超现代实验技术离心技术

1、超速离心技术超速离心技术是利用物质的沉降系数、浮力、质量等方面的差异，利用强大的离心力场，使样品中的混合物得以分离、浓缩、纯化和鉴定的技术。离心技术现在已经成为分子生物学和生物化学研究中不可缺少的一项重要技术。离心技术可分为制备型和分析型两类。在生物学领域可以利用这种方法，分离提取各种细胞及其亚细胞物质，如细胞膜、细胞核、染色体、线粒体、叶绿体、溶酶体、核蛋白体等。也可以鉴定蛋白质、酶及核酸的纯度。处理的样品可多可少，少至0.2mL以下。离心技术的范围相当广泛。目前，利用这种技术分离各种亚细胞物质、酶、病毒、质粒及各种核酸。因此，为分子生物学、生物化学和医学的发展，提供了有利的手段。自从192

2、6年瑞典物理学家Svedberg制成世界上第一台超速离心机（45000转/分）到现在已有快80年的历史，在这期间，离心机的发展是非常迅速的。特别是在50年代以后发展的更快，例如，美国贝克曼（Beckman）公司和杜邦苏凡尔（Dupont Sorvall）公司，英国测量科学设备公司（MSE），日本的日立（HITACHI）公司以及德国的海吕斯（Heraeus）公司，都生产出各种离心机产品，如普通离心机、高速离心机和超速离心机。从简单的低速高容量的制备离心机到用于精密分析的超速离心机，应有尽有。美国贝克（Beckman）公司的超速离心机居世界领先地位，采用了大规模集成电路，计算机程序控制，分离-检测

3、，全部实现自动化；最高转速可达13多万转/分钟，并配有各种型号的垂直转头、水平转头、固定角转头、区带转头、连续转头等，供用户选用，不但操作简单、节省时间，而且进一步提高了的分离效率。此外，离心技术也有了很大的发展，有密度梯度离心技术和区带离心技术，为生物大分子的分离、纯化和鉴定提供了优越的手段。虽然离心机的种类有多种，离心技术也多种多样，但是它们的工作原理基本相似。在实际工作中用的最多的还是制备型离心。本课程主要介绍制备型分离技术。一、离心原理离心技术是根据物质在离心力场中不同的行为来分离物质的。任何物体，当它做圆周运动时，都要经受一个向外的离心力（F）。离心力的大小，取决于离心转头的角速度（

4、w，单位弧度/秒），和物质颗粒距离心轴的距离（r，单位厘米）。因此，离心力与角速度和距离的关系用方程式F=w2r表示。（一）离心力离心力（F）常用地心引力来表示。这时它指的是相对离心力（relative centrifugal force, RCF）。RCF又常以重力常数（g, 980厘米/秒2）的倍数来表示，所以：为了使用方便，须用离心机的转数（即转数/分，以rpm表示，即revolutions per minute）来表达这个系数，可将弧度变成转速：因此从上式可知，只要知道离心机的rpm有离心管中某物质颗粒到离心转轴的中心垂直距离r，就能够计算这个颗粒所受的离心力。例如，一个离心转头，最大

5、半径为9cm，转速为18000转/分，求离心转头最大离心力和最大相对离心力。r = 9 cmw = 2p18000rpm = 2 ´ 3.1416 ´ 18000 转/60秒 = 185 秒-1 最大离心力 = w2r = （1885秒-1）2 ´ 9厘米 = 31979025 厘米/秒2即相当于重力的32632倍，在这种条件下离心，样品沉降速度比重力场要大32632倍。通常，超速离心时，用g来表示，在低速离心时，则用rpm表示。为了知道转速（rpm）、旋转半径（r）离心管液柱中间到旋转轴中心的距离和离心力（单位为g）的关系，根据上面的方程式，Dole 和 Cot

6、zias 制作了与转头速度和半径相对应的RCF的列线图（表1-1）。（二）沉降系数在离心力场作用下，物质颗粒以一定的速度向离心管底部移动，这个移动的速度可用下公式表示：v 为沉降速度。沉降速度与离心力场成正比，这一比例常数就是沉降系数。用S表示。所谓沉降系数，就是在单位离心力场中颗粒沉降的速度。S的单位是秒，因为许多生物大分子的S值很小，所以定义10-13秒为一个沉降系数的单位。为了纪念超离心分析的创始入Svedberg，就把10-13秒这个数量级定为一个Svedberg单位，用S表示。为了使沉降系数只表示样品本身的物理量，所以又规定了在20°C的纯水中所测得样品的沉降系数，并用S2

