疟原虫镜检技术 (2)

1、江苏省寄生虫病防治研究所江苏省寄生虫病防治研究所 顾亚萍顾亚萍疟原虫镜检技术疟原虫镜检技术l疟原虫的基本形态特征疟原虫的基本形态特征l血片制作与染色血片制作与染色l疟原虫计数疟原虫计数l显微镜的维护与保养显微镜的维护与保养 疟疾是由蚊子传播的寄生虫病，它的病疟疾是由蚊子传播的寄生虫病，它的病原体是疟原虫。原体是疟原虫。 寄生于人体的疟原虫有寄生于人体的疟原虫有4 4 种种疟原虫基本结构疟原虫基本结构n疟原虫基本构造为疟原虫基本构造为核、细胞质（胞浆）和疟核、细胞质（胞浆）和疟色素。色素。n原虫经原虫经姬氏姬氏GiemsaGiemsa或瑞氏或瑞氏WrightWright染色：染色： 核核呈呈红色

2、红色, ,胞质胞质呈呈兰色兰色，疟色素疟色素为本色为本色胞浆胞浆疟色素疟色素核核疟原虫基本结构疟原虫基本结构2.2.细胞浆细胞浆 蓝色或深蓝色，随着虫体发育长大，蓝色或深蓝色，随着虫体发育长大，细胞浆逐渐增多。细胞浆逐渐增多。疟原虫基本结构疟原虫基本结构胞胞浆浆疟原虫基本结构疟原虫基本结构n不着色，颜色和颗粒的形状，因疟原虫种类而不着色，颜色和颗粒的形状，因疟原虫种类而异，疟色素在虫体内散在分布或聚集成团块。异，疟色素在虫体内散在分布或聚集成团块。n间日疟原虫呈短棒状，黄褐色；间日疟原虫呈短棒状，黄褐色；n恶性疟原虫呈细砂状，黑褐色；恶性疟原虫呈细砂状，黑褐色；n三日疟原虫呈砂粒状，深褐色；三

3、日疟原虫呈砂粒状，深褐色；n卵形疟原虫与间日疟原虫相似。卵形疟原虫与间日疟原虫相似。3.3.疟色素疟色素疟色素疟色素滋养体期：滋养体期：早期、晚期滋养体早期、晚期滋养体裂殖体期：裂殖体期：未成熟、成熟裂殖体未成熟、成熟裂殖体配子体期：配子体期：雌、雄配子体雌、雄配子体疟原虫在疟原虫在RBCRBC内内各期形态各期形态各不相同各不相同疟原虫在红细胞内按照生长发育繁殖的阶段不同疟原虫在红细胞内按照生长发育繁殖的阶段不同疟原虫基本结构疟原虫基本结构红细胞不涨大红细胞不涨大1 1个个RBCRBC内内2 2个以上原虫个以上原虫常见，环状体内可有常见，环状体内可有2 2个核个核 环状体可贴在红细胞环状体可贴

4、在红细胞边缘边缘 血片中除血片中除R R、G G外没有外没有其他发育期其他发育期配子体呈新月形或腊配子体呈新月形或腊肠形肠形成熟裂殖体约含成熟裂殖体约含16-3216-32个裂殖子，排列不规个裂殖子，排列不规则则可出现茂氏点可出现茂氏点恶性疟（恶性疟（P.falciparumP.falciparum） 鉴定要点鉴定要点红细胞通常涨大红细胞通常涨大 薛氏点明显薛氏点明显 环状体较粗大环状体较粗大滋养体胞浆有阿米巴样滋养体胞浆有阿米巴样伪足伪足血片中可见各期的原虫血片中可见各期的原虫形态形态成熟裂殖体约含成熟裂殖体约含12-2412-24个裂殖子，排列不规则个裂殖子，排列不规则 间日疟（间日疟（P

5、. vivax P. vivax ） 鉴定要点鉴定要点红细胞不涨大或略红细胞不涨大或略小小环状体环状体中等大小，中等大小，核较大，胞浆粗厚核较大，胞浆粗厚胞浆不活跃呈带状胞浆不活跃呈带状形形 成熟裂殖体呈菊花成熟裂殖体呈菊花状状, ,内含内含6-126-12个裂殖个裂殖子子 5. 雌雄配子体小于雌雄配子体小于 正正 常常 红细胞，疟色红细胞，疟色 素呈深褐色素呈深褐色 6. 常可查见各阶段常可查见各阶段 的疟原虫的疟原虫三日疟（三日疟（P.malariaeP.malariae） 诊断要点诊断要点卵形疟（卵形疟（P. ovaleP. ovale） 诊断要点诊断要点红细胞略涨大或正红细胞略涨大或正

