA底物浓度， CB产物浓度。 rmax 最大反应速率maxmaxCrdtdrdtdCBA或BAk13 零级反应零级反应)(C)(0101BABBAACCkdtdCCkdtdC或式中：k1一级反应速率常数 CA0底物A的初始浓度 CBt时刻产物B的浓度BAk1反应速率

4、与底物浓度一次方成正比。DBAk2式中：k2二级反应速率常数 CA0，CB0底物A和B的初始浓度 CDt时产物D的浓度tkCCCCCCCCdtkdCCCCCCCdtkdCCCCCDBADABBADDBDABADDBDA200000020000200)()(ln)(1)11()(1)(1)(002DBDADCCCCkdtdC积分DBAkk21A的初始浓度CA0，B、D的初始浓度为0，且CA+CB+CD=CA0式中：k1、k2反应速率常数 CA、CB、CDA、B、D的浓度AACkdtdC1BABCkCkdtdC21BDCkdtdC2tkAAeCC10)(211201tktkABeekkCkC)1

5、()1 (2112120tktkADekekkkCC【例2-1】 卵状假单胞菌在分批式反应中先将葡萄糖转变为葡萄糖内脂，再转化为葡萄糖酸，此反应为一级反应，反应式如下：求中间产物（葡萄糖内脂）浓度达到最大时所需时间tmax及其最大浓度值CLmax，已知反应常数k1和k2分别为0.87/h和0.7/h。CG0(初始G浓度)38mg/mlPLGkk 21葡萄糖内脂葡萄糖葡萄糖酸解：当L物达到最大值时PLGkk 21tkGGGGeCCCkdtdC101)(21120121tktkGLLGLeekkCkCCkCkdtdCt=0： CG0 0 0 t=t： CG CL CP 0dtdCL)(28. 17

6、 . 087. 0)7 . 087. 0ln(lnln)(11)(2121212121212)()(21212021012121211hkkkktkktkkkkkkkeekkkeekkCkkeCktkktkktktkGtkG)/(5 .15)(7 . 087. 03887. 028. 17 . 028. 187. 0maxLgeeCLPSE 其反应机理可以认为是：首先是底物其反应机理可以认为是：首先是底物S和酶和酶E相结相结合形成中间复合物合形成中间复合物ES，然后该复合物分解成产，然后该复合物分解成产物物P，并释放出酶，并释放出酶E。即有：。即有： S+EES P+E 上述反应的速率可表示为

7、：式中：rs底物S的消耗速率，mol/(LS) rp产物P的生成速率，mol/(LS) v反应体系的体积，L ns ，np分别为底物S和产物P的物质的量，mol Cs ，Cp分别为底物S和产物P的浓度，mol /L t时间，sPEkESkkSE 211dtdCdtdnvrsss1dtdCdtdnvrppp1根据质量作用定律，P的生成速率可表示为：2ESpCkr 对于上述反应，我们假设：（1）反应过程中，酶浓度保持恒定，即 （2）与底物浓度Cs相比，酶的浓度是很小的，因而可忽 略由于生成中间复合物ES而消耗的底物。 （3）产物的抑制作用可以忽略。 ESEP0ESEECCC有两种推导反应速率方程的

8、方法：平衡假设法平衡假设法和拟稳态假设法拟稳态假设法。平衡假设：平衡假设：1913年，年， Michaelis-Menten认为酶催化反应历程中，生成产物一步的反应速率要慢于底物S和酶形成中间复合物的可逆反应速率，因此生成产物一步的反应速率决定整个酶催化反应的速率，生成复合物的可逆反应则达到平衡状态。121kkkESESEP 1.2.2.1 平衡假设法平衡假设法Michaelis-Menten方程方程SESSSESECCKCkCkC11SSESESSESSECKCCCCKC10SSSEESKCCCC0SSSPSSSEESpKCCrKCCCkCkrrmax,022k+1CECS= k-1CESC

9、E0=CE+CES 最后一式即为M-M方程。 M-M方程是一个两参数方程。当从中间复合物生成产物P的速率与其分解成酶和底物的速率相当时，M-M方程不适用。1.2.2.2 Briggs-Haldane 方程 当从中间复合物生成产物的速率与其分解成酶与底物的速率相差不大时，米氏方程的平衡假设不适用。1925年，Briggs-Haldane提出了拟稳态假设：即中间复合物的浓度不再随中间复合物的浓度不再随时间而变化时间而变化，即：0dtdCES这就是“拟稳态”假设。这是从反应机理推导动力学方程又一重要假设。根据反应机理和拟稳态假设，有下述方程式：2ESpCkdtdC11ESSESCkCCkdtdC02