7、0,w表示，右下角的20表示温度，w表示纯水。由于许多生物大分子的沉降系数表现了浓度的依赖性，所以用浓度接近零的外推值来表示生物大分子的沉降系数，即S020,w，右上角的零表示浓度为零。例如，溶菌酶的沉降系数为2.15´10-13秒，通常就叫做2.15S。过氧化氢酶的沉降系数为11.35´10-13秒，就称11.35S。大肠杆菌核蛋白体是70S，它是由两个亚基组成的，用超速离心方法测其沉降系数，分别为30S和50S。当我们还不知道它们的结构时，也只好暂时以30S和50S命名，来区别它们。蛋白质的沉降系数，一般在1200之间。表1-1 计算离心力的列线图为了从半径和转头速度来

8、计算相对离心力，先以外侧标尺上的半径和转头速度的值连成直线。这一直线与中间标尺上的交点数值，就是相对离心力。我们知道，沉降系数，是一个特定的物理量。因此，S020,w是一个常数（constant）。从沉降系数的定义可以看出，它只在标准化条件下才是一个常数。但实际情况往往变化很大。因此在实际应用中，常把标准条件下的沉降系数（S020,w）换算成实际条件下沉降系数，才能正确运用。因为实际测量时，所用的条件大不相同，所以常常将在某种条件下测定的沉降系数加以修正。利用这个公式进行运算以后，可以把任何条件下所测定的S值，变成以20°C的水的密度和粘度为介质时，得到的S值。S020,w 为以水为

9、介质时，20°C所测得的沉降系数。St,m 为在t温度下，以m为介质时，所得的沉降系数。h20,w 为20°C水的粘度。ht,m 为介质在离心温度下的粘度。rp 为颗粒的密度。rt,m 为介质的密度。r20,w 为20°C水的密度。沉降系数可用下更公式求得：式中w 是角速度。t为时间（秒），变化着的时间用时间的微分dt表示。r是颗粒运动的距离，指运动颗粒到离心转轴中心的距离（厘米）。设单位时间内某颗粒自r1运动到r2，则上式得积分得若用rpm计算，则w =（rpm）´ 2p/60，再将自然对数改为常用对数，则上式可写为：式中2.303/60w2与rpm的

10、换算可从表2-1中查出，式中的d log r/ dt可用log r 对t 作图求得。表2-1 w2与2.303/60w2 换算关系转速（rpm）w22.303/60w2转速（rpm）w22.303/60w216974.241´1049.050´10-7125901.738´1062.208´10-820974.811´1047.978´10-7134101.971´1061.947´10-822335.466´1047.022´10-7142902.238´1061.705´

11、10-823786.119´1046.192´10-7152202.539´1061.512´10-825317.022´1045.466´10-7162002.877´1061.334´10-856957.962´1044.821´10-7172503.262´1061.177´10-828068.649´1044.438´10-7179803.544´1061.083´10-829949.826´1043.906´

12、;10-7191604.024´1069.539´10-931891.115´1053.442´10-7204104.566´1068.406´10-933971.265´1053.034´10-7217405.181´1067.408´10-936171.434´1052.677´10-7231505.875´1066.533´10-938481.623´1052.365´10-7246406.650´1065.772

13、80;10-940591.806´1052.125´10-7259807.399´1065.188´10-943272.052´1051.871´10-7276908.405´1064.567´10-946092.329´1051.648´10-7295009.540´1064.023´10-949082.641´1051.453´10-7314101.082´1073.547´10-952272.995´1051.282&#

14、180;10-7334501.227´1073.128´10-955633.392´1051.132´10-7356001.389´1072.763´10-957843.662´1051.048´10-7370201.502´1072.555´10-961664.168´1059.209´10-8394601.707´1072.249´10-965694.730´1058.115´10-8420401.937´1071.982

15、´10-969955.364´1057.156´10-8447702.197´1071.747´10-974473.079´1056.314´10-8476602.490´1071.541´10-979286.890´1055.571´10-8507402.822´1071.360´10-982257.416´1055.176´10-8526403.038´1071.263´10-987668.424´1054.55

16、6´10-8561003.450´1071.113´10-993419.565´1054.013´10-8597803.918´1079.797´10-1099451.084´1053.541´10-8636504.440´1078.643´10-10105891.229´1063.123´10-8677705.035´1077.623´10-10112721.393´1062.755´10-8721405.705´

17、1076.728´10-10表2-2 某些生物样品的沉降系数、相对离心力和转速的一般范围样品沉降系数（S）RCF（g）转速（rpm）细胞>107<200<1500细胞核4´104-107600-8003000线粒体2-7´10470007000微粒体50-10410万30000DNA10-12010万30000RNA4-5040万60000蛋白质2-25>40万>60000有了沉降系数，可以计算分子量。因为沉降系数与物质的分子量有如下的关系：式中：M为物质的分子量。 D20,w 是物质颗粒在20°C水中的扩散系数。 T 是对