6、常，卵圆形或边缘常，卵圆形或边缘呈锯齿状呈锯齿状环状体中等大小，环状体中等大小，核较大，胞浆粗厚核较大，胞浆粗厚薛氏点出现较早粗薛氏点出现较早粗大，量多大，量多成熟裂殖体约含成熟裂殖体约含6-6-1212个裂殖子个裂殖子 5. 5. 常可查见各阶段的常可查见各阶段的 疟原虫疟原虫 被寄生的红细胞被寄生的红细胞 间日疟原虫间日疟原虫 大小大小 斑点斑点胀大胀大 滋养体期开始滋养体期开始出现薛氏点出现薛氏点( (Schuffners dots )，出现，出现稍晚，鲜红色，稍晚，鲜红色，细小数多细小数多 恶性疟原虫恶性疟原虫正常或略缩小正常或略缩小 常见有茂氏点常见有茂氏点(Maurers dots

7、) ，紫褐，紫褐色，粗大数少色，粗大数少 三日疟原虫三日疟原虫正常或缩小正常或缩小 常见有齐氏点常见有齐氏点(Ziemanns dots )，淡红，淡红色，微细色，微细卵形疟原虫卵形疟原虫略大或正常略大或正常感染红细胞感染红细胞边缘呈距齿边缘呈距齿状状常见有薛氏常见有薛氏点点,出现较早，出现较早，环状体阶段环状体阶段可见，可见，红色，微粗红色，微粗疟原虫基本结构疟原虫基本结构 寄生的红细胞寄生的红细胞: : 经染色后，因细胞内血红蛋经染色后，因细胞内血红蛋白溶解，轮廓消失，但有时尚留下残骸的白溶解，轮廓消失，但有时尚留下残骸的“影影子子”或点彩。或点彩。 厚血膜由于用血量多，血膜小，细胞重迭，

8、厚血膜由于用血量多，血膜小，细胞重迭，干燥缓慢，各期疟原虫的体积都略为缩小，其干燥缓慢，各期疟原虫的体积都略为缩小，其中大、小滋养体的形态有较大改变，裂殖体和中大、小滋养体的形态有较大改变，裂殖体和配子体的形态则变化不大。配子体的形态则变化不大。厚血膜中疟原虫的形态厚血膜中疟原虫的形态：厚血膜恶性疟原虫恶性疟原虫厚血膜RingsGametocytes间日疟原虫间日疟原虫 厚血膜厚血膜环状体环状体配子体配子体滋养体滋养体裂殖体裂殖体 由于在血膜制备过程中由于在血膜制备过程中红细胞溶解，红细胞溶解，因而其因而其原形态消失原形态消失，且染液和玻片上可能存在，且染液和玻片上可能存在杂质杂质等，等，要根

9、据疟原虫的三个基本要素仔细要根据疟原虫的三个基本要素仔细加以鉴别。加以鉴别。n（1)1)疑似疟色素疑似疟色素n（2 2）疑似疟原虫核）疑似疟原虫核n（3）疑似疟原虫胞浆）疑似疟原虫胞浆疟原虫与其他异物的鉴别疟原虫与其他异物的鉴别（4）血液成份与分析）血液成份与分析（5）杂质）杂质-类似疟原虫的物质类似疟原虫的物质（6） 形态失常形态失常 疟原虫成份丢失。疟原虫成份丢失。 成份增加。成份增加。 形态改变。形态改变。 药物影响。药物影响。 血片的制作与染色血片的制作与染色 n载玻片的清洗：载玻片的清洗：n新玻片的清洗方法新玻片的清洗方法 用加有洗洁精或洗用加有洗洁精或洗衣粉的热水洗涤，浸于衣粉的热

10、水洗涤，浸于95% 95% 的乙醇中的乙醇中1 1小时以上小时以上n已用过的玻片：已用过的玻片：用加有洗衣粉的热水洗用加有洗衣粉的热水洗涤，浸于涤，浸于95% 95% 的乙醇中的乙醇中1 1小时以上小时以上 载玻片载玻片 每张载玻片上分别做每张载玻片上分别做1 1个薄血膜，个薄血膜，1 1个厚血个厚血膜。标准血膜的位置如下图所示。膜。标准血膜的位置如下图所示。血片制作血片制作 取血液取血液4-5l4-5l 血滴置于载片的中央偏血滴置于载片的中央偏右右1/31/3， 由里向外划圈涂成直径为由里向外划圈涂成直径为0.8-10.8-1厘米厘米 厚薄均匀、圆形厚血膜厚薄均匀、圆形厚血膜. .血片制作血