10、11ESESSEESCkCkCCkdtdCCE0=CE+CES0121EESSESCCCkkkC SmSPSSEESPCKCrkkkCCCkCkrrmax,1210221210kkkCCCCSSEESSmSPCKCrrmax,该方程中引入了两个参数：121kkkKmrP,max=k+2CE0rP,max P的最大生成速率,mol/L.s最后一式即为B-H方程。项目项目 M-M方程方程 B-H方程方程 假设假设1.酶和底物生成不稳定复合物ES，酶催化反应是经该中间复合物完成的： 即 2.ES在反应开始后与E及S迅速达到动态平衡： 2.ES的生成速率与解离速率相等，浓度不随时间而变化 3.底物浓度

11、远高于酶的浓度。 酶量守恒酶量守恒 产物生成速率产物生成速率 动力学方程动力学方程 Ks与与Km 0dtdCESECCs 0ESEECCCCsKCsrrpmpmax,PEkESkkSE 21111kkKs2ESpCkr11kkKs121kkkKmCsKsCsrrppmax,M-M方程与方程与B-H方程比较方程比较在具体应用时，人们亦将B-H方程称为M-M方程。一律表示为: mSSPKCCrrmax,上述B-H方程好M-M方程推导中，都假设CE0CS0，因而CES值也很小，如果酶的浓度较高时，CES值在反应过程中有可能很高，如果按上述的简化处理会带来误差，此时，物料平衡和速率方程可表示为： 12

12、1kkkESESEP CE0=CE+CESCS0=CS+CES+CP10001)(ESPESESESCkCCCCCkdtdC210001)()(ESPESESEESCkkCCCCCkdtdC2ESpCkdtdC对此方程组一般得不到解析解，对此方程组一般得不到解析解，只能得到数值解。只能得到数值解。 1.2.3 米氏方程米氏方程动力学特征动力学特征当CS,Km接近时，呈混合级反应，则符合M-M关系。当CSKm时，smpSmSPCKrCKCrrmax,max,一级反应。当CSKm时，rrp,max 零级反应。Km和和rmax的意义的意义 当r=rmax/2时，Km=CS。因此，Km等于酶促反应速度

13、达最大值一半时的底物浓度。 当k-1k+2时，Km=k-1/k+1=Ks。因此，Km可以反映酶与底物亲和力的大小，即Km值越小，则酶与底物的亲和力越大；反之，则越小。 Km可用于判断反应级数：当CS 100Km时，r=rmax，反应为零级反应，即反应速度与底物浓度无关；当0.01Km CS 100Km时，反应处于零级反应和一级反应之间，为混合级反应。 Km和和rmax的意义的意义 Km可用来判断酶的最适底物：当酶有几种不同的底物存在时，Km值最小者，为该酶的最适底物。 Km是酶的特征性常数：在一定条件下，某种酶的Km值是恒定的，因而可以通过测定不同酶（特别是一组同工酶）的Km值，来判断是否为不

14、同的酶。 Km可用来确定酶活性测定时所需的底物浓度：当CS =10Km时，r=91% rmax，为最合适的测定酶活性所需的底物浓度。 rmax可用于酶的转换数的计算：当酶的总浓度和最大速度已知时，可计算出酶的转换数，即单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。 例例2-2 有一均相酶催化反应，Km值为210-3mol/L，当底物的初始浓度CS0为110-5mol/L时，若反应进行1min，则有2的底物转化为产物。试求出：(1) 当反应进行3min，底物转化为产物的百分数是多少? 此时底物和产物的浓度分别是多少?(2) 当CS0为110-6mol/L时，也反应了3min，底物和产物的浓度又