18、绝对温度。 R 是气体常数，等于1.987卡/度×克分子。 S20,w 是沉降系数。 r 是溶剂的密度。n- 是偏微比容，等于物质颗粒密度的倒数。用这个公式计算分子量的方法，俗称SD法。表2-3 几种蛋白质的沉降系数和分子量样品分子量沉降系数核糖核酸酶136831.64卵清蛋白450003.55血清白蛋白650004.31血红蛋白680004.54过氧化氢酶25000011.30尿素酶48000018.60二、离心方法 超离心技术分离生物大分子和亚细胞物质有两种方法，即沉降速度法和沉降平衡法。 在离心过程中，颗粒在均匀的介质中移动，常受到振动、温差和对流的干扰。因此，要利用密度梯度来

19、消除和减轻这种现象。许多物质可以形成密度梯度，如蔗糖、甘油、NaI、CsCl、Cs2SO4等，都可以形成一个从离心管顶端到底部逐步增加的平滑的密度梯度。 沉降速度法，主要是根据各种被分离物质的沉降系数的不同来分离物质。注意，梯度中最大的密度要小于样品中最小颗粒的密度。 沉降平衡法，主要是根据被分离物质的密度不同来分离物质。注意，梯度中最大的密度要大于样品中最大颗粒的密度。 在沉降速度法中，有差速离心法和区带离心法。（一） 差速离心法这种方法是逐步增加离心力的方法。先选择适当的离心力，使大颗粒物质沉淀，从而得到一个上清液，一个沉淀。然后进行分离，弃去沉淀，增加离心力，进一步离心上清液，使中等颗粒

20、沉淀，最后使小颗粒物质沉淀。差速离心法，常用于从组织匀浆中分离细胞器。例如：在0.25M 蔗糖中的10%（w/v）的肝匀浆 ¯ 1000g ，离心10分钟 粗制细胞核沉淀¬-® 上清液 ¯ 3300g，离心10分钟粗制线粒体沉淀¬-® 上清液¯ 16300g，离心20分钟粗制溶酶体沉淀¬-® 上清液¯ 100000g，离心60分钟粗制微粒体沉淀¬-® 上清液图3-1 大白鼠肝脏匀浆分级分离成各种亚细胞组分的示意图解 这种离心的方法，每次离心只能分离出一种物质，而且得率和纯度都

21、受到一定的限制。（二） 区带离心法又叫速度一区带离心法或沉降系数一区带离心法。它是将样品放在一个连续的密度梯度液体上。这个密度梯度的最大值应该小于样品中的最小密度值。这个密度梯度只是为了防止形成的区带由于对流而引起的混乱，然后进行离心。直到各种颗粒。在密度梯度中形成不连续的区带。但是要注意，在重的组分到达管底之前，必须停止离心。 这种方法已用于分离RNA、DNA的混合物、核蛋白体亚单位和其他细胞成分，它适用于分离密度相同而大小不同的物质。 一般来说，蛋白质的密度相同，但分子量有差别，用这种方法很容易将它们分开。但是不能很好地分离一些密度不同而大小类似的物质。如线粒体，溶酶体，过氧化氯酶系等。因

22、此，必须采用沉降平衡法。区带离心法对于凡是沉降系数相差20%的组分可以有效的分离。一次可以分离几个样品，而且回收率和纯度都能达到百分之百。但是每次处理的样品量不能太大。（三）沉淀平衡法这种方法主要是从密度梯度离心技术发展起来的一种方法。又叫等密度离心法（Isopycnic gradient centrifugation）。它是入为的在离心管中造成一个连续的密度梯度。而且密度梯度柱的梯度很大，使底部的溶液密度明显的大于样品组分的密度。也就是说，这个密度梯度包括了所要研究的所有颗粒密度范围。将样品放在顶部或将样品均匀的分散在密度梯度柱中，然后进行离心。样品在离心管中运动，样品中密度大于周围溶液密度

23、的组分向下沉降，而样品中密度小于溶液密度的组分将向上浮起。这两种运动一直延续到所有组分都到达某一平衡位置，在这个位置上组分的密度正好等于周围的溶液密度，组分形成一平衡区带，即使再离心，区带的位置也不会再有变化了。各个组分区带停留在与自己相同的密度中，所以也叫做等密度梯度离心。它们所用的密度范围较大。梯度密度的最大值，必须比密度最大的样品还要大。为了使样品所有组分都能达到它们的平衡密度，需要长时间高速离心。这种方法适用于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。因为大多数蛋白质几乎具有相同的密度。所以，分离蛋白质不采用此法，而分离核酸常采用此法。 在1958年，利用等密度梯度离心技术，直接的证明了DN

24、A双螺旋结构的自我复制。 密度梯度离心技术已广泛地应用于细胞、细胞器、病毒、核酸、蛋白质的物理化学性质的研究。是这些生物材料分离纯化不可缺少的方法之一。 等密度梯度离心法，只要密度相差0.05即可用此方提纯。如果用分析超离心检测，可以分辨密度差为0.001的组分，而且一次分离。但平衡离心时间很长，一般在十几到几十小时。 总之，沉降速度法是一种动力学的方法。关键是选择适合的离心力；而沉降平衡法是静力学的方法，重要的是选择适合的密度梯度溶液。（四）密度梯度的制备及离心后的处理 在离心技术中，密度梯度有两种，连续的密度梯度和不连续的密度梯度或者叫做分层的密度梯度，是将密度不同的溶液一层一层的放在离心