11、片制作厚血膜的涂制：厚血膜的涂制：标准的推片姿势标准的推片姿势薄血膜的涂制：薄血膜的涂制：取血液取血液1-1.5l1-1.5l血滴置于载玻片的血滴置于载玻片的中央中央，将推片的一端置于血滴之前，当血液在载玻将推片的一端置于血滴之前，当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至片与推片之间向两侧扩展至约约2cm2cm宽宽时，两时，两玻片保持玻片保持20-3020-30角，角，推成舌状薄血膜，推成舌状薄血膜，长约长约2-2.5CM2-2.5CM。血片制作血片制作血片染色血片染色两种染色方法两种染色方法: :n吉氏染色法吉氏染色法n瑞氏染色法瑞氏染色法n常用吉氏染色法常用吉氏染色法血片的染色血片的染色n待血

12、片待血片完全干燥完全干燥后才可染色后才可染色n1 1血膜的固定血膜的固定-甲醇甲醇 吉氏染液：染色方法吉氏染液：染色方法薄血膜经甲醇固定干燥后，用薄血膜经甲醇固定干燥后，用PH7.0-PH7.0-7.27.2的磷酸缓冲液或蒸馏水将吉氏原液的磷酸缓冲液或蒸馏水将吉氏原液稀释，稀释，原液与缓冲液为原液与缓冲液为1:201:20。混匀混匀染色染色20-3020-30分钟分钟，晾干镜检。晾干镜检。厚血膜溶血染色厚血膜溶血染色 放置多时未染色的血片（放置多时未染色的血片（2 2天以上，薄天以上，薄片已用甲醇固定），在染色之前，须在片已用甲醇固定），在染色之前，须在厚血膜上用清水进行溶血，待血膜全部厚血膜

13、上用清水进行溶血，待血膜全部溶解后倒掉，用吉氏染液染色溶解后倒掉，用吉氏染液染色, ,清水漂清水漂洗干净洗干净, ,晾干。晾干。n 染色用水和冲洗用水染色用水和冲洗用水npH7.0pH7.0pH7.2pH7.2缓冲蒸馏水效果最佳缓冲蒸馏水效果最佳。n先制备好两种贮备液先制备好两种贮备液n贮备液贮备液I 1/15MI 1/15M磷酸氢二钠（磷酸氢二钠（NaNa2 2HPOHPO4 4）溶液）溶液 n NaNa2 2HPOHPO4 4 9.5 g9.5 gn 蒸馏水蒸馏水 1000 ml1000 mln贮备液贮备液 1/15M 1/15M磷酸二氢钾磷酸二氢钾 （KHKH2 2POPO4 4 ）溶液

14、）溶液 n KHKH2 2POPO4 4 9.07 g 9.07 gn 蒸馏水蒸馏水 1000 ml1000 mln缓冲蒸馏水配制缓冲蒸馏水配制nPH M/15 NaPH M/15 Na2 2HPOHPO4 4 M/15 KH M/15 KH2 2POPO4 4 DW DW n (ml) ( ml) (ml)n7.0 63 37 900n7.1 68 32 900n7.2 73 27 900n缓冲蒸馏水宜用时缓冲蒸馏水宜用时新鲜配制新鲜配制为好。为好。血片制作注意事项血片制作注意事项（1 1）在制作血片前，首先要核对患者的）在制作血片前，首先要核对患者的 姓名、年龄和住址姓名、年龄和住址（2

15、2）载玻片必须清洁无油污，理想的薄）载玻片必须清洁无油污，理想的薄 血膜是一层血细胞均匀分布不重血膜是一层血细胞均匀分布不重 叠和空泡，血膜末端呈舌状。叠和空泡，血膜末端呈舌状。（3 3）厚血膜厚度以一个油镜视野内可见厚血膜厚度以一个油镜视野内可见5-5-1010个白细胞为宜。个白细胞为宜。（4 4）制成的血片在未干前不能倾斜放置，制成的血片在未干前不能倾斜放置，待其自然干燥，不要加热，加热会使原虫待其自然干燥，不要加热，加热会使原虫变形，影响镜检结果变形，影响镜检结果血片制作注意事项血片制作注意事项（1 1）染料溶剂的质量）染料溶剂的质量 （2）染液的新旧）染液的新旧（3）染液稀释后使用时间

16、）染液稀释后使用时间原液必须临用时稀释，随配随用。原液必须临用时稀释，随配随用。（4）染液的稀释浓度）染液的稀释浓度（5）染色时间）染色时间 (6) 染色稀释用水染色稀释用水:Ph7.0-7.2 染色质量影响因素染色质量影响因素n（7 7）血膜在制备后应尽量能在当天）血膜在制备后应尽量能在当天染色，染色，一般夏天不超过一般夏天不超过4848小时，冬天小时，冬天也不能超过也不能超过7272小时小时。n新制新制血片染色时厚血膜血片染色时厚血膜无需溶血无需溶血n放置多时的血片放置多时的血片，在染色之前先用清，在染色之前先用清水滴加在水滴加在厚血膜上进行溶血厚血膜上进行溶血. .疟原虫密度计算疟原虫密