15、是多少?(3) 最大反应速率rmax值为多少?解： (1) 根据题意，CS00.01Km，此时一般认为可按一级反应处理。其动力学方程可表示为： KttKrCCmSSmax0ln因为 已知t=1min时,Xs=0.02所以 CS=CS0(1-XS)=110-5(1-0.02)=0.9810-5mol/L 将已知数据带入上式中，求得 K=0.0202min-1 当t=3min时，可以求得 CS=0.9410-5mol/L，XS=6%，CP=610-7mol/L(2) CS0=110-6mol/L时，仍可视为一级反应，所以当t=3min时，同样可以求得Xs=6%，CS=0.9410-6mol/L，C

16、P=610-8mol/L(3) 根据K=rmax/Km=0.0202 min-1得rmax=KKm=4.0410-5mol/(Lmin)【例例2-3】某酶催化反应，其Km=0.01mol/l 。为了求其最大反应速率rmax值，现通过实验测得该反应进行到5min时，底物已转化了10%，已知CS0=3.410-4mol/l,并假定该反应可用M-M方程表示。试求： （1）最大反应速率rmax为多少？ （2）反应15min后，底物浓度为多少？ trCCKCSSmSmax0S0ln C 可得：rmax=2.7210-4代入t=15min， 可知 CS=2.3410-4解： dtdCCKCrrSSmSPm

17、ax,将数据代入积分得 1.2.4 1.2.4 动力学常数的计算动力学常数的计算要建立一个完善的动力学方程，必须用动力学实验确定其动力学参数。对M-M方程，就要确定rmax=k+2CE0和Km 值，由于M-M方程为一非线性方程，无法直接通过作图法求取。为此要对方程进行线性化处理。不同的线性化处理方法，就是不同的参数求取方法。使用时依据所得数据选择适宜的方法。下面介绍几种常用的方法。将将M-M方程取其倒方程取其倒 数得到下式：数得到下式：以1/rs对1/Cs作图得一直线见图，该直线斜率为Km /rmax， 直线与纵轴交于1 /rmax ，与横轴交于-1 /Km ，此法又称双倒 数图解法。smsC

18、rKrr111maxmax1.2.4.1 Lineweaver-Burk法（简称法（简称L-B法），法），以Cs/rs对Cs作图，得一斜率为1/rmax的直线，直线与纵轴交点 为Km/rmax,与横轴交点为-Km。maxmaxrCrKrCsmss1.2.4.2 Hanes-Woolf法（简称法（简称H-W法法)smsCrKrr111maxmax将式两边均乘以将式两边均乘以Cs得得:以rs对rs/Cs作图，得一斜率为-Km的直线，与纵轴交 点为rmax，与横轴交点rmax/Km。ssmsCrKrrmax1.2.4.3 Eadie-Hofstee法法(简称简称E-H法法)。将M-M方程重排为：SS

19、SSPSSSSKCCtKrCCCC1ln0max,00【例例2-4】在常温下利用蔗糖酶水解蔗糖，蔗糖初始浓度CS01.0mmol/L，酶的初始浓度CE0=0.01mmol/L，在实验室反应器内进行分批式操作，测定如下表中前两行的数据。 试确定可否用米氏方程来描述该反应速率，若可以，求km和k+2t/h1234567891011CSmmol/L0.840.680.530.380.270.160.090.040.0180.0060.0051.0901.2051.3511.5611.7942.1822.6463.3534.0915.1476.0066.2506.2506.3836.4526.8497

20、.1437.6928.3339.16510.0611.028SSCCt0SSSSCCCC00)/ln(解：首先将米氏方程转换为：SSmSSESsCkCkKCCCkdtdCr21021其中：积分得：tCCkkCCCCSSSSSS01200)/ln(mEKCkk021mKk12SCCCCSSS00)/ln(由已知数据计算和SSCCt0结果画图，若方程与数据符合，应为直线。其斜率k1=k+2/Km，k2=-1/Km。由图可以看出，已知数据可以用米氏方程来描述该反应。直线斜率等于1，截距等于-5.08，即Km=0.197mmol/L，k+2=19.7/h实际酶促反应中，往往关心反应时间与底物转化率的关

21、系。00SStSsCCCx当t=0时，CS=CS0SmSSCKCrdtdCmaxdtrdCCKSSmmax) 1(dtrdCCKSSmmax) 1(StSOmStSOCCKCCtrln)(maxStSOmStSOCCKCCtrln)(maxsSsmxrCxrKtmax0max11ln【例2-5】将底物和酶加入到分批式反应器中，经反应，底物转化率为90%，空时为多少？已知反应速率方程式为：SmSESCKCCdtdC0310酶浓度为0.001mol/L，底物浓度为2mol/L。空时：底物在反应器中停留时间。空时：底物在反应器中停留时间。空速：空时的倒数，又称稀释率。空速：空时的倒数，又称稀释率。d