25、管中。如下图所示，密度最大的放在最下层，密度小的放在上边，要分离的样品放在最上面，然后进行离心。这个密度梯度的优点，可允许增加梯度的容量，而且可入为地将被分离物质分布得更加集中。 连续的密度梯度是通过一种特殊的密度梯度混合仪，来制备不同的密度梯度，然后将样品放在上面进行离心。表3-1中给出了一些蔗糖溶液的特性。表3-1 蔗糖水溶液的密度及粘度密度浓度粘度0°20°%g/gMM0°5°20°1.0001.791.521.0051.0101.0082.490.0730.0751.901.601.061.0201.0174.920.1460.1512

26、.041.721.131.0301.0277.320.2200.2312.211.861.221.0401.0379.680.2930.3132.412.021.311.0501.04712.010.3670.3992.642.221.431.0601.05614.310.4410.4882.912.441.551.0701.06616.570.5160.5803.232.701.701.0801.07618.800.5910.6763.572.971.851.0901.08520.990.6660.7763.973.292.031.1001.09823.150.7410.8804.453.6

27、72.241.1101.10525.280.8160.9885.004.112.481.1201.11527.370.8911.1015.674.632.761.1301.12429.440.9671.2196.455.253.091.1401.13431.471.0431.3427.385.983.471.0501.14433.481.1191.4708.506.853.921.1601.15435.451.1951.6059.887.914.451.1701.16337.401.2711.74611.69.205.091.0801.17339.331.3481.89413.710.85.8

28、61.1901.18341.231.4252.05016.412.86.801.2001.19343.111.5022.21419.815.37.941.2101.20244.971.5802.38724.218.59.361.2201.21246.801.6572.57029.922.611.11.2301.22248.611.7352.76337.327.913.31.2401.23250.401.8142.96947.234.916.11.2501.24252.171.8923.18760.644.219.71.2601.25153.921.9713.41978.956.824.41.2

29、701.26155.652.0513.66610574.030.61.2801.27157.372.1303.93114198.339.01.2901.28159.062.2104.21419513350.31.3001.29160.742.2904.51927518466.11.3101.30162.392.3714.84740026188.51.3201.31064.042.4525.2025973801211.3301.32065.662.5335.58689185701691.3401.33067.272.6146.00414708802421.3501.34068.862.6966.

30、41624401410357浓度以每100克溶液中克数、体积克分子浓度M及重量克分子浓度M表示，粘度以对纯溶剂的hrel表示。 密度梯度混合仪有两种装置：简易装置和自动装置。 1. 简易梯度混合仪（图5-4）：它由二个具有相同半径的有机玻璃圆柱形成的小室组成，底部通过一个带有控制活塞的管子，使内部连接起来，这个活塞能调节两个圆柱小室中的溶液混合。一个装密度大的溶液，一个装密度小的溶液。装密度大的溶液的小室内有搅拌器，并有一个通向离心管的出口。开始时，两个小室中的溶液高度被调到静压力相等。然后开动搅拌器，同时打开控制活塞，并使密度大的溶液流入离心管。流入离心管的出口，要紧贴离心管管壁，随着液体的

31、注入，将小管流出口向上慢慢移动，直至最后。注意，混合时注入离心管的流速要慢，一般装入一支5mL出510%蔗糖梯度的离心管，应在 1015分钟内完成。 2. 自动梯度混合器：DGF-U型密梯度混合器。此装置可同时制成16支梯度管，又能在离心后自动分层分部地把各物质取出。整机剖面图如图所示。它是由蠕动泵、分配器、升降器、液面探测针等部件组成。整个装置由控制板上的选择器旋钮来控制仪器的运转和导管的升降，由蠕动泵控制流速在05mL/分之间。操作时，先将配制好的轻、重溶液分别装于两个直径相同的 30100mL的小烧杯中。如果同时制备6支梯度离心管，每支要求有5mL梯度液，则总量应是30mL。此时应将 l

32、5mL轻溶液和 l5mL重溶液分别装在两个小烧杯中。装有重溶液的烧杯应放在带有搅伴器一侧的导管下面，装有轻溶液的烧杯放在另一侧的导管下面。 DGF-U型密度梯度混合器的工作原理如图所示。当蠕动泵旋转时，经溶液沿着轻溶液导管上升，经虹吸臂均分为二，分别流入装有轻、重溶液的两个烧杯中。此时，轻溶液的浓度末变，重溶液则因轻溶液的逐渐加入浓度不断被稀释，又因重溶液中附有搅伴装置，使其浓度能均匀地直线下降。改变着浓度的重溶液，由同一蠕动泵送入分配器，把溶液均匀地分配给 6支离心管。如果只制备1或3支梯度管时，由于分配器上附有活塞，只需关闭分配器的5或3个导管，同时降低流速即可实现。在连接第l号离心管的导

