荧光定量相关

1、 Real Time PCR Real Time PCR 的用途及原理的用途及原理 Real Time PCR Real Time PCR 检测方法检测方法 Real Time PCR Real Time PCR 检测系统检测系统激激发发光光发发射射光光CtCt值值使用使用Real Time PCRReal Time PCR扩增装置实时监测扩增装置实时监测PCRPCR扩增产物并进行分析的方法。扩增产物并进行分析的方法。Real Time PCRReal Time PCR同一个样品重复同一个样品重复9696次次PCRPCR的扩增曲线的扩增曲线 CtCt值值 Real Time PCR Real

2、Time PCR扩增过程中，每个反应管内的扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 ( C-( C-代表代表CycleCycle，t-t-代表代表thresholdthreshold） CtCt值概念值概念阈值：在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上阈值：在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上 设定的荧光检出界限。设定的荧光检出界限。在在PCRPCR反应体系中加入荧光物质，并实时监测荧光信号积累的整个反应体系中加入荧光物质，并实时监测荧光信号积累的整个PCRPCR进程，进程，最后通过已知浓度的标准品制作的标准曲线对未知浓度的样品进行

3、定量分析。最后通过已知浓度的标准品制作的标准曲线对未知浓度的样品进行定量分析。 Real Time PCR Real Time PCR 的用途及原理的用途及原理 Real Time PCR Real Time PCR 检测方法检测方法 Real Time PCR Real Time PCR 检测系统检测系统 荧光染料嵌合法荧光染料嵌合法(SYBR Green I)(SYBR Green I) 荧光探针法荧光探针法 TaqManTaqMan probe probe Cycling probe Cycling probe Molecular Beacon probeMolecular Beacon

4、 probe Hybridization probe Hybridization probe Scorpions probe Scorpions probe Amplifluor Amplifluor probe probe SYBR Green I SYBR Green I是一种结合于所有是一种结合于所有dsDNAdsDNA双螺双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。 TaqMan TaqMan探针为一寡核苷酸，探针为一寡核苷酸， 55端标记一个报告荧光基团端标记一个报告荧光基团(Reporter)(Reporter)， 33端标记一个淬灭荧光基团端标记一

5、个淬灭荧光基团(Quencher)(Quencher)。 TaqManTaqMan Probe Probe 法作用机理示意图法作用机理示意图 Cycling probe Cycling probe为一寡核苷酸，为一寡核苷酸，55端标记一个荧光端标记一个荧光报告基团报告基团(Reporter)(Reporter)，33端标记一个荧光淬灭基端标记一个荧光淬灭基团团(Quencher)(Quencher)，寡核苷酸为，寡核苷酸为DNA/RNADNA/RNA杂合体。杂合体。 QR核糖核苷酸核糖核苷酸SYBR Green I法法vs Probe法法 SYBR Green I 法法 优点：价格便宜、使用方

6、便、优点：价格便宜、使用方便、无需合成特异性探针无需合成特异性探针。缺点：引物缺点：引物要求高（要求特异性扩增）、不能进行多重要求高（要求特异性扩增）、不能进行多重PCRPCR。 Probe法法优点：优点：特异性强，能进行多重特异性强，能进行多重PCRPCR。缺点：缺点：需要设计特异性探针，成本高、有时设计困难需要设计特异性探针，成本高、有时设计困难。以前对以前对PCR引物的选择、引物的选择、PCR试剂的优化试剂的优化经验不足，经验不足，Probe法较为广用。法较为广用。但是但是使用使用SYBR Green I 进行检测的问题点进行检测的问题点SYBR Green ISYBR Green I与

7、双链与双链DNADNA进行结合后散发荧光，因此如果反进行结合后散发荧光，因此如果反 应体系中有非特异性扩增，非特异性应体系中有非特异性扩增，非特异性DNADNA也将同时被检测，也将同时被检测， 从而可能导致检测结果不准确。从而可能导致检测结果不准确。Primer Primer DimerDimer的产生的产生 二条引物的二条引物的33端具有互补序列时，引物自身也会进行扩增，端具有互补序列时，引物自身也会进行扩增， 产生短链产生短链DNADNA片段（片段（Primer DimerPrimer Dimer）。）。3 3 5 5 5 5 3 3 GATCCTAGGATCCTAG使用使用 SYBR Green I 进行定量进行定量 PCR 的的 Key Poin