22、tdCCCCSSSE)1(10103dtdCCCSSS1解：dtdCCCSSS1StSOStSOCCCCtln)(当底物转化率为90%时，min1 . 42 . 02ln)2 . 02(t实际情况： 底物浓度过高反使反应速率下降； 由于外源化合物的存在，使得反应速率下降； 有些反应，当产物浓度达到一定值后会使反应速率下降。这些情况就是所谓的抑制作用。这些情况就是所谓的抑制作用。不可逆抑制不可逆抑制：如果抑制剂与酶的基团成共价结合，则此时不能用物理方法去掉抑制剂。此类抑制可使酶永久性地失活。例如：重金属离子对木瓜蛋白酶的抑制作用。可逆抑制：可逆抑制： 可用诸如透析等物理方法把抑制剂去掉而恢复酶的

23、活性，此时酶与抑制剂的结合存在着解离平衡的关系。包括：竞争性抑制，非竞争性抑制，反竞争性竞争性抑制，非竞争性抑制，反竞争性抑制，混合型抑制，底物抑制和产物抑制抑制，混合型抑制，底物抑制和产物抑制。抑制抑制作用作用抑制剂对酶促反应速率的影响抑制剂对酶促反应速率的影响若在反应体系中存在有与底物结构相类似的物质，该物质也能在酶的活性部位上结合，从而阻碍了酶与底物的结合，使酶催化底物的反应速率下降。这种抑制称为竞争性抑制，该物质称为竞争性抑制剂。1.3.1 竞争性抑制动力学竞争性抑制动力学 抑制剂与底物竞争酶的活性部位，当抑制剂与酶的活性部位结合之后，底物就不能再与酶结合，反之亦然。 在琥珀酸脱氢酶催

24、化琥珀酸为延胡索酸时，丙二酸是其竞争性抑制剂。 竞争性抑制主要特点：竞争性抑制主要特点： 竞争性抑制EIS竞争性抑制反应机理：PEESSEkkk211EIIEkk33ESCkr20211ESESSEESCkCkCCkdtdC033EIIEEICkCCkdtdCEIESEECCCC0SIImSCKCKCrr)/1 (max02maxECkr121kkkKm式中:33kkKISIImSCKCKCrr)/1 (max)/1 (IImmKCKKSmSCKCrrmax令可变形为可变形为: : mmKK KI抑制剂的解离常数 （mol/l）Km有竞争性抑制时的米氏常数（mol/l）竞争性抑制动力学的主要特

25、点：竞争性抑制的Cs-r关系图SmsCrKrr111maxmax竞争性抑制的双倒数方程式竞争性抑制的L-B图33kkKI抑制剂的解离常数由此可看出，KI愈小，表明抑制剂与酶的结合力愈强，对酶催化反应能力的抑制作用就越强。IImmIImmCKKKKCKK1以Km对CI作图，据此图可求出Km和KI值 310MCS1.251.000.750.50r0(任意单位sI(任意单位)83.972.458.841.9MKm31091. 0MKI31076. 2264maxr31053. 2mK若抑制剂可以在酶的活性部位以外与酶相结合，并且这种结合与底物的结合没有竞争关系，这种抑制称为

26、非竞争性抑制。1.3. 2 非竞争性抑制动力学非竞争性抑制动力学 抑制剂既可与游离的酶相结合，也可以与复合物ES相结合，生成了底物底物酶酶抑制抑制剂剂的复合物SEI。 绝大多数的情况是复合物SEI为一无催化活性的端点复合物，不能分解为产物，即使增大底物的浓度也不能解除抑制剂的影响。 还有一种是三元复合物SEI也能分解为产物，但对酶的催化反应速率仍然产生了抑制作用。 如核苷对霉菌酸性磷酸酯酶的抑制属于非竞争性抑制。非竞争性抑制特点非竞争性抑制特点非竞争性抑制ESIEIIEkk33PEESSEkkk211SEIIESkk44SEISEIkk55ESCkr20dtdCdtdCdtdCSEIEIESE