33、管上附有液面探测针。它能把离心管中液面上升(或下降)的信号输送给升降器，使其指挥插入6支离心管中的6支导管，同时随液面的升降而升降，并时刻准确的计量离心管中制成梯度液的体积(升降器附有标尺供读数用)，将在达到额定体积时自动停机。以上制成的密度梯度，自管底到管口，是直线递减的线性。 此外，还有一些物质不需要用预先制成的梯度。如氯化铯（CsCl），硫酸铯 (Cs2SO4)所配制的均匀溶液注入离心管中，在足够时间的离心过程中，铯盐在离心力场内沉降，可以自动形成一个连续的稳定的密度梯度。原则是选择铯盐的浓度，使它处在待分离的生物大分子的密度范围之内。这样就可以将样品和铯盐溶液均匀混合，进行离心，样品在

34、不同的密度中行进分配，达到分离的目的。 当离心完毕以后，为了将样品区带分开，必须从离心管中取出溶液。取出的方法有很多 种。 1. 虹吸法：用一根细管插到离心管的底部，将溶液吸出，用试管分部接收，然后进行分析。在虹吸时严防已被分离的区带被扰动。 2. 顶替法：把一种很稠的介质，如 6070%的蔗糖溶液慢慢注入离心管底部，将离心管中的溶液顶替出来。 3. 冷冻切段法：将离心好的试管进行冷冻，再切成段，就可将不同的区带分开。 4. 穿刺法：这是手工操作的简易方法，操作时先将离心管固定在支架上，在离心管底部贴一块胶布，防止穿刺后液体泄漏。用针头仔细穿过塑料离心管的底部，此时液体顺针头缓缓的逐滴流出，可

35、用试管按体积分部接收，然后进行分析。 虹吸法、顶替法、穿刺法均可参照下图。 图 收集密度梯度离心分离后各级分的方法（a）通过一针管将密度高的液体泵到梯度的底部，然后将梯度向上置换，通过一专门的盖帽导出。（b）可穿刺离心管底，使梯度滴出，将一具有合适阀门的盖帽放到离心管顶可控制替换的速度。（c）可在离心管顶装一盖帽，泵入空气或密度低的液体，通过插到离心管底部的针管将梯度替换出。三、仪器设备及操作 （一）超速离心机超速离心机有三种：制备型超速离心机，分析型超速离心机和分析兼制备的超速离心机。它们均由四个部分组成：动力和速度控制系统，即驱动系统；温度控制系统，即冷冻系统和升温系统；真空系统，即低真空

36、和高真空系统；离心腔和转头。（二）离心机转头离心机的转头有许多种，最常见的有以下四种：角转头：它是指转头的离心管腔与转轴始终保持着一定的角度。一般是20°30°。如图所示。图 垂直转头图 角转头的横剖面图，表明从旋转中心到离心管顶部，中部和底部的距离 水平转头：以活动的离心管套用鞘钉固定在主体上，静止时垂直挂在主体上。随着转头的旋转而上升，约在600转/分时可达到水平位置。即和旋转轴成90°，如图所示。此转头适用于密度梯度离心。 水平转头有3个吊篮或6个吊篮的。用6个吊篮转头时，可在一或二对吊篮就坐的情况下运转或遵厂家说明。图 水平转头区带转头：这种转头是一个空腔

37、，没有离心管。密度梯度溶液直接放在空腔内。它适用于大量的样品分离。在这种转头的空腔内一般附有叶片状装置，将内部分成4个扇形小室。这些叶片上有辐射状的导管，能使梯度溶液从中心泵入到转头外周。同时可以通过加样管，将分离好的溶液取出来。转头的负载是在转头旋转到大约3000转/分时进行的。密度较低的梯度溶液先被泵入转头，由于离心力的作用，在转头外壁的垂直方向上形成了均匀的一层。顺次泵入较密度较高的梯度液。而把较低的梯度液不断推向转头的中心。一直到加完。然后加样、离心。图 区带转头分析转头：即专门用于分析的转头，分析转头也没有离心管，而是分析小室。分析型离心机有各种转头选择，通常配有计算机控制系统，最多

38、可同时进行20多个样品在不同环境中的分析工作，常用紫外/可见光（190800nm）干涉光分析检测。 各种离心管和样品腔的大小、形伏，均有许多种规恪。根椐转速、样品量、分离分析目的、分离方法等，可选用不同的转头。特别要注意的是，每一个转头都有一定的使用限度。在转头上标有20000rpm、18000rpm、40000rpm、60000rpm、80000rpm等字样，这就是最大的转速。在使用时，不能超过这个转速，但可以小于这个转速。同时应该特别注意，不论任何转头，只要运转次数达到 图 分析转头1000次（不论在任何转速下），或者运转时间（在最大转速下）达到1000小时，或者新的转头放置5年没有用，如