17、度计算疟原虫密度计算疟原虫密度计算 计算疟原虫密度的三种方法：计算疟原虫密度的三种方法： 白细胞原虫密度计数法白细胞原虫密度计数法 ( (厚血膜厚血膜 WHO)WHO) 半定量计数法半定量计数法 ( (厚血膜厚血膜) ) 红细胞感染密度计算法红细胞感染密度计算法( (薄血膜薄血膜) )白细胞原虫密度计数法白细胞原虫密度计数法n镜检厚血膜，按视野顺序，记录镜检厚血膜，按视野顺序，记录200200个白细胞中的个白细胞中的疟原虫数，如果原虫密度较低，可增加白细胞，疟原虫数，如果原虫密度较低，可增加白细胞，计数计数500-1000 500-1000 个。个。n密度单位密度单位: :原虫数原虫数/l/l

18、n计算公式：疟原虫数计算公式：疟原虫数 计数的白细胞数计数的白细胞数 患患者每微升血白细胞数者每微升血白细胞数 = = 疟原虫数疟原虫数/l/l血。血。n如果不知患者的白细胞数，则每微升血以如果不知患者的白细胞数，则每微升血以80008000个个白细胞计数白细胞计数( (国际标准国际标准) ) 。疟原虫密度计算疟原虫密度计算厚血膜的疟原虫计数厚血膜的疟原虫计数n从血膜的左上角开始，横向。从血膜的左上角开始，横向。n计数计数1 1个视野后，每次间隔个视野后，每次间隔5 5个视野个视野, ,再计数再计数。厚血膜厚血膜疟原虫密度计算疟原虫密度计算用厚血膜每个视野中所观察到疟原虫的平均数粗略地用厚血膜

19、每个视野中所观察到疟原虫的平均数粗略地估计出疟原虫密度。这种方法简便，缺点是计数的疟估计出疟原虫密度。这种方法简便，缺点是计数的疟原虫数受血膜厚薄影响，只能定性，不宜作定量分析。原虫数受血膜厚薄影响，只能定性，不宜作定量分析。此方法将密度分为此方法将密度分为6 6级：级：1.1.全厚血膜查见疟原虫数在全厚血膜查见疟原虫数在1010个以内，记录实际数字个以内，记录实际数字2.2.全厚血膜查见疟原虫数在全厚血膜查见疟原虫数在1010个以上，但平均每个视个以上，但平均每个视野不到野不到1 1个虫，记录个虫，记录“少少”3.3.平均每个视野平均每个视野1-51-5个虫，记录个虫，记录“”4.4.平均每

20、个视野平均每个视野6-106-10个虫，记录个虫，记录“+”5. 5. 平均每个视野平均每个视野11-10011-100个虫，记录个虫，记录“+ + ”6. 6. 平均每个视野平均每个视野100100个虫以上，记录个虫以上，记录“+ + ”。如：如：Pv R+T+GPv R+T+G少少半定量计数法半定量计数法疟原虫密度计算疟原虫密度计算红细胞疟原虫密度按以下公式计算：红细胞疟原虫密度按以下公式计算：1.1.红细胞疟原虫感染率（红细胞疟原虫感染率（% %）计算）计算 红细胞原虫感染率（红细胞原虫感染率（% %）= = 疟原虫数疟原虫数 计数计数的红细胞数的红细胞数X 100 X 100 2.2.

21、红细胞疟原虫感染密度计算红细胞疟原虫感染密度计算 红细胞疟原虫密度红细胞疟原虫密度= =红细胞原虫感染率红细胞原虫感染率X X红细胞红细胞数数/ /每微升血每微升血 （男性（男性500500万个万个/l/l；女性；女性450450万个万个/l/l） 红细胞疟原虫感染密度计算（薄血膜）红细胞疟原虫感染密度计算（薄血膜）疟原虫密度计算疟原虫密度计算显微镜的使用与维护显微镜的使用与维护1.1.学习镜检疟原虫之前，必须熟悉显微镜学习镜检疟原虫之前，必须熟悉显微镜的基本构造，使用方法和维修与保养。防的基本构造，使用方法和维修与保养。防止油镜进灰、进油和发霉。止油镜进灰、进油和发霉。2.2.疟原虫的厚薄血片都必须在疟原虫的厚薄血片都必须在油镜油镜下观察下观察，显微镜用光要充足。包括显微镜用光要充足。包括反光镜、光圈、反光镜、光圈、聚光器聚光器要达到油镜使用的最佳限度。要达到油镜使用的最佳限度。显微镜检查注意事项显微镜检查注意事项n3. 玻片未加油时观察标本应按：玻片未加油时观察标本应按：低低倍倍高倍高倍油镜油镜程序。如在加油区程序。如在加油区内重找目标应按照：内重