27、SIEIESEECCCCC0解方程组，得解方程组，得式中式中: :)(/1 (maxSmIISCKKCCrr02maxECkr)(/1 (maxSmIISCKKCCrrIIKCrr/1maxmaxSmSCKCrrmax可变形为可变形为: : 令maxmaxrrIIKC1SmCrKrr111maxmaxSCr11与根据LB作图法，上式可整理成IIIICKrrrKCrmaxmaxmaxmax1111又根据式可通过实验测得不同CI下的rmax，进而确定KI值。 非竞争性抑制与竞争性抑制的主要不同点非竞争性抑制与竞争性抑制的主要不同点：反竞争性抑制的特点是抑制剂不能直接与游离酶相结合，而只能与复合物E

28、S相结合生成SEI复合物。 1.3. 3 反竞争性抑制动力学反竞争性抑制动力学PEESSEkkk211SEIIESkk33SmISIIISmSSICKCrKCCKCrrmax,max1IIIKCrr1maxmax,IImmIKCKK1mmIIKrKrmaxmax,据拟稳态假设和物料平衡，经整理后可得其速率方程为式中：IISmSIKCrCrKr1111maxmaxmaxrKmIIKCr11maxmIIKKC1直线斜率为与纵坐标交点为与横坐标交点为在不同的CI浓度下得一系列平行线。线形混合型的最简单机制可表示为：1.3.4 线性混合型抑制动力学线性混合型抑制动力学PEESSEkKS2EIIEIKS

29、EISEISKSEIIESIKSKIK11kkKS33kkKISmISISICKCrrmax,上式中：根据上述机理式，可推出其速率方程为IIIKCrr1maxmax,IIIImmIKCKCKK111IIKK对此种抑制，式中 为KS和KI的修正系数。当 ， 时，上述抑制实为非竞争性抑制。 444545max1021031051107 . 4102102 . 21SIImSSICKCKCrrmin/1054.136Lmol454445max102107 . 41031051102102 . 21SmIISSICKKCCrr61068. 6（2）对非竞争性抑制，可列出下式 mol/Lmin 6454

30、4max108 .17102107 . 4102102 . 2SmSSCKCrr（3）求抑制程度当无抑制剂存在时的反应速率为mol/Lmin24. 0108 .171054.131166SSIrri625. 0108 .171068. 6166i所以上述两种抑制的抑制程度应分别为 竞争性抑制非竞争性抑制1.3. 5 产物抑制产物抑制PEESSEkkk211反应机理： 其中EP为无活性的端点复合物EPPEkk33ESCkr2EPESEECCCC00211ESESSEESCkCkCCkdtdC033EPPEEPCkCCkdtdCSPPmSCKCKCrr)/1 (max02maxECkr121kkk

31、Km式中式中: :33kkKP称为产物抑制解离常数。与无抑制相比较，最大反应速率值rmax不变，米氏常数增大了 倍，同竞争性抑制一样，使反应速率下降。PPKC11.3.6 1.3.6 底物抑制底物抑制PEESSEkkk211ESSSESkk33ESCkr2SESSEKkkCCC11SSESSSESKkkCCC33ESSESEECCCC0)/1 (maxSSSSSSKCCKCrr02maxECkr11kkKS式中式中: :11kkKSSKSS为底物抑制的解离常数mol/l当底物抑制时，r与CS的关系表示在图中。max,rCoptS0maxOPtSCSdCdrSSSoptSKKCoptSC1.4 影响酶催化反应的因素影响酶催化反应的因素内部因素内部因素：包括酶的结构特性和底物的结构特性。 外部因素：外部因素：包括各种物质的浓度因素（例如酶的浓度、底物和产物的浓度、抑制剂的浓度等）和操作条件(如：温度、压力、离子强度、pH值等）。 内部因素是由反应体系所决定的，这不是本门课程讨论的内容。本节重点讨论对酶催化反应速率最明显的两个因素，即 PH值和温度。对酶促反应的影响有两方面的的义：(1) 酶稳定性的影响(2) 对酶活性的影响1.4.1 pH的影响的影响 酶分子上有许多酸性和碱性的氨基酸侧链基团，如果酶 要表示其活性，则这些基团必须有一定的解离