39、果再使用时，都应降低10%的速度使用（即九折使用）。例如，有一个转头，标明最大转速为 50000rpm，在上述情况下再使用时，必须降速，即：50000rpm´0.9=45000rpm。 如果降低10%转速又使用了1000次或1000小时后，再降低 10%，即：45000rpm´0.9=40500rpm。因此，每个较头都必须建立档案，记录下每次使用的时间。上述情况是指转头完好，末发生任何锈蚀现象，否则不能使用。（三）离心管用于超速离心机转头的离心管，分为塑料管和不锈钢管两类。塑料离心管常用的有：聚乙烯管（PE），纤维素管（CAB），聚碳酸酯管（PC）和丙二醇酯管（PP）等。它

40、们都有各自的物理特性和化学特性，要根据不同的情况来选用。利用塑料离心管时，切记应将样品充满离心管。特别是当最大离心力超过 200000g时。如果离心管未被样品充满，管内外因承受压力不均，会使管子变形。显著变形的离心管严格禁止使用，否则会因离心管破裂，造成转头不平衡而产生严重事故。千万不可疏忽大意！不锈钢离心管是用优质合金制成的，它能抗热、抗化学腐蚀，又能蒸、煮、高压消毒，因此，几乎所有样品均能使用。一般不锈钢管是配对的，上有编号，二者重量相差不会超过0.1g。（四）离心管帽超速离心机所用离心管，一般附有管帽，离心时，离心管必须装上管帽防止样品漏出。管帽由6部分组成，即：齿冠、衬垫圈、荷重环、管

41、帽、管帽螺母、管帽螺钉等。装管帽时，一般在管帽装配台上进行。如图所示。管帽安装时先把衬垫圈套在齿冠心柱上，再套上重环。然后将齿冠、垫圈、荷重环一并放入离心管内。这时一定要十分仔细地观察衬垫圈是否平整，荷重环边缘与齿冠边缘是否吻合，是否放进离心管内。然后套上管帽和管帽螺母。切忌在拧管帽螺母时使衬垫圈因压力而突出心柱边缘，或使荷重环偏向心柱一侧，造成离心管和管帽连接不严，使样品泄漏，酿成事故。 将装好样品、盖好管帽的离心管插入装配台洞穴中，用装配台专用手柄固定离心管，再用专用扳手将管帽螺母拧紧，使管帽和管完全连接在一起。将两支装好的离心管放在天平上平衡，两支管的重量差不得超过 0.03g，如不平衡

42、，样品可用注射器从管帽中心孔增减。平衡后再拧紧管帽螺钉。然后检查管子是否封好，有无样品漏出。无误，将装好的管子再次用天平检查，两管确证平衡后，对称放入转头中，进行离心。 （五）专用天平 用来平衡离心管。除了区带转头不需平衡外，其他均需平衡。这是离心技术中不可缺少的步骤。使用角转头，平衡好的两个离心管必须对放。当用三吊篮水平转头时，所有三支离心管的平衡都必须在0.1g以内。如用六吊篮水平转头时，平衡好的一对一对离心管也必须对放。但某些六吊篮转头，可在一或二对吊篮就坐的情况下运转。 （六）密度梯度混合器使用方法见前述。四、各种离心机的应用 （一）普通离心机这种离心机最简单、经济。转速在每分钟300

43、0转左右其最大转速在8000r/min以内，相对离心力（RCF）在1´104g以下。普通离心机又称低速离心机。常用于快速收集能迅速沉降的少数物质，主要用于分离细胞、细胞碎片及培养基残渣等固形物和粗结晶等较大颗粒，如红血球、粗的沉淀物和酵母细胞等。低速离心机的分离形式、操作方式和结构特点多种多样。可根据需要选择使用。 （二）高速离心机高速离心机的转速为1´1042.5´104r/min。相对离心力达1´1041´105g，为了防止高速离心过程中温度升高而使酶等生物分子变性失活，有些高速离心机设有冷冻装置，称高速冷冻离心机。常用于制备。在一般的生化

44、实验室都配有这种离心机。在离心机中装有大小不同的转头和离心管，可以适用于不同的制备量。这种离心机主要用于分离各种沉淀物、细胞碎片和较大的细胞器等。 （三）超速离心机超速离心机既可用于分析，也可用于制备。最高转速为每分钟130000rpm/min，离心力最高可达到1019000g。超速成离心机的精密度相当高。为了防止样品液溅出，一般附有离心管帽；为防止温度升高，均有冷冻装置和温度控制系统；为了减少空气阻力和磨擦，设置有真空系统。此外有一系列安全保护系统、制动系统及计算机控制系统。超速离心机在生物化学和分子生物学研究中的应用十分广泛。例如亚细胞器及生物大分子的分离制备，生物大分子的沉降特征性结构，

45、分子量的测定，对分子纯度的估价以及检测大分子中构象的变化等等。 （四）分析用超速离心机分析用超速离心机用于样品纯度检测时，是在一定的转速下离心一段时间以后，用光学仪器测出各种颗粒在离心管中的分布情况，通过紫外吸收率或折光率等判断其纯度。若只有一个吸收峰或只显示一个折光率，表明样品中只含一种组分，样品纯度很高。若有杂质存在，则显示含有两种或多种组分的图谱。分析用超速离心机可用于测定：（1）确定高分子化合物的沉降系数。（2）绝对分子量或相对分子量的测定。（3）样品纯度、密度的测定。（4）分子的形状大小、浮力密度的确定。（5）高分子的聚合和解离。（6）热动力学和流体力学系数的确定。（7）分子间的相互

46、作用。（8）蛋白的四级结构的确定。（五）离心条件的确定离心分离的效果好还与诸多因素有关。除了上述的离心机种类、离心方法、离心介质及密度、确定离心机的转速等条件外，还有离心时间和离心介质溶液的pH值和温度等条件。1. 离心时间离心时间的概念，依据离心方法的不同而有所差别。对于差速离心来说，是指某种颗粒完全沉降到离心管底的时间。对等密度梯度离心而言，离心时间是指颗粒完全到达等密度点的平衡时间；而密度梯度离心的时间则是指形成界限分明的区带的时间。密度梯度离心和等密度梯度离心所需的区带形成时间或平衡时间，影响因素很复杂，可通过试验来确定。差速成离心所需的沉降时间可通过计算求得。颗粒的沉降时间是指里颗粒

47、从离心样品液液面完全沉降到离心管底所需的时间，又称澄清时间。沉降时间决定于颗粒沉降速度和沉降距离。对于已知沉降系数的颗粒，其沉降时间可由下列公式计算：t = 1/S ( lnr2 - lnr1 / w2 )式中：t：沉降时间（s）；S：颗粒的沉降系数（1´1013S）；w ：转子角速度（rad/s）；为r1 、 r2 ：分别为旋转轴中心到样品液液面和离心管底的距离（cm）。上式中括号部他对特定转子为一常数，秒转子效率因子或K值。即r1 、 r2 ：分别为旋转轴中心到样品液液面和离心管底的距离（cm）。上式中括号部分对特定转子为一常数，称转子效率因子或K值。即K= lnr2 - lnr

48、1 / w2 = St转子的效率因子K 与转子的半径和转速有关。生产厂家已在转子出厂进标出了最大转时的K值，由此可以根据w21K1=w22K2算出其他转速成时的K值。对于具有某一沉降系数S的颗粒来说，K 值越小，其沉降时音越短，转子的使用效率就越高。在离心机及其转子选定后，r1、 r2 不变。对于某种物质颗粒（S确定）的沉降起决定作用的是转子的转速w 以及沉降时间t。操作时可采用较低的转速。离心较长的时间；或可采用较高的转速，离心较短的时间，而得到相同的w2t。例如：用10000r/min离心10min，计算得w2t =（2pn/60）2 t =6.5785´108（S -1）；如果

49、用5000r/min的转速离心40min，w2t 值为6.5766´108（S -1）；两者基本相等。对于不知其沉降系数的球形颗粒，可按下式估算其沉降时间：式中 T：沉降时间（S）；m ：介质溶液的粘度g/(cm×s)；r ，r0：分别为颗粒和介质溶液密度（g/cm3）；d ：颗粒平均直径（cm）；r1、 r2：分别为旋转轴中心到离心管底和液面的距离（cm）。2. 温度和pH值为了防止欲分离物质的凝集、变性和失活，除了在离心介质的选择方面加以注意外，还必须控制好温度及介质溶液的pH值等离心条件。离心温度一般控制在4°C左右，对于某些热稳定性较好的酶等，离心也可在室

50、温下进行。但在超速或高速离心时，转子高速旋转会发热从而引起温度升高。故必须使用冷冻系统，使温度保持在一定范围内。离心介质溶液的pH值应该是处于酶稳定的pH范围。实验一 细胞器的分离及其标志酶的测定细胞是机体的结构和功能单位。在完整的细胞中，催化代谢的酶分布在不同的亚细胞结构中，因此，各亚细胞结构对整个细胞代谢发挥着不同的作用。由于离心技术的发展，亚细胞结构得到分离和鉴别，再通过亚细胞结构中的标志酶测定，可初步获得上述知识。本实验以小白鼠肝脏为材料，经匀浆离心分离细胞器，鉴定细胞器以及各细胞器中的标志酶，如DNA、RNA，含量及纯度，线粒体的活性，溶酶体的标志酶酸性磷酸酶，微粒体的标志酶葡萄糖-

51、6-磷酸酶，胞浆的标志酶乳酸脱氢酶等。 （一）细胞器的分离 原理 细胞破碎后，亚细胞成分悬浮在介质中，根据各细胞器的大小，沉降系数的不同应用强大的离心力使各亚细胞成分分离、浓缩、纯化。即选择不同的离心速度，在一定的离心时间内，让大小不同的颗粒分批沉降在离心管底部。然后收集，得到各种细胞器。 仪器、材料及试剂 仪器：匀浆器、解剖器、高速冷冻离心机、超速冷冻离心机、显微镜。 材料：体重20g左右健康小白鼠2只。试剂：细胞提取液试剂pH0.25 m mol/L Tris调pH=7.4（新鲜配制）0.5 m mol/L EDTA0.25 mol/L蔗糖l m mol/L MgCl·6H2O

52、操作步骤 l. 细胞破碎：小白鼠脱颈椎处死后，迅速剖腹取出肝脏，用冰冷的细胞提取液洗3次，滤纸吸干，称重，放冰冷小烧杯内，用手术剪剪成小块状，用提取液洗两次，至无色或浅粉色，再剪成浆状，转入匀浆器中，加提取液2mL匀浆。 用显微镜检查细胞是否破碎，待完全（95%）破碎，则再加细胞提取液l0mL制成肝匀浆。 取出肝匀浆0.1mL，稀释100倍，测蛋白质含最。2. 细胞器的分离：将肝匀浆转入30mL离心管中，用冷冻离心机，按以下程序进行分级分离，分别收集所得到的细胞器。 鉴定各细胞器 测定 DNA、RNA含量，鉴定核的纯度；用氧电极法测定氧化磷酸化效率，鉴定线粒体活性；酸性磷酸酶是溶酶体的标志酶；

53、葡萄糖-6-磷酸酶是微粒体的标志酶；乳酸脱氢酶是胞浆的标志酶。 （二）核中核酸的分离和鉴定原理 由于核糖和脱氧核糖有特殊的颜色反应，经显色后，所呈现的颜色深浅在一定范围内和样品中所含的核糖和脱氧核糖的量成正比，因此可用定糖法来定性定量测定核酸。 主要仪器及试剂 仪器：恒温水浴、离心机、电炉、烧杯。 试剂：10 m mol/LTris 缓冲液（pH=7.4），0.25 mol/L蔗糖-3 m mol/L CaCl2，95%乙醇，0.5 mol/L TCA，0.3 mol/L PCA。 二苯胺试剂（鲜配制）：将1.5g二苯胺溶于100mL冰醋酸中，再加1.5mL优级浓H2SO4。 苔黑酚试剂：将0

54、.5g苔黑酚溶于 100mL 0.1% FeCl3的浓 HCl中。 标准RNA溶液（40mg/mL），标准DNA溶液（0.l5mg/mL）。 操作步骤 1. 核酸的分离。 （1）取核沉淀I，加入 l0mL 10 m moI/L Tris-HCl。搅拌均匀，混悬液700g离心10分钟，将沉淀再混悬于10mL 10 m mol/L Tris-HCl中，700g离心l0分钟，得到无红血球的核沉淀。 （2）该沉淀中加入 10 ml 0.25 m mol/L蔗糖-3 m mol/L CaCl2溶液，悬液置两（或单）层纱布中过滤于离心管中，1500g离心10分钟，将沉淀再混悬于 l0 mL 0.25 mo

55、l/L蔗糖-3m mol/L CaCl2中，混匀，取出l mL，其余的离心，1500g 10分钟。收集沉淀，按以下程序提取DNA和RNA。（4）留核酸提取液测定DNA、RNA含量。 2. RNA、DNA的定量测定。 （1）RNA标准曲线的制作：取7支试管，其中一管为空白管（加2mL蒸馏水，苔黑酚2mL）作对照。其余的依次加入40mg/mL的RNA标准液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2mL，然后分别向6支试管中加入蒸馏水，使最终体积为 2mL，再向各管加入2mL苔黑酚显色剂。混匀后，置沸水浴中显色15分钟，用紫外分光光度计在640nm处测定光吸收值，以空白管为对照，以光吸收值为纵坐际，

56、以RNA的微克数为横坐标，绘制标准曲线。 （2）DNA标准曲线的制作：取7支试管，其中一管是空白管（加蒸馏水2mL，二苯胺2mL）作对照。其余6管依次加入 0.l5mg/mL的标准DNA浓0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0mL，然后分别向6支试管加入蒸馏水，使最终体积为 2.0mL，再向各管加入二苯胺2mL，混匀后，置于沸水浴中显色15分钟，用分光光度计在600nm处测光吸收值，以空白为对照，以光吸收值为纵坐标，以DNA的毫克数为横坐标，绘制标准曲线。 （3）核中 RNA、DNA含量的测定。 ¹ RNA含量的测定：取两支试管，一支加入样品液2mL和苔黑酚试剂2mL，另一支试管加入蒸馏水2mL和显色剂苔黑酚试剂2m1（为对照管），混匀后，置沸水浴中显色15分钟，用分光光度计在640n